可用于诊断间日疟和/或恶性疟的试剂盒

摘要

本发明涉及可用于诊断间日疟和/或恶性疟的试剂盒。本发明的试剂盒包括一个或多个固体载体，以及独立地连接于所述一个或多个固体载体上的特定多肽集合。

说明书

技术领域

本发明主要涉及试剂盒。具体而言，本发明涉及可用于检测间日疟原虫感染和/或恶性疟原虫感染的试剂盒。

背景技术

疟疾仍然是全球公共卫生的紧要问题，每年死亡达0.7－2.7百万，其中75%以上为非洲儿童。在过去的35年，疟疾的发病率增长了2－3倍。在1955年，世界卫生组织（WHO）开始了一项通过应用氯喹进行临床治疗和应用DDT（二氯二苯三氯乙烷）控制蚊群而根除疟疾的宏大计划。在20世纪60年代后期逐步停止，这项计划虽然在全世界许多国家引起重要且持续的疾病负担减轻。然而，在许多国家疟疾仍有复发，其主要是由于耐药寄生虫的出现和传播导致的。耐杀虫剂蚊子的出现，人口密度的增加（自1963年，世界人口已经翻了一番），全球变暖（这种带菌者扩散至以前没有到达的范围），持续贫穷，政治动荡，以及由于传染性疾病导致的生产力的损失，所有的这些因素破坏了治疗和控制疟疾的稳定的公共卫生基础的维持。

疟疾寄生虫属于疟原虫属，能后感染许多脊椎动物宿主，包括多种非人类灵长类物种。四种疟原虫属寄生于人类：恶性疟原虫（Plasmodium.fal-

ciparum）、三日疟原虫（P.malariae）、卵形疟原虫（P.ovale）和间日疟原虫（P.vivax）。其中，恶性疟原虫和间日疟原虫分别与大部分疟疾的发病率和死亡率相关。

由于疟疾治疗药物的特殊性，精确快速的诊断不仅能及时发现并治疗疟疾患者，大大降低病死率，也能通过早期排除疟疾，及时挽救感染了其它传染性疾病患者的生命。以此同时，精确快速的早期诊断也是对疟疾实时流行病监测和控制的必要手段。到目前为止，对可疑病人采血制作厚薄血片经染色后显微镜检查法（简称镜检法）一直被认为是疟疾诊断的“金标准”，其优点是费用低，能鉴定疟原虫虫种，但是也存在着缺陷，即需要非常专业的检验人员，当原虫密度较低时，可出现假阴性，引起误诊或漏诊，同时还需要显微镜、染色液等一些辅助设备。随着临床机构，特别是一些现代化程度高的医院，由于检验人员更依赖仪器设备，对镜检能力的掌握明显下降；而在一些欠发达地区，由于种种原因，未能配备镜检相关的设备和试剂。这些因素限制了临床对疟疾快速有效的诊断。因此，研究新的疟疾快速诊断方法成为目前研究的热点。

发明内容

本发明的目的在于提供新的用于诊断疟疾,特别是可用于诊断间日疟、恶性疟或混合疟，或者用于区分间日疟、恶性疟与混合疟的试剂盒。

本发明人提供了5条多肽。在以受试者来源的生物样本是否对所述5条多肽中的至少两条或两条以上有响应作为判定受试者是否已被疟原虫感染的指标的情况下，可以以高达98%的灵敏度(且假阳性率低至1.0%)诊断疟疾。

此外，本发明人还发现，通过将上述5条多肽与其他2条多肽的组合作为检测分子，不仅能够诊断疟疾,还能进一步诊断间日疟、恶性疟或混合疟，或者用于区分间日疟、恶性疟与混合疟。

