一种土壤漆酶活性的荧光测定方法

摘要

本发明属于土壤化学分析技术领域，具体涉及一种土壤漆酶活性的荧光测定方法。利用漆酶直接催化氧化Amplex？Red形成强荧光物质试卤灵，建立一种荧光方法测定漆酶活性，并应用于土壤漆酶活性测定。本发明步骤为：以ABTS为底物测出漆酶酶活，然后制作漆酶催化氧化Amplex？Red的工作曲线，对土壤漆酶活性进行测定。本发明的优点在于，漆酶催化氧化Amplex？Red无需添加除溶解氧以外的氧化剂，且可直接用于土壤混浊液中漆酶活性测定，本发明克服了传统方法测定土壤漆酶活性偏低以及漆酶提取过程复杂的缺点，以此建立的荧光方法测定漆酶活性具有较低检测限和较宽检测范围。

说明书

技术领域

本发明属于土壤化学分析技术领域，具体涉及一种土壤漆酶活性的荧光测定方法。

背景技术

土壤酶是有机物质降解和养分循环的主要生物机制，酶活性可指示微生物活性，衰变率以及微生物或植物吸收物质的可利用性。通过测定土壤酶活性，可以更好地了解微生物群落功能，资源可利用性和生态系统进程之间的关系，以及生态系统应对自然和人为干扰的功能机制^[1,2]。

漆酶广泛分布于植物^[3]，昆虫^[4]，真菌^[5]以及一些细菌中^[6]，据文献报道：漆酶能够以氧分子作为最终电子受体^[7]，催化氧化各种有机污染物，例如多环芳香烃、多氯联苯、合成染料、杀虫剂、以及铁-氰化物复合物^[8]等。因此，漆酶在各种生理功能中具有重要意义，如碳循环、形态建成、防御和寄生等^[9-11]。在土壤和落叶等复杂环境中，测定漆酶活性最常用的方法是比色法，常用底物有丁香醛连氮(3,5-二甲氧基-4-羟基苯甲醛连氮)，ABTS(2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐)等^[9]。最初，丁香醛连氮被用作漆酶最常用底物^[8，9,12]，但丁香醛连氮形成的的醌类产物不溶于水，因此这种方法的使用受到了限制^[13]。Farnet等人改造了丁香醛连氮的结构，使漆酶催化其产生新的水溶性产物，该方法已被用于落叶提取物中漆酶活性的测定，但其报道的所有丁香醛连氮衍生物的醌类产物吸光度不稳定，因此这种方法也具有一定局限性^[14]。目前，一般采用ABTS法测定土壤及相关样品中漆酶活性，其原理是：ABTS在漆酶存在的条件下能够产生有颜色的阳离子自由基ABTS^·+。但是在土壤、落叶等复杂介质中，许多分子能够消除ABTS^·+自由基发生褪色反应，造成测定的漆酶活性低于其实际值^[15]。

需要指出的是，传统方法需要将漆酶从土壤中提取出来进行显色反应并实现漆酶活性测定^[16]；但是，酶提取过程复杂、耗时；只能提取出很少部分漆酶；并且其提取效率随土壤变化而不同^[17]。此外，采用不同的萃取试剂，相同的土壤萃取效率也会有所不同。因此，现有的漆酶测定方法所获得的测定结果不能反应土壤中漆酶活性的真实结果，严重阻碍了漆酶在土壤中功能和作用的相关研究。因此，发展直接测定土壤中漆酶活性的新方法对于土壤科学及相关科学研究、促进环境保护和农业生产有十分重要的意义。

荧光检测由于其具有灵敏度高、线性动态范围宽、反应快、精确度高、选择性强等优点在工农业生产及科学研究中得到广泛应用。AmplexRed(10-乙酰基-3,7-二羟基苯噁嗪，AR)是试卤灵的一种衍生物，无色且无荧光性。研究表明：AR能够通过辣根过氧化物酶-过氧化氢体系被氧化为具强荧光性的试卤灵，该反应体系由此被开发用于各种检测试剂盒^[18-21]。但是，AR用于漆酶活性测定及其应用的研究尚未见有相关报导。通过研究，我们首次发现漆酶能够在溶解氧条件下催化氧化无荧光性的AR形成具强荧光性、有色的试卤灵。基于这一发现，本发明提出一种新型荧光方法用于测定土壤中漆酶活性，其优点包括：灵敏度及选择性高、线性范围宽、无需复杂提取程序并可以直接用于土壤中漆酶活性测定、操作简单快速、运行价格低等。因此，本发明在环境污染修复、土壤及相关科学等研究领域有重要实际应用价值。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种简单、灵敏的检测土壤漆酶活性的荧光测定方法，该方法克服了传统方法用于测定土壤漆酶活性偏低、操作复杂、耗时长等缺点。本发明还阐明漆酶催化AR荧光反应机制，最后，本发明将所建立的荧光测定方法成功应用于土壤样品漆酶活性的检测，显示了其潜在的实际应用价值。

