红景天苷在制备治疗糖尿病足的药物中的应用

摘要

本发明涉及红景天苷在制备治疗糖尿病足的药物中的应用。在小鼠糖尿病足模型中，红景天苷在高糖、低氧条件下特异地促进血管新生因子的表达和分泌。

说明书

技术领域

本发明涉及红景天苷在制备治疗糖尿病足的药物中的应用。

背景技术

糖尿病足是糖尿病的最常见、最严重并发症之一。由于血糖控制不理想，导致下肢 外周血管病变，从而引起下肢供血不足并导致下肢组织细胞缺氧，加上高糖条件下组织修 复、伤口愈合能力明显下降，严重时出现组织坏疽、组织缺失(tissueloss)甚至死亡；临床 上严重患者往往需要截肢。

糖尿病足(DiabeticFoot)的理想的治疗方法为改善供血状态，目前针对治疗血 管病变的方法有利用支架、搭桥、气囊扩张术等；另外，最近，由于其无侵袭性等优势，促进 血管重构被认为是最好的治疗途径。

然而，糖尿病病人的血管病变反复率高，且病变部位较广，因此上述利用支架、搭 桥或气囊扩张术对糖尿病足不是理想的治疗方法。

更为重要的是，在高血糖这种独特的病理环境条件下，各种体内机能下降，各种因 子的行为和生物调控途径以及反应也与正常条件有所不同。例如，糖尿病人的组织/细胞缺 失了细胞对低氧环境的应激能力。高糖环境使血管内皮生长因子(Vascularendothelial growthfactor,VEGF)以及VEGF受体(VEGFR)、血小板衍生因子-BB(Platelet-derived growthfactor-BB,PDGF-BB)等血管新生因子的表达异常降低、且这些因子对低氧的应激 反应也受损害，而这些因子在血管重构中起到重要作用。且也有报道，高糖条件下细胞表面 的VEGFR2下降，阻止了VEGF-VEGFR2通路的信号传导，抑制了VEGF所诱导的血管内皮细胞的 增殖等血管重构过程，导致糖尿病小鼠对VEGF的灵敏度明显低于正常小鼠，因此利用VEGF 诱导下肢血管重构对治疗糖尿病足不是一个理想的治疗方法。

现有技术文献

非专利文献

DiabetesMellitusandIschemicDiseases:MolecularMechanismsof VascularRepairDysfunction.Arteriosclerosis,Thrombosis,andVascularBiology, 2014,34(6):1126-1135.

发明内容

发明所要解决的问题

基于上述现状，作为解决上述问题的途径，目前迫切需要一种能够在高糖、低氧条 件下有效促进血管重构的方法及药物，即迫切需要对于糖尿病足的治疗有良好效果的方法 及药物。

解决问题的手段

本申请的发明人进行了广泛深入的研究，结果发现，红景天苷(结构式如式1所示) 对于糖尿病足的治疗有良好的效果。本发明中的糖尿病足是指下肢糖尿病血管并发症、或 糖尿病相关的下肢血管病变。

另外，还发现红景天苷能够促进骨骼肌里的血管新生因子VEGF-A、成纤维细胞生 长因子2(Fibroblastgrowthfactor2，FGF2)、血管生成素-1(Angiopoietin-1，ANG1)、 PDGF-BB和肝细胞生长因子(Hepatocytegrowthfactor，HGF)的表达，从而促进糖尿病下 肢血管病变患者(即糖尿病足患者)的血管管腔的形成，尤其是本发明能够促进成熟、无漏 且具有功能的血管的形成。由此，完成了本发明。