因此，本发明包括：

1.一种试剂盒，其包括一个或多个固体载体，以及独立地连接于所述一个或多个固体载体上的下述多肽集合1：

SEQIDNO：1所示的多肽；

SEQIDNO：2所示的多肽；

SEQIDNO：3所示的多肽；

SEQIDNO：4所示的多肽；和

SEQIDNO：5所示的多肽。

2.根据项1所述的试剂盒，其用于诊断疟疾。

3.根据项1或2所述的试剂盒，其中，所述多肽集合1还包括下述多肽集合2：

SEQIDNO：6所示的多肽；和

SEQIDNO：7所示的多肽。

4.根据项3所述的试剂盒，其用于诊断间日疟、恶性疟或混合疟，或者用于区分间日疟、恶性疟与混合疟。

5.根据项1~4中任一项所述的试剂盒，其中，全部多肽独立地连接于同一固体载体上。

6.下述多肽集合1在制备用于诊断疟疾的试剂盒中的用途：

多肽集合1

SEQIDNO：1所示的多肽；

SEQIDNO：2所示的多肽；

SEQIDNO：3所示的多肽；

SEQIDNO：4所示的多肽；和

SEQIDNO：5所示的多肽。

7.根据项6所述的用途，其中，所述诊断疟疾还包括诊断间日疟、恶性疟或混合疟，或者用于区分间日疟、恶性疟与混合疟，且所述多肽集合1还包括下述多肽集合2：

SEQIDNO：6所示的多肽；和

SEQIDNO：7所示的多肽。

发明的具体实施方式

多肽集合和多肽组

本说明书中，多肽集合1是下述多肽组1~5的全部：

多肽组1：SEQIDNO：1所示的多肽；

多肽组2：SEQIDNO：2所示的多肽；

多肽组3：SEQIDNO：3所示的多肽；

多肽组4：SEQIDNO：4所示的多肽；以及

多肽组5：SEQIDNO：5所示的多肽。

本说明书中，灵敏度是指：用“金标准”方法确认的阳性样本中，被其他方法测定为阳性样本的比例。假阳性率是指：用“金标准”方法确认的阴性样本中，被其他方法测定为阳性样本的比例。本技术领域检测间日疟原虫感染或恶性疟原虫感染的“金标准”方法是镜检法。

本说明书中，“疟疾”是指恶性疟和/或间日疟。恶性疟是指因恶性疟原虫感染而引起的疟疾，间日疟是指因间日疟原虫感染而引起的疟疾，混合疟是指因恶性疟原虫和间日疟原虫感染（也称混合感染）而引起的疟疾。

优选地，多肽集合1是在所述多肽组1~5的全部的基础上再加上下述多肽组6~7：

多肽组6：SEQIDNO：6所示的多肽；以及

多肽组7：SEQIDNO：7所示的多肽。

如实施例所示，所述多肽集合1对恶性疟原虫和/或疟原虫感染者的血清呈阳性反应，而对健康正常人或非恶性疟原虫和/或间日疟原虫感染者的血清呈阴性反应，因此，所述多肽集合1作为疟原虫感染的检测工具是有用的。

本说明书中，阳性反应是指：满足下述“诊断方法”部分中所列的判据；否则为阴性反应。

所述多肽可以适宜采用(1)化学合成方法、或(2)酶反应合成方法等公知方法来获得，其中化学合成更为简便。在化学合成本发明的多肽情况下，通过使用肽合成仪合成或者半合成该多肽来进行。作为化学合成方法，可以列举出例如肽固相合成法等。这样合成的肽可以采用常规手段例如离子交换色谱、反相高效液体色谱、亲和色谱等进行纯化。这样的肽固相合成方法以及其后的肽纯化都是本技术领域公知的。

此外，在通过酶反应生产本发明的多肽的情况下，可以采用例如国际公开小册子WO2004/011653号所述的方法。即，可以这样来生产：将一方的氨基酸或二肽的羧基末端被酯化或酰胺化而得到的氨基酸或二肽、与氨基酸处于游离状态的氨基酸(例如羧基保护的氨基酸)在肽合成酶的存在下进行反应，生成的二肽或三肽。作为肽合成酶，可以列举出：具有生成肽的能力的微生物的培养物、由该培养物分离的微生物菌体、或该微生物的菌体处理物、或该微生物来源的肽合成酶。

特别是多肽的化学合成已经实现了商业化，可以容易地委托专业的多肽合成公司来合成所述多肽。

试剂盒

本发明提供一种试剂盒（本发明的试剂盒），其包括

一个或多个固体载体，以及独立地连接于所述一个或多个固体载体上的上述多肽集合1。

本发明的试剂盒可用于诊断疟疾。这里，“诊断”可以是确诊，也可以是为确诊提供参考信息。

在所述多肽集合1为上述多肽组1~7的全部的情况下，本发明的试剂盒可用于诊断间日疟、恶性疟或混合疟，或者用于区分间日疟、恶性疟与混合疟。

因此，所述多肽集合1可以用于制备用于诊断疟疾的试剂盒。在所述多肽集合1为上述多肽组1~7的全部的情况下，所述多肽集合1可以用于制备用于诊断间日疟、恶性疟或混合疟，或者用于区分间日疟、恶性疟与混合疟试剂盒。