具体地，本发明提供了一种测定土壤漆酶活性的荧光新方法，该方法是以AmplexRed(10-乙酰基-3,7-二羟基苯噁嗪，简称AR)为漆酶底物，直接测定土壤漆酶活性。

本发明通过以下技术方案实现

一种土壤漆酶活性的荧光测定方法，包括下列步骤：

以2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(简称ABTS，下同)为漆酶底物，以分光光度法，制作漆酶催化氧化AmplexRed(10-乙酰基-3,7-二羟基苯噁嗪，简称AR)的工作曲线，对土壤漆酶活性进行检测，所述的方法步骤如下：

(1)配制pH4.4的Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲溶液，5.0mmol/L的2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐，即ABTS溶液，在避光条件下放置，另外配制10.0mg/mL的漆酶溶液；

(2)以步骤(1)的Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液为缓冲体系，终浓度为0.5mmol/LABTS，5.0μg/mL漆酶为反应体系，测定4min反应时间内OD₄₂₀的变化，每间隔1min测定一次，共读数5次；根据4min内OD₄₂₀的变化值，得出漆酶酶活，酶活定义以每min催化1μmol底物转化为产物的酶量为标准；

(3)配制pH6.4的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液，将5.0mg的10-乙酰基-3,7-二羟基苯噁嗪(AR)以1944μL二甲基亚砜(DMSO)溶解得10.0mmol/LAR，分装后于-20℃保存备用，使用时用超纯水和DMSO稀释至10-500μmol/L，并使DMSO在AR溶液中体积分数为5％；

(4)以步骤(3)中pH6.4的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液为缓冲体系，以终浓度分别为1.0-50.0μmol/L的AR，0.5％DMSO，5.62-702U/L漆酶为反应体系，分别制作出1.0-50μmol/L底物浓度下漆酶催化氧化AR的工作曲线，以3倍性噪比测出每个AR浓度下的最低检测限，并以最低检测限初始达到最低时的AR浓度下的工作曲线作为最终工作曲线；

(5)以步骤(3)中pH6.4的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液为缓冲体系，终浓度5.0mg/mL土壤溶液，8.0μmol/LAR为反应体系，检测由土壤漆酶催化AR形成试卤灵产生的荧光信号值F，并代入工作曲线方程F＝0.1434U+0.0151(式中的F代表土壤漆酶催化AR形成试卤灵产生的荧光信号值；U代表漆酶的酶活，单位是U/L)，得出相应的漆酶活性U。

更详细的的技术方案见《具体实施方式》。

附图说明

图1：漆酶催化氧化AR前后荧光光谱变化图。

图2：漆酶催化氧化AR所得产物液质图谱。

图3：猝灭剂对漆酶-AR体系影响结果图。

图4：漆酶对AR溶液的电子顺磁共振信号影响结果图。

图5：漆酶催化氧化AR机理图。

图6：不同AR浓度下的最低检测限折线图。

图7：最适AR浓度下漆酶工作曲线图。

图8：干扰离子对漆酶活性测定影响柱状图。

图9：AR对土壤酶选择性柱状图。

图10：土壤对试卤灵荧光猝灭作用柱状图。

图11：土壤浓度对漆酶活性测定影响折线图。

图12：土壤浓度与荧光强度线性关系图。

图13：土壤pH-漆酶活性相关性结果图。

具体实施方式

实施例1漆酶催化氧化AR形成试卤灵的反应(基础实施例)

具体步骤如下：

(1)对漆酶催化氧化AR的产物进行液质分析，结果表明所得产物为试卤灵。

(2)在有漆酶存在和无漆酶存在条件下，分别对AR溶液进行电子顺磁共振测定。实验组以pH6.4Tris-HCl为缓冲体系，0.1mmol/LAR，0.1mg/mL超氧化物岐化酶，0.1mol/L正丁醇，0.16mol/L2,3-二甲基吡啶-N-氧化物(DMPO)，1.0mg/mL漆酶为反应体系，对照组不加漆酶，检测自由基信号，结果对照组检测到自由基，实验组未检测到自由基信号，表明反应过程中有中间产物自由基的形成，漆酶使自由基信号消失。

