肌醇用于增强菌株耐受性的用途、基因的用途、表达载体及其用途、菌株及其用途

摘要

本发明涉及生物技术领域，特别涉及肌醇增强菌株对复合抑制剂耐受性的应用、基因的用途、表达载体及其用途、菌株及其用途。提高了菌株对复合抑制剂糠醛、乙酸和苯酚的耐受性。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及肌醇增强菌株对复合抑制剂耐受性的应用、基因的用途、表达载体及其用途、菌株及其用途。

背景技术

近年来，石油等能源问题产生的国际冲突日益加剧，逐渐成为困扰世界各国经济和社会发展的重大问题。为应对日益严重的能源危机，摆脱对进口石油的严重依赖，开发新的可代替能源成为各国学者关注的热点，以可再生的，大量存在的，价格低廉的木质纤维素如农作物秸秆为原料生产燃料乙醇是其中最为重要的方向之一。

纤维素乙醇的生产工艺主要包括以下四个操作单元：预处理，酶解，发酵和分离。在木质纤维素原料的预处理过程中，广泛应用的一些化学预处理方法通常在高温高压的条件下进行，会导致一系列对微生物细胞有毒性作用的副产物的产生，如呋喃类、弱酸类、酚类等，糠醛，乙酸和苯酚是三类抑制剂的典型代表。这些抑制剂对发酵微生物的生长，生物量，糖耗速率和乙醇得率具有明显抑制作用。

作为乙醇生产的传统菌株—酿酒酵母，具有底物利用高效性，产物专一性和稳健性等优点，然而天然的酿酒酵母菌株由于较低的耐受性，无法抵抗预处理过程中产生的大量抑制剂，从而影响发酵效率，限制了纤维素乙醇的工业化生产。传统的脱毒步骤能增加操作成本，降低纤维素乙醇的价格竞争优势，因此提高酵母菌株的耐受性，尤其对三类复合抑制剂的耐受性，从而实现原位脱毒在纤维素乙醇研究领域具有重要的意义。

目前文献已报到的耐受菌株大都针对某一个单一的抑制剂，已报道的可直接调控菌株对抑制剂耐受性的靶基因较少，尤其是对复合抑制剂耐受相关的基因几乎没有报道，给后续的菌株分子改造造成了限制，成为纤维素乙醇工业化发展的一个瓶颈。

发明内容

有鉴于此，本发明提供肌醇增强菌株对复合抑制剂耐受性的应用、基因的用途、表达载体及其用途、菌株及其用途。提高了菌株对复合抑制剂糠醛、乙酸和苯酚的耐受性。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了肌醇用于增强菌株对抑制剂耐受性的用途。

在本发明的一些实施例中，所述抑制剂为呋喃及其衍生物、弱酸和/或酚。作为优选，所述抑制剂为糠醛、乙酸和/或苯酚。

在本发明的一些实施例中，所述菌株为酵母。

在本发明的一些实施例中，所述菌株为酿酒酵母。

本发明还提供了肌醇合成路径相关基因的过表达在增强菌株对抑制剂耐受性的用途；所述肌醇合成路径相关基因具有如下序列：

(Ⅰ)肌醇合成路径的基因的核苷酸序列；

(Ⅱ)与肌醇合成路径的基因的核苷酸序列具有至少70％同源性的序列。

在本发明的一些实施例中，肌醇合成路径的基因可以为INO1或INM2。

在本发明的一些实施例中，所述抑制剂为呋喃及其衍生物、弱酸和/或酚。作为优选，所述抑制剂为糠醛、乙酸和/或苯酚。

在本发明的一些实施例中，所述菌株为酵母。

在本发明的一些实施例中，所述菌株为酿酒酵母。

本发明还提供了一种重组表达载体，其包括肌醇合成路径相关基因；

所述肌醇合成路径相关基因具有如下序列：

(Ⅰ)肌醇合成路径的基因的核苷酸序列；

(Ⅱ)与肌醇合成路径的基因的核苷酸序列具有至少70％同源性的序列。

在本发明的一些实施例中，肌醇合成路径的基因可以为INO1或INM2。

在本发明的一些实施例中，在所述重组表达载体中，所述肌醇合成路径相关基因过表达。在本发明的一些实施例中，肌醇合成路径的基因可以为INO1或INM2。

本发明还提供了上述重组表达载体在增强菌株对抑制剂耐受性的用途。

在本发明的一些实施例中，所述抑制剂为呋喃及其衍生物、弱酸和/或酚。作为优选，所述抑制剂为糠醛、乙酸和/或苯酚。

本发明还提供了上述重组表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

扩增获得启动子；

扩增获得终止子；

将所述启动子和所述终止子插入载体中，获得第一载体；

扩增获得所述肌醇合成路径相关基因；

将所述肌醇合成路径相关基因插入到所述第一载体的所述启动子和所述终止子之间，即得。

在本发明的一些实施例中，肌醇合成路径的基因可以为INO1或INM2。

具体的，重组表达载体为重组质粒，构建方法为：

以酿酒酵母S288C的基因组为模版，以表1中的HXT7p_F为上引，HXT7p_R为下引，扩增启动子HXT7p；以下表中的TEF1t_F为上引，TEF1t_R为下引，扩增终止子TEF1t。