该试剂盒中的固体载体可以是一个，也可以是多个，但优选为一个，即全部多肽独立地连接于同一固体载体上。

在本发明中，对固体载体没有特殊限制，只要是作为固体或不溶性材料(例如是可以通过过滤、沉淀、磁性分离等从反应混合物中分离的材料)的载体即可。

构成固体载体的材料包括但不限于：硅胶（聚二甲基硅氧烷，PDMS）、纤维素、特氟隆^TM、硝基纤维素、琼脂糖、葡聚糖、壳聚糖、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚酯、聚碳酸酯、聚酰胺、聚丙烯、尼龙、聚偏二氟乙烯、胶乳、二氧化硅、玻璃、玻璃纤维、金、铂、银、铜、铁、不锈钢、铁氧体、硅晶片、聚乙烯、聚乙烯亚胺、聚乳酸、树脂、多糖类、蛋白(白蛋白等)、碳或它们的组合等。

固体载体的形状包括但不要限于：珠子、磁珠、薄膜、微细管、滤膜、板、微量板、碳纳米管、传感器芯片等。正如本技术领域公知的那样，薄膜或板等平坦的固体载体上可以设置凹坑、沟槽、滤膜底部等。

磁珠可以具有约25nm~约1mm范围的球体直径。在优选的实施方式中，磁珠具有约50nm~约10μm范围的直径。磁珠的尺寸可以根据特定的用途来进行选择。

由Sepharose等高交联球形琼脂糖制成的珠子具有约24μm~约165μm范围的直径。优选地，高交联球形琼脂糖珠具有约24μm~约44μm范围的直径。高交联球形琼脂糖珠的尺寸可以根据特定的用途来进行选择。

具有疏水性表面的固体载体的例子包括可从Polysciences，Warrington，PA或Spherotech，Liberville，IL购买的制品等聚苯乙烯胶乳珠。

二氧化硅(SiO₂)-处理或二氧化硅(SiO₂)基的固体载体的例子包括可从Polysciences，Warrington，PA购买的超常磁性二氧化硅珠等，其可以用于捕捉核酸(例如DNA)。或者，还可以使用可从DynalBiotech购买的M-280等。

具有亲水性表面的磁珠可用于捕捉增殖期的细菌细胞、核酸以及其它成分。作为该磁珠的例子，可以列举出Polysciences，Warrington，PA销售的珠子(名称：Biomag(注册商标)羧基)、或者BangsLaboratory，Inc.，Fishers，IN的名称为MC02N/2928的珠子。或者，可以使用DynalBiotech销售的M-270等。

在一个优选实施方式中，所述固体载体是SJ改性硅胶，其是苏州偲聚生物材料有限公司开发的一种硅橡胶材质的微阵列固体支撑材料(iPDMS薄膜，参见中国专利CN101265329A)。这种材料是以生物学研究常用的PDMS为基础，在其中加入特定的引发剂成分（使该材料可通过表面引发聚合反应（SIP）实现表面功能化修饰），再经过聚乙二醇甲基丙烯酸酯(poly(oligo(ethyleneglycol)methacrylate),pOEGMA)表面修饰获得的。SJ改性硅胶具有优秀的抗蛋白质非特异性吸附(Nonspecificproteinadsorption,NPA)能力，可以将复杂蛋白免疫检测中的非特异性蛋白质吸附控制到接近“绝对0”水平（接近或低于仪器的检测极限），不仅可以免除封闭和多次清洗的麻烦，还可以通过使用更强的信号扩增手段来提高蛋白质微阵列的灵敏性。而且其硅橡胶的本质赋予了该材料较强的机械性能和良好的可操作性。苏州偲聚公司已经成功地将SJ改性硅胶应用于11个肿瘤标志物组成的多指标联检微阵列ELISA试剂盒，实现了高通量和高灵敏的检测，证明了这种材料是一种优秀的蛋白质微阵列固体支撑材料。同时，这种材料还具有表面性质可调的特性，可以通过控制修饰反应时间在一定范围内调整其表面形貌。