本发明涉及如下方案。

1.一种治疗糖尿病足的药物，该药物的活性成份为红景天苷。

2.根据方案1的治疗糖尿病足的药物，所述药物为注射剂。

3.根据方案1或2的治疗糖尿病足的药物，所述药物为骨骼肌注射剂。

4.一种血管新生因子的表达和分泌的促进剂，所述促进剂为红景天苷。

5.根据方案4的促进剂，所述促进剂促进骨骼肌细胞的血管新生因子的表达和分 泌。

6.根据方案4或5的促进剂，所述血管新生因子为VEGF-A、FGF2、ANG1、PDGF-BB和 HGF。

7.根据方案4-6中任一项的促进剂，所述促进剂在高糖条件下促进血管新生因子 的表达。

8.根据方案4-7中任一项的促进剂，所述促进剂在低氧条件下促进血管新生因子 的表达。

9.红景天苷在制备治疗糖尿病足的药物中的应用。

10.根据方案9的应用，其中，所述红景天苷为注射剂。

11.根据方案9或10的应用，其中，所述红景天苷为骨骼肌肉注射剂。

12.红景天苷在制备血管新生因子的表达和分泌的促进剂中的用途。

13.根据方案12所述的用途，所述血管新生因子的表达和分泌的促进剂为治疗糖 尿病足的药物。

14.根据方案13的用途，所述血管新生因子的表达和分泌的促进剂促进血管新生 因子的表达和分泌。

15.根据方案14的用途，所述血管新生因子为VEGF-A、FGF2、PDGF-BB、ANG1和HGF中 的一种或多种。

16.根据方案12-15中任一项的用途，所述促进剂在高糖条件下促进血管新生因子 的表达。

17.根据方案12-16中任一项的用途，所述促进剂在低氧条件下促进血管新生因子 的表达。

18.红景天苷在制备高糖条件下成熟血管形成促进剂中的用途。

19.红景天苷在制备高糖、低氧条件下成熟血管形成促进剂中的用途。

20.一种治疗糖尿病足的方法，其中，对患者进行红景天苷的给药。

21.根据方案20的治疗糖尿病足的方法，该给药方法为肌肉注射。

发明效果

根据本发明，能够提供红景天苷在制备治疗糖尿病足的药物中的应用。所述应用 中，红景天苷能够在高糖、低氧条件下促进骨骼肌里的多种血管新生因子的表达和分泌，例 如VEGF-A、FGF2、ANG1、PDGF-BB和HGF的表达和分泌。进而，能够促进糖尿病足患者的下肢血 管管腔的形成，尤其是能够促进成熟、无漏且具有功能性的血管的形成，从而能够实现糖尿 病足的治疗效果。

另外，根据本发明，能够提供一种治疗糖尿病足的药物，所述药物能够在高糖、低 氧条件下促进骨骼肌里的血管新生因子VEGF-A、FGF2、ANG1、PDGF-BB和HGF的表达和分泌， 从而促进糖尿病足患者的下肢血管管腔的形成，尤其是能够促进成熟、无漏且具有功能性 的血管的形成，从而能够实现糖尿病足的治疗效果。

另外，根据本发明，能够提供一种治疗糖尿病足的方法，其具有优异的糖尿病足的 治疗效果。

附图说明

图1(A)是示出红景天苷促进糖尿病足小鼠血流恢复的效果的彩色照片被转化为 灰度图像后的图。

图1(B)是示出对图1(A)中的血流部分进行处理后的图。

图2是示出红景天苷促进糖尿病足小鼠血流恢复的效果的坐标图。

图3是分别示出术后21天生理盐水对照组与红景天苷处理组中成熟血管形成的效 果的照片。

图4是分别示出红景天苷和生理盐水对血管内皮细胞以及血管平滑肌细胞的作用 效果的定量柱状图。

图5是示出红景天苷对血管新生因子影响的柱状图。

具体实施方式

本发明人发现红景天苷能够对小鼠糖尿病足模型具有良好的治疗效果。另外，本 发明中的糖尿病足是指下肢糖尿病血管并发症、或糖尿病相关的下肢血管病变。本发明中 的糖尿病足的程度没有任何限制，可为前期病变、轻度、中度或严重的糖尿病足。