紧接着利用酶切连接的方法，将启动子HXT7p和终止子TEF1t插入游离质粒pRS426中。之后以INO1_F为上引，INO1_R为下引，为BY4742基因组为模版，扩增基因INO1，之后酶切连接插入到启动子HXT7p和终止子TEF1t中间，得到质粒pRS426-HXT7p-INO1-TEF1t。

本发明还提供了一种菌株，包含上述重组表达载体。

在本发明的一些实施例中，所述菌株的生物保藏编号为CGMCCNo.9788。

本发明还提供了上述菌株在发酵生产乙醇中的应用。

本发明提供了肌醇用于增强菌株对抑制剂耐受性的用途。本发明利用系统生物学的手段揭示耐受机制，寻找和细胞耐受密切相关的目标因子，进而利用基因工程和分子生物学等手段人工构建菌株从而提高菌株对复合抑制剂糠醛、乙酸和苯酚的耐受性。

生物保藏说明

菌株SyBESc0150021：分类命名：酿酒酵母Saccharomycescerevisiae于2014年10月17日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏中心地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.9788。

附图说明

图1示肌醇合成路径相关基因对菌株复合抑制剂耐受性的影响；其中图1A示酿酒酵母细胞中的肌醇合成路径；图1B示酿酒酵母BY4742肌醇合成路径中基因INO1的敲除对菌株复合抑制剂耐受性的影响；图1C示酿酒酵母BY4742肌醇合成路径中基因INM2的敲除对菌株复合抑制剂耐受性的影响；图1D示在酿酒酵母BY4742中过表达INO1对细胞复合抑制剂耐受性的影响；图1E示在酿酒酵母BY4742中过表达INO1对细胞内肌醇含量的影响；

图2示pRS426-HXT7p-INO1-TEF1t质粒谱图。

具体实施方式

本发明公开了肌醇增强菌株对复合抑制剂耐受性的应用、基因的用途、表达载体及其用途、菌株及其用途。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的肌醇增强菌株对复合抑制剂耐受性的应用、基因的用途、表达载体及其用途、菌株及其用途中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1肌醇合成相关基因的敲除和过表达调控菌株对复合抑制剂的耐受性

(1)培养基的配制

种子液体培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，121℃灭菌20min。

种子固体培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，酵母粉20g/L，121℃灭菌20min。

SC-Ura液体培养基：葡萄糖20g/L，YNB6.7g/L，氨基酸缺省混合物2g/L，20mg/L组氨酸，20mg/L亮氨酸，20mg/L色氨酸，115℃灭菌15min。

SC-Ura固体培养基：葡萄糖20g/L，YNB6.7g/L，氨基酸缺省混合物2g/L，20mg/L组氨酸，20mg/L亮氨酸，20mg/L色氨酸，20g/L琼脂粉，115℃灭菌15min。

发酵培养基1：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，121℃灭菌20min，在接种前加入纤维素水解液抑制剂糠醛、苯酚和乙酸，使得糠醛的含量为1.04g/L，乙酸的含量为4.24g/L，苯酚的含量为0.4g/L。

发酵培养基2：SC-Ura液体培养基，在接种前加入纤维素水解液抑制剂糠醛、苯酚和乙酸，使得糠醛的含量为0.78g/L，乙酸的含量为3.18g/L，苯酚的含量为0.3g/L。

(2)质粒构建与酵母转化

以酿酒酵母S288C的基因组为模版，以表1中的HXT7p_F为上引，HXT7p_R为下引，扩增启动子HXT7p；以下表中的TEF1t_F为上引，TEF1t_R为下引，扩增终止子TEF1t。

紧接着利用酶切连接的方法，将启动子HXT7p和终止子TEF1t插入游离质粒pRS426中。之后以INO1_F为上引，INO1_R为下引，为BY4742基因组为模版，扩增基因INO1，之后酶切连接插入到启动子HXT7p和终止子TEF1t中间，得到质粒pRS426-HXT7p-INO1-TEF1t，质粒谱图如图2所示，序列如SEQIDNo.7所示。

具体的，pRS426-HXT7p-INO1-TEF1t质粒构建：

以酿酒酵母S288C的基因组为模版，以HXT7p_F为上引，HXT7p_R为下引扩增得到启动子片段HXT7p。以TEF1t_F为上引，TEF1t_R为下引，扩增得到终止子片段TEF1t。以INO1_F为上引，INO1_R为下引，为BY4742基因组为模版，扩增得到基因片段PRO1。PCR扩增体系为100μL：30μLddH₂O，20μL5*Buffer，1μLDNA聚合酶，2.5μL10mMdNTP，4μL基因组模板，4μL上游引物，4μL下游引物。PCR反应条件为：95℃5min进行1轮；95℃30s，50-60℃退火30s，72℃延伸30-60s，进行30轮；72℃延伸10min进行1轮。柱回收PCR产物，50μL洗脱液溶解DNA样品。