多肽与固体载体的连接可以采用本领域技术人员公知的多肽与固体载体的连接方法来进行。例如，对于蛋白质/多肽与改性硅胶表面的连接而言，可以通过1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺[1-ethyl-3-(3-dimethylami-nopropyl)carbodiimide,EDC]和N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide,NHS)的反应将改性硅胶表面高分子链上的羧基（-COOH）基团改为活化基团，该活化基团可与蛋白/多肽上所带的氨基（-NH2）反应从而实现将蛋白/多肽固定于固体载体表面。

对于点样时使用的点样液中多肽的浓度没有特殊限制，本领域技术人员可以依常规选择，优选为1μg~1000μg/mL，更优选10μg~500μg/mL。此外，对于多肽在固体载体上分布的密度没有特殊限制，本领域技术人员可以依常规选择，优选为1~100点/10mm²，更优选5~50点/10mm²。

该试剂盒还可以包括：

1.配好的血清稀释液或血清稀释液组分溶液：血清稀释液，例如有北京赛驰生物科技有限公司的样本稀释液（产品编号070021-S2）、郑州博威嘉生物科技有限公司的加样变色样本稀释液（产品编号bwj010103）等。该血清稀释液用来稀释血清，试剂盒检测的血清要稀释适当倍数，例如2~200倍，优选10~100倍。

该试剂盒还可以包括：

2.浓缩洗液：固体载体表面孵育血清及酶标二抗后，需用洗液清洗掉固体载体表面未结合的抗体和酶标二抗。浓缩洗液例如是1%的吐温20水溶液，使用时需稀释2~40倍、优选5~20倍。

该试剂盒还可以包括：

3.酶标二抗溶液：疟原虫感染（例如疟疾）病人血清中的疟原虫特异性抗体可与固体载体（例如SJ改性硅胶）上的本发明的多肽结合，酶标二抗可与抗体结合，而酶标二抗上的标记物可与发光底物反应，从而发出可检测的光。酶标二抗可以是例如辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG。作为酶标二抗溶液，可以列举出北京中杉金桥生物技术有限公司生产的辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG(H+L)，产品编号ZB-2304。对酶标二抗在酶标二抗溶液中的浓度没有特殊限制，可以是例如1ng~1000ng/mL。

该试剂盒还可以包括：

4.发光液组分溶液：发光液可与酶标二抗上标记的辣根过氧化物酶反应，使得反应发出仪器可检测到的化学光。发光液由两种溶液混合而成，分别是A液—过氧化氢溶液，及B液—发光氨溶液。发光氨（鲁米诺）只有用氧化剂处理过才会发光。通常使用双氧水和一种氢氧化物碱的混合水溶液作为激发剂。在辣根过氧化物酶催化下，双氧水分解为氧气和水：

2H₂O₂→O₂+2H₂O

鲁米诺与氢氧化物反应时生成了一个双负离子，它可被过氧化氢分解出的氧气氧化，产物为一个有机过氧化物。该过氧化物很不稳定，立即分解出氮气，生成激发态的3-氨基邻苯二甲酸。激发态至基态转化中，释放的能量以光子的形式存在，波长位于可见光的蓝光部分。发光液组分溶液的例子例如ThermoSeientific公司的SuperSignal?ELISAFemtoMaximumSensitivitySubstrate，货号37074。

该试剂盒还可以包括：

5.一个或两个以上的反应腔体(例如中国专利授权公告CN202054829U)。

该试剂盒还可以包括：

6.其他用于定性或恶性疟原虫感染的检测分子（例如多肽、蛋白质、核酸等）。

该试剂盒还可以包括：

7.使用说明书。

该试剂盒还可以包括：

8．连接于所述一个或多个固体载体、或其他独立的固体载体上的阳性质控点（例如?人?血?桨?丙?种?球?蛋?白?(?H?-?I?g?G?)?，简称?H-IgG）和/或阴性质控点（例如磷酸缓冲液,简称PB）。

诊断方法

本发明还提供一种诊断受试者是否为疟疾患者的方法，该方法包括：

使用上述本发明的试剂盒检测SEQIDNO：1~5所示的多肽是否对受试者来源的血液样本有响应；其中，

当检测到分别来自下述多肽组1~5中的至少两个或两个以上多肽组中的至少任意两个或两个以上的多肽对所述受试者来源的血液样本有响应时（判据1），判定受试者是疟疾患者；否则，判定受试者不是疟疾患者。