(3)向漆酶-AR反应体系中加入超氧化物岐化酶(SOD)抑制氧生成O₂^·-；分别加入正丁醇和异丁醇抑制HO^·的产生；再分别对反应体系进行除氧和加氧处理，对照组不作处理。结果表明，与对照组相比，只有除氧处理时，荧光信号明显下降；加氧处理时，荧光信号明显升高，而加入SOD，正丁醇，异丁醇则对荧光信号无明显影响，以上结果表明，氧以分子氧的形式直接参与反应。

实施例2制备实施例

本实施例采用分光光度法，以ABTS为底物对漆酶酶活进行测定，制作出漆酶催化氧化AR的工作曲线，并测定各种干扰离子对漆酶-AR反应体系的干扰作用。

具体步骤如下：

(1)配制pH4.4的Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲溶液，5.0mmol/L的2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐即ABTS溶液，于避光条件下放置，另外配制10.0mg/mL的漆酶溶液；

(2)以步骤(1)中Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液为缓冲体系，终浓度为0.5mmol/LABTS溶液，5.0μg/mL漆酶溶液为反应体系，测定4min反应时间内OD₄₂₀的变化，每间隔1min测定一次，共读数5次。根据4min内OD₄₂₀的变化率，得出漆酶酶活，酶活定义为每min催化1μmol底物转化为产物的酶量为标准。

(3)配制pH6.4的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液，将5.0mgAR以1944μL二甲基亚砜(DMSO)溶解得10.0mmol/LAR，分装后于-20℃保存备用，使用时以超纯水和DMSO稀释至10-500μmol/L，并使DMSO在AR溶液中体积分数为5％；

(4)以步骤(3)中pH6.4的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液为缓冲体系，以终浓度5.62-702U/L漆酶，制作出终浓度1.0-50μmol/LAR时漆酶催化氧化AR的工作曲线，反应时间为10min，以3倍性噪比测出每个AR浓度下的最低检测限，并以最低检测限初始达到最低时的AR浓度下的工作曲线作为最终工作曲线(详见图7)。

(5)配制1.0×10^－6-1.0mol/L的CuSO₄，ZnSO₄，MnSO₄，FeSO₄，Fe₂(SO4)₃，Al₂(SO₄)₃，NaCl，KCl，CaCl₂，MgCl₂，LiCl，NiCl₂，CdCl₂，CoCl₂，L-赖氨酸，甘氨酸，D-葡萄糖，苯酚，腐植酸钠溶液，以步骤(3)中pH6.4的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液为缓冲体系，以终浓度8.0μmol/L的AR，0.5％DMSO，350U/L的漆酶，1.0×10^-7-1.0×10^-1mol/L本步骤配制的干扰物质溶液为反应体系，测定干扰物质对漆酶-AR体系的干扰作用，结果表明本步骤测定得干扰物质对漆酶-AR体系无明显干扰作用。

实施例3应用实施例

本实施例是基于本发明的土壤漆酶活性的测定方法的具体应用。首先是漆酶-AR荧光反应对土壤中常见酶类的选择性测定，证明荧光信号的产生是由于土壤中存在漆酶活性引起，其次是土壤对试卤灵的荧光猝灭作用测定，土壤溶液浓度对漆酶活性测定影响，并以实施例1中的漆酶催化氧化AR工作曲线测定土壤样品中漆酶活性，并测定土壤pH值，以确定其与土壤漆酶活性的相关性，最后测定土壤样品加标回收率。

具体步骤如下：

(1)土壤采集与处理过程如下，拨开土壤表层落叶，取表层5cm的土壤，对不同采集地点所采土样分别编号后，以孔径小于2mm的筛子过筛后于4℃保存备用，待使用时，将土样置于55℃烘箱内干燥12小时，所有土样酶活测定在采集后14天内完成。称取干燥后的土壤25±0.01g，用500mL实施例1中pH6.4的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲溶液充分溶解，得50mg/mL土壤溶液，待使用时稀释至0-50mg/mL。

(2)分别以终浓度8.0μmol/L的AR，0.5％的DMSO，600U/L的漆酶，碱性磷酸酶，脲酶，纤维素酶，转化酶，葡萄糖氧化酶，过氧化氢酶，辣根过氧化物酶，木质素过氧化物酶，锰过氧化物酶以及酪氨酸酶，测定AR荧光反应的选择性，其中，除漆酶能使其产生较高荧光信号外，木质素过氧化物酶能使其产生较低的荧光信号，其他酶几乎不会使AR产生荧光信号，表明土壤溶液使AR产生荧光信号主要是由土壤中的漆酶引起的。