本发明中的糖尿病包括1型糖尿病、2型糖尿病以及糖尿病前期。1型糖尿病和2型 糖尿病的空腹血糖≥7.0mmol/L，糖尿病前期(pre-diabetes)的空腹血糖大于6.1mmol/L而 小于7.0mmol/L。本说明书中记载的“高糖”是指由糖尿病以及糖尿病相关血管病变引起的 高糖。

本说明书中记载的“低氧”是指由糖尿病以及糖尿病相关血管病变引起的组织细 胞低氧(以下有时称为“缺氧”)。关于低氧状态下的氧浓度没有任何限定。由于组织里的氧 浓度会根据部位(包括同一个组织里的部位)而有所不同，并且考虑到组织里的氧气浓度低 于动脉氧气浓度、且动脉氧气分压一般认为为100mmHg(低于40mmHg就会使生物体致死)，因 此本发明中低氧是指氧气分压优选为高于0mmHg且为100mmHg以下的范围，更优选为10～ 100mmHg、进一步优选为20～100mmHg、再优选30～100mmHg、最优选40～100mmHg的范围。

另外，本领域技术人员应可以理解，本发明实施例中的糖尿病足小鼠模型是采用 完全切断大腿大动脉构建的(即该下肢处于严重的缺氧状态)，且所用的糖尿病小鼠模型的 空腹血糖≥16.7mmol/L，远远高于糖尿病标准的空腹血糖(即≥7.0mmol/L)，是严重的糖尿 病小鼠。因此可知，本发明实施例中的糖尿病足小鼠患有严重的糖尿病足。基于糖尿病的程 度(即血糖的高低)与组织修复、伤口愈合等能力成反比，本领域技术人员应可以理解，后述 的本发明的效果除了对严重糖尿病足具有良好的治疗效果之外，对血管重构和下肢功能恢 复能力更强的前期病变、轻度或中度的糖尿病足能起到更好的治疗效果。

本发明中，糖尿病足的治疗药物包含红景天苷作为活性成份。本发明中的红景天 苷为结构式如式1的化合物。红景天苷的来源可以是从高山红景天、大花红景天、蔷薇红景 天、西藏红景天等景天科植物中提取，也可以是通过化学合成。红景天苷的纯度没有限制， 优选为80％以上，更优选为90％以上，进而优选为95％以上，再优选为98％以上，最优选为 99.8％以上。关于纯度的影响，申请人说明如下。后述的本发明实施例中记载了使用上海同 田生物技术有限公司(纯度≥98.0％)生产的红景天苷，申请人另外也使用了中国食品药品 检定研究院的红景天苷产品(纯度≥99.8％)，且使用这两种浓度的红景天苷效果相同，由 此可以理解，后述的本发明效果是由红景天苷所产生的，而不是由杂质成分产生。

另外，关于使用红景天苷治疗下肢缺血性疾病时的浓度，可以设定为每次注射10- 500mg/kg体重。该剂量可以单次或者分成多次使用。给药次数可以单次或多次，可以连续性 每天给药或间隔性给药。

本发明中的糖尿病足的治疗药物也可以包含一种或多种辅料。辅料没有限定，例 如溶剂、等张剂、赋形剂、pH调整剂、抗氧化剂、崩解剂、调味剂、香料、保存剂等本领域常用 的辅料。