在本说明书中，“响应”是指：信噪比（SNR）大于或等于2，其中，信噪比=（多肽点信号值-阴性对照点信号值）/阴性对照点信号值。

此外，在所述多肽集合1为上述多肽组1~7的全部的情况下，本发明还提供一种诊断受试者是否为恶性疟患者的方法，该方法包括：

使用上述本发明的试剂盒检测SEQIDNO：1~7所示的多肽是否对受试者来源的血液样本有响应；其中，

当检测到分别来自多肽组1~5中的至少两个或两个以上多肽组中的至少任意两个或两个以上的多肽对所述受试者来源的血液样本有响应、且未检测到来自多肽组6~7中的任何多肽对所述受试者来源的血液样本有响应时（判据2），判定受试者是恶性疟患者；否则，判定受试者不是恶性疟患者。

此外，在所述多肽集合1为上述多肽组1~7的全部的情况下，本发明还提供一种诊断受试者是否为间日疟患者的方法，该方法包括：

使用上述本发明的试剂盒检测SEQIDNO：1~7所示的多肽是否对受试者来源的血液样本有响应；其中，

当检测到分别来自多肽组1~5中的至少两个或两个以上多肽组中的至少任意两个或两个以上的多肽对所述受试者来源的血液样本有响应、且检测到分别来自多肽组6~7中的至少任意两个或两个以上的多肽对所述受试者来源的血液样本有响应时（判据3），判定受试者是间日疟患者；否则，判定受试者不是间日疟患者。

此外，在所述多肽集合1为上述多肽组1~7的全部的情况下，本发明还提供一种诊断受试者是否为混合疟患者的方法，该方法包括：

使用上述本发明的试剂盒检测SEQIDNO：1~7所示的多肽是否对受试者来源的血液样本有响应；其中，

当检测到分别来自多肽组1~5中的至少两个或两个以上多肽组中的至少任意两个或两个以上的多肽对所述受试者来源的血液样本有响应、且检测到来自多肽组6~7中的仅一个多肽组中的至少任意一个或两个以上的多肽对所述受试者来源的血液样本有响应时（判据4），判定受试者是混合疟患者；否则，判定受试者不是混合疟患者。

此外，在所述多肽集合1为上述多肽组1~7的全部的情况下，本发明还提供一种区分受试者是恶性疟患者、间日疟患者、混合疟患者还是非疟疾患者的方法，该方法包括：

使用上述本发明的试剂盒检测SEQIDNO：1~7所示的多肽是否对受试者来源的血液样本有响应；其中，

当未检测到分别来自多肽组1~5中的至少两个或两个以上多肽组中的至少任意两个或两个以上的多肽对所述受试者来源的血液样本有响应时，判定受试者不是疟疾患者；

当检测到分别来自多肽组1~5中的至少两个或两个以上多肽组中的至少任意两个或两个以上的多肽对所述受试者来源的血液样本有响应、且未检测到来自多肽组6~7中的任何多肽对所述受试者来源的血液样本有响应时，判定受试者是恶性疟患者；

当检测到分别来自多肽组1~5中的至少两个或两个以上多肽组中的至少任意两个或两个以上的多肽对所述受试者来源的血液样本有响应、且检测到分别来自多肽组6~7中的至少任意两个或两个以上的多肽对所述受试者来源的血液样本有响应时，判定受试者是间日疟患者；

当检测到分别来自多肽组1~5中的至少两个或两个以上多肽组中的至少任意两个或两个以上的多肽对所述受试者来源的血液样本有响应、且检测到来自多肽组6~7中的仅一个多肽组中的至少任意一个或两个以上的多肽对所述受试者来源的血液样本有响应时，判定受试者是混合疟患者。