(3)将灭菌土壤和未灭菌土壤溶液加入试卤灵溶液中，以测定土壤溶液对产物试卤灵荧光信号的猝灭作用，土壤溶液终浓度为0-40mg/mL，试卤灵终浓度为8.0μmol/L，结果在测试土壤浓度范围内，土壤对试卤灵荧光无明显猝灭作用。

(4)以终浓度8.0μmol/LAR，0-40mg/mL土壤溶液测定土壤溶液浓度对土壤漆酶活性影响，土壤溶液与AR反应后，分别测定反应混合液和上清的荧光信号，结果二者并无明显差别，表明此方法可直接测定土壤混浊液荧光信号来测定漆酶活性，且在0-10mg/mL土壤浓度范围内，荧光信号与土壤浓度有较好的线性关系，故以终浓度5.0mg/mL的土壤溶液，8.0μmol/L的AR为反应体系，检测由土壤漆酶催化AR形成试卤灵产生的荧光信号值F，并代入工作曲线方程F＝0.1434U+0.0151，得出相应的漆酶活性U。

(5)土壤样品pH值测定，称取每份干燥后的土壤样品200±0.01g，加500mL去离子水充分溶解，离心取上清液测定pH值，最后得出土壤漆酶活性与pH值相关性。

表1土壤样品中漆酶加标回收率测定结果

(6)加标回收率测定，取步骤(1)中干燥处理的5份不同采集地点的土壤样品，测定其漆酶酶活，为试样测定值，向每份土壤样品中分别加入等量漆酶，加标量为25.5U/L，再测定加标土样漆酶酶活，为加标试样测定值，加标回收率＝(加标试样测定值－试样测定值)/加标量×100％。酶活测定方法详见步骤(4)。

表1结果显示，本方法测定土壤漆酶活性加标回收率在93-100％范围内，说明本方法测定漆酶活性准确度较好。

附录：本发明中实施例所用的主要试剂及相关仪器：

酶和试剂：所用漆酶(该漆酶来源于变色栓菌，Coriolusversicolor，该漆酶购自sigma公司)，10-乙酰基-3,7-二羟基吩嗪(AR)，试卤灵，2,3-二甲基吡啶-N-氧化物(DMPO)，超氧化物岐化酶(SOD)，碱性磷酸酶，脲酶，纤维素酶，转化酶，葡萄糖氧化酶，过氧化氢酶，辣根过氧化物酶，木质素过氧化物酶以及锰过氧化物酶，酪氨酸酶，腐植酸钠盐均购自SIGMA公司，2,2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)，二甲基亚砜(DMSO)，正丁醇，异丁醇，柠檬酸，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，硫酸铜，硫酸锌，硫酸锰，硫酸亚铁，硫酸铁，硫酸铝，氯化钠，氯化钾，氯化钙，氯化镁，氯化锂，氯化镍，氯化镉，氯化钴，L-赖氨酸，甘氨酸，D-葡萄糖，均购买自中国国药集团。

仪器：紫外分光光度计(美国贝克曼库尔特有限公司)，FluoroskanAscentFL荧光化学发光读数仪(赛默飞世尔科技)，1-14K离心机(购自SIGMA公司)，PB-10酸度计(赛多利斯科学仪器有限公司)。

主要参考文献

[1]Chaer,G.M.；Myrold,D.D.；Bottomley,P.J.AsoilqualityindexbasedontheequilibriumbetweensoilorganicmatterandbiochemicalpropertiesofundisturbedconiferousforestsoilsofthePacificNorthwestOriginal.SoilBiol.Biochem.2009,41,822-830.

[2]Fujii,K.；Uemura,M.；Hayakawa,C.；Funakawa,S.；Kosaki,T.Environmentalcontrolofligninperoxidase,manganeseperoxidase,andlaccaseactivitiesinforestfloorlayersinhumidAsia.SoilBiol.Biochem.2013,57,109-115.

[3]McCaig,B.C.；Meagher,R.B.；Dean,J.F.D.Genestructureandmolecularanalysisofthelaccase-likemulticopperoxidase(LMCO)genefamilyinArabidopsisthaliana.Planta.2005,221,619-636.