作为溶剂可以列举：注射用蒸馏水、生理盐水、植物油，丙二醇、聚乙二醇、乙醇、甘 油之类的醇类等。

作为等张剂可以列举：山梨醇、氯化钠、葡萄糖等本领域常用的等张剂。

作为赋形剂可以列举：乳糖、甘露醇、葡萄糖、微晶纤维素、淀粉等。

作为pH调整剂可以列举：盐酸、枸橼酸、氢氧化钠、强氧化钾、碳酸氢钠、磷酸氢二 钠等。

作为抗氧化剂可以列举：亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、抗坏血酸等。

作为崩解剂可以列举：马铃薯淀粉。

作为调味剂可以列举：蔗糖、单糖浆等甜味剂，等。

作为香料可以列举：薄荷油，橙皮油等。

作为保存剂可以列举：尼泊金类、山梨酸及其盐等本领域常用的保存剂。

本发明中的糖尿病足的治疗药物可以为任何一种剂型，例如口服液、贴剂、片剂、 胶囊、注射剂等，优选为注射剂，最优选为骨骼肌注射剂。

促进剂为促进基因的表达或分泌水平的药剂，可包含促进转录、翻译、蛋白质合 成、蛋白质稳定性以及分泌的药剂。

本发明中的血管新生因子为对促进成熟血管的形成起到作用的因子，其中包括对 管腔形成起作用的因子(VEGF-A、FGF2、HGF等)、对细胞成熟起作用的因子(FGF2、HGF、PDGF- BB、ANG1等)等。另外，本领域技术人员应可以理解，这些因子在小鼠和包括人类在内的哺乳 动物中的调控机制以及它们的作用效果是共通的，因此，本领域技术人员应可以理解，基于 本说明书对红景天苷作用效果以及作用机制的描述，本发明的效果在包括人类在内的哺乳 动物体内也能达到治疗糖尿病足、在高糖、低氧条件下促进血管新生因子的表达和分泌、促 进成熟血管的形成等本说明书所描述的效果。另外，本领域技术人员应可以理解，本说明书 中的“促进血管重构”和“促进成熟血管的形成”为促进血管的新生以及/或促进新生血管的 成熟。

实施例

1.糖尿病小鼠模型的建立

C57BL/6J小鼠(6周，雄性)购买(购自中国人民解放军第三军医大学)回来一周后 测量小鼠血糖，用下述高脂饲料喂养4周后测量血糖，出现糖尿病前期(pre-diabetes)的情 况后，链脲佐菌素通过肌肉连续注射五天，射量为50mg/kg，继续高脂饲料喂养一周后测量 小鼠血糖，血糖高于16.7mmol/L的被选用做下一步实验。在此，需要说明的是，一般血糖为7 以上已被认为患有糖尿病，但本发明的模型选定血糖为16.7以上的小鼠。

高脂饲料的配方：15％猪油

10％蛋黄

10％白糖

65％普通饲料

其中，普通饲料、蛋黄、猪油、白糖由第三军医大学大坪医院提供，并由第三军医大 学大坪医院生产高脂饲料。

2.红景天苷对糖尿病足的治疗效果

使用上述糖尿病小鼠模型，在麻醉条件下对左侧大腿大动脉进行切除手术，并利 用LaserDopplerPerfusionImagingSystem检测血流的情况。需要说明的是，关于本申 请说明书中“左侧”、“右侧”的表述，进行了手术的是左侧大腿，此时小鼠处于俯卧状态，后 述的血流图的照片中小鼠处于仰卧状态，所以该血流图照片中手术的大腿在图中右侧)(参 照文献ShourongWuetal.,Prolylhydroxylasedomain-2silencinginducedby hydrodynamiclimbveininjectionenhancesvascularregenerationincritical limbischemiamicethroughactivationofmultiplegenes(2015)CurrGeneTher., 15(3):313-325中的方法)。

将红景天苷(从上海同田生物技术股份有限公司购买，样品纯度高于98％)用磷酸 盐缓冲溶液(PBS)溶解，配成40mg/ml的储存液，用0.22μm滤膜过滤后，于-20℃保存备用。

注射前将红景天苷储存液稀释至20mg/ml，小鼠肌肉注射剂的剂量为100mg/kg，术 后第1天开始每三天注射一次，每次注射将注射液分3次，连续往左侧腓肠肌里分三个位点 分别注射。