需要说明的是，在上述本发明的检测方法中，所述血液样本可以是全血、血浆或血清，优选为血浆或血清，更优选为血清。

实施例

1.多肽的制备与确认

实施例中使用的多肽由吉尔生化（上海）有限公司合成，并通过质谱对其进行了确认。其中，

SEQIDNO：1：HEIVEVEEILPEDEEVKEKEEVKEK；分子量3035。

SEQIDNO：2：LPEPTVTNEEYGFDDGSAFGGGLPF；分子量2617。

SEQIDNO：3：CGKNEEFLNDRCDICDEMLDPEASFWG；分子量3136。

SEQIDNO：4：NFLNDLFKKNNKNDLDDFFKNEKEYDDLCD；分子量3715。

SEQIDNO：5：KGPEIIIEEVKEEIKKQVEDGIKENDTEGN；分子量为3413。

SEQIDNO：6：PKDQLDYENDIEKKICKMEK；分子量2469。

SEQIDNO：7：KAEPKNPRENKLKQPGDRAD；分子量2291。

2.试剂盒的制备

检测芯片是以SJ改性硅胶（iPDMS薄膜）为固体支撑材料，在其上通过点样固定多肽溶液制备而成。改性硅胶是在传统的聚二甲基硅氧烷材料中加入带烯烃末端的、表面引发聚合反应的引发剂，并通过热交联（硅氢键键合）固定到聚二甲基硅氧烷的三维结构中，得到一种新的材料即SJ改性硅胶。其制作过程参见国际专利公开WO2014/044184。

制好的SJ改性硅胶薄膜可保存在4℃冰箱中。

采用晶芯?PersonalArrayerTM16个人点样仪在改性硅胶上制备多肽微阵列(即检测芯片)，过程为：

1）预处理

将SJ改性硅胶薄片（15×15mm²）浸泡在活化液中，30min后取出用去离子水淋洗3次，用氮气吹干，马上用于点样。

2）点样

将点样液稀释好并转移到384孔板相应的微孔中，将带样本的384孔板置于点样仪基台上，同时将预处理的改性硅胶薄片置于点样仪的基台上，马上进行点样。点样环境条件为室温（25℃），湿度设定为50%。将下述多肽在SJ改性硅胶薄片上点成微阵列，每个多肽点样一个点，另外点样一个H-IgG点作为阳性质控点以及一个PB点作为阴性质控点。制成的多肽微阵列上每个点的点样量约为0.6nL，样点半径为200μm。

这里，各试剂盒的改性硅胶薄片上点样的多肽具体如下：

试剂盒1：SEQIDNO：1~5所示的多肽。

试剂盒2：SEQIDNO：1~7所示的多肽。

3）化学固定

刚制好的多肽微阵列要放在恒温恒湿箱（26℃,60%湿度）中固定至少6h。化学固定过程参见国际专利公开WO2014/044184。

首先通过点样仪将包含有捕获多肽分子的缓冲液点在改性硅胶薄膜上，接着缓冲液开始蒸发，捕获多肽分子与SJ改性硅胶表面亲密接触并相互作用，通过化学结合，改性硅胶表面的ploy(OEGMA)高分子的末端-COOH与多肽分子的-—NH₂形成稳定共价键，进而将有化学活性的多肽分子固定在SJ改性硅胶表面。

4）装配

固定6h的多肽微阵列必须在两天内装配好。首先通过背胶将SJ改性硅胶薄片贴在专门的反应柱上，盖上反应腔体。一个反应器由两个反应柱和一个反应腔体组成。

5）保存

装配好的多肽微阵列，需要抽真空密封，保存在4℃的冰箱中，备用。

3.用试剂盒进行检测

检验步骤

(1)开始检测前，将浓缩清洗液按1:10的比例加入纯化水或蒸馏水进行稀释，稀释完成后直接使用。使用移液枪将2mL清洗液加到芯片表面，浸泡芯片3分钟，保证芯片表面被完全浸润。

(2)将待测血清样本用样本稀释液按照1:200稀释混匀。

(3)弃去浸泡芯片的清洗液，在芯片表面完全湿润的状态下，每个血清样本吸取200μL稀释后的血清加入到芯片反应器内。

(4)将芯片反应器放入芯片固定座，放到摇床上，开启摇床，频率150转/分钟，室温孵育30分钟。

(5)弃去芯片反应器内的血清样本，用15mL洗液清洗反应腔体和芯片表面3次。

(6)清洗完成后，每个芯片反应器分别加入200μL酶标抗体溶液，将芯片反应器放入芯片固定座，放到摇床上，开启摇床，频率150转/分钟，室温孵育30分钟。

(7)弃去芯片反应器内的酶标抗体溶液，用15mL洗液清洗反应腔体和芯片表面3次。

(8)清洗完成后，取下反应腔体，每个芯片表面分别加入15μL发光底物液，使发光液能均匀的铺于芯片表面。

(9)将加入了发光液的芯片置于凝胶成像仪中化学发光成像并判定结果，作为凝胶成像仪，使用例如天能5500型微阵列成像仪、偲捷牌TN5500型或偲捷牌CLEAR4000型等均可。