[4]Dittmer,N.T.；Suderman,R.J.；Jiang,H.；Zhu,Y.C.；Gorman,M.J.；Kramer,K.J.；Kanost,M.R.CharacterizationofcDNAsencodingputativelaccase-likemulticopperoxidasesanddevelopmentalexpressioninthetobaccohornworm,Manducasexta,andthemalariamosquito,Anophelesgambiae.InsectBiochemMolBiol.2004,34,29-41.

[5]Gianfreda,L.；Xu,F.；Bollag,J.M.Laccases:AUsefulGroupofOxidoreductiveEnzymes.Bioremed.J.1999,3,1-26.

[6]Alexandre,G.；Zhulin,I.B.Laccasesarewidespreadinbacteria.TrendsBiotechnol.2000,18,41-42.

[7]Rivera-Hoyos,C.M.；Morales-Alvarez,E.D.；Poutou-Pinales,R.A.；Pedroza-Rodriguez,A.M.；Rodriguez-Vazquez,R.；Delgado-Boada,J.M.Fungallaccases.FungalBiol.Rev.2013,27,67-82.

[8]Sinsabaugh,R.L.Phenoloxidase,peroxidaseandorganicmatterdynamicsofsoil.SoilBiol.Biochem.2010,42,391-404.

[9]Baldrian,P.Fungallaccases–occurrenceandproperties.FEMSMicrobiol.Rev.2006,30,215-242.

[10]Eichlerova,I.；Snajdr,J.；Baldrian,P.Laccaseactivityinsoils:Considerationsforthemeasurementofenzymeactivity.Chemosphere2012,88,1154-1160.

[11]Martins,L.G.O.；Soares,C.M.；Pereira,M.M.；Teixeira,M.；Costa,T.；Jones,G.H.；Henriques,A.O.MolecularandBiochemicalCharacterizationofaHighlyStableBacterialLaccaseThatOccursasaStructuralComponentoftheBacillussubtilisEndosporeCoat.J.Biol.Chem.2002,277,18849-18859.

[12]Volkova,N.；Ibrahim,V.；Hatti-Kaul,R.Laccasecatalysedoxidationofsyringicacid:Calorimetricdeterminationofkineticparameters.EnzymeMicrob.Tech.2012,50,233-237.

[13]Farnet,A.M.；Gil,G.；Ferré,E.EffectsofpollutantsonlaccaseactivitiesofMarasmiusquercophilus,awhite-rotfungusisolatedfromaMediterraneanschlerophyllouslitterOriginal.Chemosphere2008,70,895-900.

[14]Farnet,A.M.；Ferre,E.；Gil,G.；Gastaldi,S.Anewsubstratetomeasurelaccaseactivitiesincomplexenvironments:Applicationtolitters.SoilBiol.Biochem.2010,42,1001-1005.

[15]Terrón,M.C.；López-Fernández,M.；Carbajo,J.M.；Junca,H.；Téllez,A.；Yagüe,S.；Arana-Cuenca,A.；González,T.；González,A.E.Tannicacidinterfereswiththecommonlyusedlaccase-detectionassaybasedonABTSasthesubstrate.Biochimie.2004,86,519-522.

[16]Burns,R.G.Enzymeactivityinsoil:Locationandapossibleroleinmicrobialecology.SoilBiol.Biochem.1982,14,423–427.

[17]M.；Baldrian,P.Effectsofsoilpropertiesandmanagementontheactivityofsoilorganicmattertransformingenzymesandthequantificationofsoil-boundandfreeactivity.PlantSoil2011,338,99–110.

[18]Mishin,V.G.；JoshuaP.；Heck,D.E.；Laskin,D.L.；Laskin,J.D.ApplicationoftheAmplexred/horseradishperoxidaseassaytomeasurehydrogenperoxidegenerationbyrecombinantmicrosomalenzymes.FreeRadicalBio.Med.2010,48,1485-1491.

[19])Rodrigues,J.V.；Gomes,C.M.Enhancedsuperoxideandhydrogenperoxidedetectioninbiologicalassays.FreeRadicalBio.Med.2010,49,61-66.

[20]Votyakova,T.V.；Reynolds,I.J.DetectionofhydrogenperoxidewithAmplexRed:interferencebyNADHandreducedglutathioneauto-oxidation.Arch.Biochem.Biophys.2004,431,138-144.

[21]Zhou,M.；Diwu,Z.；Panchuk-Voloshina,N.；Haugland,R.P.AStableNonfluorescentDerivativeofResorufinfortheFluorometricDeterminationofTraceHydrogenPeroxide:ApplicationsinDetectingtheActivityofPhagocyteNADPHOxidaseandOtherOxidases.Anal.Biochem.1997,253,162-168。