使用生理盐水作为对照，同样地过滤、保存和注射。

利用LaserDopplerPerfusionImagingSystem(MOORINSTRUMENTSLtd， MOORLDLS2-IR)检测手术前、刚手术后、术后第3、7、14、21天的血流情况。

参照图1(A)，灰色部分反应血流状况。术前，生理盐水对照组小鼠和红景天苷处理 组小鼠具有同等的血流状况(需要说明的是，LaserDopplerPerfusionImagingSystem 原初成像为彩图，转化为灰度图片后，与原初所成的像看起来有些许差异。在原彩图中，红 色表示血流丰富，蓝色表示没有血流。在灰度图像下无法较清晰地区分血流恢复的地方(即 原彩图中红色部位)和没有血流(即原彩图中蓝色部位)的地方)。针对该问题，本申请发明 人依据彩图结果对灰度图进行了图像处理，从而得到了图1(B)。在图1(B)中，网点状表示血 流恢复的地方，即原彩图中的红色部分。刚手术后，对照组小鼠和红景天苷处理组小鼠左侧 下肢均显示出黑色(在原彩图中均为蓝色部分，在处理后的图中没有网点状图案)，即二者 左侧下肢均没有血流，可知手术成功地制造出糖尿病足小鼠模型。在术后第3天，红景天苷 处理组小鼠左侧下肢开始出现灰色和黑色部分(即原彩图中的红色部分、处理后的图中的 网点部分)，可知出现了明显的血流恢复状况；与之相对，生理盐水对照组小鼠左侧下肢仍 为黑色(即原彩图中的蓝色部分，在处理后的图中为没有网点状图案的黑色部分)，可知没 有出现血流恢复的迹象。术后第21天时，红景天苷处理组小鼠左侧下肢达到了与未处理的 左侧下肢几乎同等的血流状况，即左侧下肢的血流得到了较为充分的恢复；与之相对，图中 生理盐水对照组小鼠左侧下肢影像缺失，推测是由于没有血流恢复而导致了下肢萎缩和组 织坏死。另外从图中也可以看出，随着治疗时间的延长，红景天苷处理组左侧下肢的灰色和 黑色部分(即原彩图中的红色部分、处理后的图中的网点部分)越来越达到下肢的远端(即 靠近脚趾)部位，可知血流逐渐恢复到距离动脉切除较远的部位。

为了进一步明确红景天苷处理组的实验效果，本申请发明人对LaserDoppler PerfusionImagingSystem的结果进行了定量。具体计算方法为：将缺血下肢(左侧下肢) 的定量值除以同一只小鼠的非缺血下肢(右侧下肢)的定量值(即血流面积的像素)，然后将 每一个时间点的该比值平均化并除以各组术前的比值的平均值。参照基于统计结果的图2 可知，刚手术后，对照组小鼠和红景天苷处理组小鼠的血流比值均降为低于0.3的数值。在 术后第3天，红景天苷处理组小鼠的血流比值达到0.6；与之相对，生理盐水对照组小鼠的血 流比值明显低于0.4。术后第21天时，红景天苷处理组小鼠的血流比值达到了0.8；与之相 对，对照组小鼠的血流比值仍为与术后第3天的值接近的低值。

由此可知红景天苷对糖尿病足小鼠的处理实验获得了优异的血流恢复效果。与注 射生理盐水的对照相比，注射了红景天苷的糖尿病足小鼠的血流状况显著恢复，可知红景 天苷对于糖尿病足的治疗有良好的效果，由此可知产生了成熟、无漏且具有功能性的新生 血管。