(10)结果判定：对于每一份血清，分别统计试剂盒1~3中的每一条多肽是否有响应（即，信噪比（SNR）大于等于2），并根据上述“诊断方法”部分中所描述的判据1~4进行判定。即，

判据1：当检测到分别来自下述多肽组1~5中的至少两个或两个以上多肽组中的至少任意两个或两个以上的多肽对所述受试者来源的血液样本有响应时，判定受试者是疟疾患者；否则，判定受试者不是疟疾患者。

判据2：当检测到分别来自多肽组1~5中的至少两个或两个以上多肽组中的至少任意两个或两个以上的多肽对所述受试者来源的血液样本有响应、且未检测到来自多肽组6~7中的任何多肽对所述受试者来源的血液样本有响应时，判定受试者是恶性疟患者；否则，判定受试者不是恶性疟患者。

判据3：当检测到分别来自多肽组1~5中的至少两个或两个以上多肽组中的至少任意两个或两个以上的多肽对所述受试者来源的血液样本有响应、且检测到分别来自多肽组6~7中的至少任意两个或两个以上的多肽对所述受试者来源的血液样本有响应时，判定受试者是间日疟患者；否则，判定受试者不是间日疟患者。

判据4：当检测到分别来自多肽组1~5中的至少两个或两个以上多肽组中的至少任意两个或两个以上的多肽对所述受试者来源的血液样本有响应、且检测到来自多肽组6~7中的仅一个多肽组中的至少任意一个或两个以上的多肽对所述受试者来源的血液样本有响应时，判定受试者是混合疟患者；否则，判定受试者不是混合疟患者。

其中，信噪比=（多肽点信号值-阴性对照点信号值）/阴性对照点信号值。多肽点信号值是指成像仪配套软件读取的多肽点的化学发光强度值，阴性对照点信号值是指成像仪配套软件读取的阴性对照点的化学发光强度值。

对于643份血清样本，分别采用上述步骤2中制备的试剂盒1（按上述3的步骤）以及传统的镜检法进行检测，检测结果如表1所示。

表1

准确率为＝（337+296）/643=98.4%

灵敏度为＝337/344×100%=98.0%

特异性＝296/299×100%=99.0%

假阳性率=3/299×100%=1.0%

对于643血清样本，分别采用上述2中制备的试剂盒2（按上述3的步骤）以及传统的镜检法进行检测，检测结果如表2所示。

表2

恶性疟疾准确率=（138+99）/239×100%=99.2%

恶性疟疾灵敏度=138/140×100%=98.5%

恶性疟疾特异性=99/99×100%=100%

恶性疟疾假阳性率=0/99×100%=0%

间日疟疾准确率=（148+99）/250×100%=98.8%

间日疟疾灵敏度=148/151×100%=98.0%

间日疟疾特异性=99/99×100%=100.0%

间日疟疾假阳性率=0/99×100%=0.0%

混合感染准确率=（51+100）/154=98.1%

混合感染灵敏度=51/53×100%=96.2%

混合感染特异性=100/101×100%=99%

混合感染假阳性率=1/101×100%=1%

由此可知，上述试剂盒1~2的诊断数据与临床镜检数据基本一致，其完全符合作为诊断试剂盒的要求，具有良好的准确率、灵敏度和特异性，适用于疟疾的诊断，且能够区分恶性疟感染，间日疟感染，恶性疟和间日疟的混合感染，适合各级医院和疾控部门使用。

以上，通过实施例对本发明进行更具体的说明，但并不是对本发明技术范围的限定。通过本说明书的记载，本领域技术人员可以容易的对本发明进行修饰/改变，这些包含在本发明的技术范围内。

SEQUENCELISTING

<110>苏州偲聚生物材料有限公司

<120>可用于诊断间日疟和/或恶性疟的试剂盒

<130>sj-1-7

<160>7

<170>PatentInversion3.5

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<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>疟疾抗原性多肽

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2025

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<221>misc_feature

<223>疟疾抗原性多肽

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<223>疟疾抗原性多肽

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