之后利用酶BamHI和EcoRI酶切片段HXT7p和质粒pRS426,酶EcoRI和SalI酶切片段INO1，SalI和XhoI酶切片段TEF1t。利用连接体系1将片段HXT7p连入质粒pRS426，形成质粒pRS426-HXT7p。酶EcoRI和XhoI酶切质粒pRS426-HXT7p，利用连接体系2将片段INO1和TEF1t同时连入质粒pRS426-HXT7p中，得到质粒pRS426-HXT7p-INO1-TEF1t。酶切反应体系50μL：45μLDNA片段，5μL10×Buffer,2.5μL酶1，2.5μL酶2；37℃酶切反应1-2h，之后柱回收酶切产物，40μL洗脱液溶解DNA片段。连接体系1为10μL：HXT7p片段7μL，载体1.5μL，10*Buffer1μL，连接酶1μL。连接体系2为10μL：INO1片段4μL，TEF1t片段3μL，载体1.5μL，10*Buffer1μL，连接酶1μL。反应条件：22℃30min。每次的连接产物都需转化大肠杆菌感受态细胞，过夜培养，获得平板转化子，利用M13F与M13R这两个引物进行菌落PCR，筛选阳性转化子。将阳性转化子接到LB-Amp液体培养基中，培养12小时，保存一份菌液，取少量样品送交公司进行DNA测序，将测序正确的质粒用于酵母转化。

酵母菌株BY4742/pRS426,BY4742/INO1构建：

将质粒pRS426,pRS426-HXT7p-INO1-TEF1t转化酵母菌株BY4742。

酵母转化采用传统的醋酸锂法：菌株BY4742在液体YPD培养基中30℃培养过夜，以初始OD₆₀₀＝0.1接种于5mL液体YPD中培养5～7h，1.5mL离心管5000rpm收集细胞，水洗一遍，离心弃水，之后向细胞中加入1mL0.1mol/L的LiAc离心弃废液，重复两遍，第二次尽量吸除LiAc，向残余细胞中分别加入40μL水、10μL质粒DNA、240mLPEG(50％m/V)、36μL1.0mol/LLiAc、25mLssDNA，剧烈震荡直至细胞完全混匀，30℃培养箱保温30min，42℃水浴中热激25min，4000rpm离心2min，弃上清，加入1mL无菌水，用小枪吹匀细胞，后4000rpm离心2min，弃上清，将细胞在无菌水中悬浮涂在SC-Ura平板上，30℃培养箱上培养。

酵母转化子在SC-Ura培养基上筛选。

表1引物序列

(3)缺陷菌株发酵

将菌株BY4742，和基因缺失菌株BY4742-11272(INO1Δ)，BY4742-13646(INM2Δ)在含有200μg/mL的种子固体培养基上活化，后挑去单菌落接种于5mL的种子液体培养基中，在30℃、150rpm培养12h。将一级种子接种于100mL种子液体培养基中，在30℃、150rpm培养10h。然后以OD₆₀₀＝0.1的初始菌体浓度接种于100mL发酵培养基中，于30℃、150rpm条件下培养，测定培养过程中菌体的生长曲线。

如图1A所示为酿酒酵母细胞中肌醇的合成路径。如图1B所示，在含有抑制剂的培养条件下，原始菌BY4742在34h左右生长进入稳定期，而此时单敲菌INO1Δ仍处在延滞期。如图1C所示，和原始菌株相比，基因INM2的敲除也明显降低了菌株的生长速率，INM2Δ约在46h才完成发酵。该结果表明氨酸合成路径中相关基因INO1，INM2的敲除都明显降低了菌株对复合抑制剂的耐受性，证实了肌醇在调控菌株对复合抑制剂耐受性的关键作用(4)过表达菌株发酵

将菌株BY4742/pRS426，BY4742/INO1在含有SC-Ura固体培养基上活化，后挑去单菌落接种于5mL的SC-Ura液体培养基中，在30℃、150rpm培养12h。将一级种子接种于100mL种子液体培养基中，在30℃、150rpm培养16h。然后以OD₆₀₀＝0.2的初始菌体浓度接种于100mL发酵培养基中，于30℃、150rpm条件下培养，测定培养过程中菌体的生长曲线，并测定延滞期两个菌株胞内的肌醇含量。

如图1E所示，过表达INO1能显著增强肌醇的合成。对原始菌和改造的菌株进行发酵，如图1D显示，在抑制剂培养条件下，菌株BY4742/INO1在大约40h过生长进入稳定期，而此时原始菌还于延滞期，过表达肌醇合成路径的基因INO1能明显加快菌株在抑制剂条件下的生长速率，增强酵母菌株对复合抑制剂的耐受性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。