3.免疫组织染色

(1)制造糖尿病足模型小鼠组织冰冻切片

术后21天，取得红景天苷处理组和生理盐水处理组小鼠的腓肠肌组织后保存在- 80℃。待组织冷冻后进行切片，得到实验样本。

切片流程如下，包埋剂包埋组织后在切片机(Leica生产)上进行切片，切片厚度是 10μM。切片结束后将切片置于37℃烘箱中烘干30min，2.5％牛血清白蛋白(BSA)中封闭30～ 60min。将组织周围的BSA除去后，用抗PECAM-1(别名：CD31)抗体染色(PECAM-1：Purified RatAnti-MouseCD31(CloneMEC13.3,BDPharmingen^TMCat550274，抗体稀释比例1: 50)。室温孵育1h后，用含有0.1％吐温的生理盐水(PBS-T)清洗三次，每次5min。

将带有荧光标记的抗α-SmoothMuscleActin(α-SMA)的抗体(即α-Smooth Muscle-Cy3,Mousemonoclonal(Clone1A4,Sigma-AldrichCatC6198))和荧光标记的， 针对抗PECAM-1抗体的二抗(Goatanti-RatIgG(H+L)SecondaryAntibody,Alexa 488conjugate(ThermoScientificCatA11006))混合(抗体稀释比例均为1: 100)，并将上述用抗PECAM-1抗体孵育并清洗过的切片进一步用上述抗α-SMA和抗PECAM-1 抗体的二抗的混合液在室温孵育30min。然后PBS-T清洗三次，每次5min。免疫荧光染色结束 并用丙三醇封片后，用荧光显微镜(LeicaMicrosystems，DMI6000B)进行检测。

对注射了红景天苷和生理盐水的糖尿病足小鼠分别确认了血管生成及血管成熟 状况。结果如图3所示。根据图3所示的结果可知，红景天苷促进了糖尿病足小鼠缺血下肢中 的成熟血管的形成。可以确认，注射红景天苷后的小鼠的组织内血管内皮细胞(即PECAM-1 阳性)和血管平滑肌细胞(即α-SMA阳性)增多。通过重叠图片(Mergeimage)发现PECAM-1和 α-SMA双阳性的结构增多，并形成了由血管平滑肌细胞包围血管内皮细胞的管腔结构，意味 着形成了丰富的成熟血管，而注射生理盐水的小鼠仅有非常微弱的阳性信号，且绝大部分 不形成管腔结构。定量结果也显示了红景天苷能显著地诱导更多的血管内皮细胞和血管平 滑肌细胞。

为了进一步明确红景天苷组的实验效果，本申请发明人利用LeicaApplication SuiteVersion4.6软件对所获得的图3的结果进行了定量。结果如图4所示。

由该定量结果可以明确地读出，在针对PECAM-1的实验结果中，红景天苷处理后的 样本的PECAM-1的阳性面积超过了80000pixel，与之相对，生理盐水处理后的样本的阳性面 积仅稍大于20000pixel，是相当低的值。在针对α-SMA的实验结果中，红景天苷处理后的样 本的阳性的面积超过了30000pixel，与之相对，生理盐水处理后的样本的阳性面积仅刚超 过10000pixel，是相当低的值。

该结果进一步表明，注射红景天苷能够治疗糖尿病足缺血下肢血流的恢复，推测 其原因是由于红景天苷促进了小鼠的血管新生和成熟血管的形成。

4.红景天苷对糖尿病足小鼠血糖的影响

为了检测红景天苷对于糖尿病足小鼠血流恢复的影响是否是基于其对生物体血 糖水平的影响的结果，本申请的发明人对糖尿病足小鼠的血糖进行了测定。

血糖检测方法为：将血滴到活力型血糖试纸插入活力型血糖仪( Active，ModelGU，Roche)。利用采血笔(LancingDevice，Roche)和一次性使用采血针(Roche)，从糖尿病足小 鼠尾巴采血，并将血滴添加在活力型血糖试纸橙色区域的中间。

对于生理盐水对照组和红景天苷处理组的小鼠，分别对术前、以及术后第3、7、14 和21天的血糖值进行检测。

由下表1可知，红景天苷处理组小鼠的血糖水平与生理盐水对照组小鼠为同等水 平。可知，对糖尿病足小鼠缺血大腿骨骼肌局部注射红景天苷未影响血糖水平。即，可知在 缺血部位的骨骼肌局部注射红景天苷对于糖尿病足小鼠的血流恢复状况、进一步地对于糖 尿病足的治疗，并不是通过对生物体血糖水平的调节来实现的。

表1(单位：mmol/L)

术前 术后3天 术后7天 |术后14天 术后21天 7 --> 对照 22.61±2.63 19.3±1.5 24.65±3.45 20.26±1.70 19.16±1.91 红景天苷 21.77±4.18 18.46±1.00 25.93±4.14 19.69±1.23 19.19±1.30 p值(对照vs红景天苷) 0·613 0·397 0·536 0.336 1

表中为平均值±标准偏差，p值由卡方检验计算得到。

5.糖尿病小鼠模型中红景天苷对血管新生因子的影响

(1)红景天苷的注射

将红景天苷用PBS溶解，配成40mg/ml的储存液，用0.22μm滤膜过滤后，于-20℃保 存备用。

注射前将红景天苷储存液稀释至20mg/ml。根据上述项目1.中的记载建立糖尿病 足小鼠模型，并注射所得到的红景天苷稀释液。糖尿病小鼠肌肉注射剂的剂量是100mg/kg， 术后第一天注射，注射时将注射液分3次，连续往左侧腓肠肌里分3个位点分别注射。

(2)RNA的提取

在小鼠手术第三天将其麻醉后处死，取腓肠肌组织并置于Solution。 将组织分成两块在液氮中研磨，待磨成粉末状之后加入TRIZOL后收集到1.5mL的无酶EP管 中。RNA提取后，用NanoDrop进行RNA定量后，进行反转录PCR(RT-PCR)和定量PCR(Q-PCR)。

实验过程中的仪器主要有：NanoDrop2000微量核酸测定仪(GeneCompany公司)。 研钵(国产)，PCR仪(T100Thermalcycler，Bio-RAD公司)，八连管(Bio-RAD公司)，Q-PCR (CFX-96OpticalReactionModule#1845097，Bio-RAD公司)。

实验过程中主要使用如下试剂：液氮，Solution(Ambion公司)，RNA反 转录及实时定量试剂盒(TaKaRaRR047APrimeScriptRTreagentKitwithgDNA Eraser)，TriZol(Invitrogen公司)。

(3)mRNA水平的测定

通过RT-PCR，测定表2中记载的各血管新生因子的基因的表达水平，并用β-Actin 的表达量归一化。

(I)基因组DNA的去除

使用TAKARA-PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser(Code No.RR047A)，该步骤中使用的试剂及其使用量如下所示。

加样完成之后置于Bio-RADT100ThermalCycler中。

反应过程如下：42℃2min

4℃。

(II)反转录反应

使用如下试剂并按照如下的使用量进行反转录反应。

加样完成之后置于Bio-RADT100ThermalCycler中。

反应过程如下：37℃15min

85℃5sec

4℃。

得到cDNA后稀释10倍。稀释后的样品用来做Q-PCR反应。反应体系如下：

(III)Q-PCR反应程序

150.0℃for2min

295.0℃for10min

395.0℃for15sec

460.0℃for35sec

5GOTO3.40moretimes

695.0℃for15sec

760.0℃for1min

8MeltCurve65.0to95.0,increment0.5℃.

Q-PCR仪为CFX-96OpticalReactionModule#1845097(Bio-RAD公司)。

Q-PCR相关引物序列

表2

实验结果示于图5。由图5可知，在对糖尿病模型小鼠的缺血下肢进行红景天苷给 药后，骨骼肌里的血管新生因子VEGF-A、FGF2、ANG1、PDGF-BB和HGF的表达量均显著上调。认 为红景天苷能够在高糖、低氧条件下促进多种血管新生因子的表达。