一种鲫鱼脑组织细胞系及其应用

摘要

本申请公开了一种鲫鱼脑组织细胞系及其应用。本申请的鲫鱼脑组织细胞系，为鲫鱼脑组织中分离的鲫鱼脑组织细胞，鲫鱼脑组织细胞系的保藏号为CCTCC？No.C2015159。本申请的鲫鱼脑组织细胞系，填补了鲫鱼脑组织细胞系研究的空白，为感染鲫鱼的病毒提供了一种新的研究工具，特别是为以鲫鱼脑组织为靶器官的病毒的深入研究奠定了基础。

说明书

技术领域

本申请涉及鲫鱼细胞培养领域，特别是涉及一种鲫鱼脑组织细胞系及其应用。

背景技术

鲫鱼在分类上属鲤科、鲤亚科、鲫属。鲫鱼在我国各地均有分布。有两个亚种及多个变种：鲫亚种(CarassiusauratusL)和银鲫(CarassiusauratusgibelioBloch)亚种；以及红鲫、白鲫、金鱼等多个变种。在我国淡水鱼养殖业以及观赏鱼养殖业中，鲫鱼占有十分重要的地位。因此，从细胞生物学、分子生物学、形态学、遗传育种学等多方面展开对鲫鱼的研究，意义重大。

鲫鱼(CarassiusauratusLinnaeus)的脑位于顶骨的下方，由端脑、间脑、视叶、小脑和延脑五部分构成，全长约20mm，面积约160mm²，控制着鲫鱼的嗅觉、视觉、味觉和运动系统，是鲫鱼的最高中枢神经系统。同时，鲫鱼的脑组织也是多种病毒的靶器官，比如锦鲤疱疹病毒CyHV-1型、CyHV-2型、CyHV-3型均可感染鲫鱼，造成脑组织的病变。

目前从鲫鱼组织分离的细胞系仅有鲫鱼囊胚胚胎细胞(CAB)、鲫鱼鳍条细胞系，尚没有鲫鱼脑组织细胞系的相关研究和报道。但是，如前面提到的，感染鲫鱼的多种病毒都是以鲫鱼的脑组织为靶器官的；鲫鱼脑组织细胞系相关研究和报道的缺乏，极大的限制了鲫鱼病毒病症的深入研究和疫病防治。

发明内容

本申请的目的是提供一种鲫鱼脑组织细胞系及其应用。

为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：

本申请一方面公开了一种鲫鱼脑组织细胞系，该鲫鱼脑组织细胞系为鲫鱼脑组织中分离的鲫鱼脑组织细胞，鲫鱼脑组织细胞系的保藏号为CCTCCNo.C2015159。

本申请的鲫鱼脑组织细胞系中，鲫鱼脑组织细胞为上皮样的星形胶质细胞。

本申请的鲫鱼脑组织细胞系能稳定连续传代至少80代。

本申请的另一面公开了本申请的鲫鱼脑组织细胞系在鲫鱼病毒的培养和/或检测中的应用。

需要说明的是，本申请的鲫鱼脑组织细胞系，能够稳定传代，可以作为鲫鱼病毒的培养、检测的宿主细胞，以便深入的研究鲫鱼病毒，例如对鲫鱼病毒进行培养，以便后续研究，或者培养后进行检测等。本申请中，鲫鱼病毒是指感染鲫鱼的病毒，尤其包括以鲫鱼脑组织为靶器官的病毒。

本申请的还公开了本申请的鲫鱼脑组织细胞系作为研究水产动物病毒的宿主细胞的应用。以及本申请的鲫鱼脑组织细胞系在水产动物病毒的分离中的应用。

可以理解，本申请的鲫鱼脑组织细胞系虽然是主要针对鲫鱼病毒而研究的，但是，其并不仅限于作为鲫鱼病毒的宿主细胞，也可以作为其它水产动物病毒的宿主细胞，用于对水产动物病毒进行深入研究，或者培养后分离相关病毒或副产物。本申请中水产动物病毒是指对水产动物进行感染的病毒，包括但不仅限于鲫鱼病毒。

由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：

本申请的鲫鱼脑组织细胞系，填补了鲫鱼脑组织细胞系研究的空白，为感染鲫鱼的病毒提供了一种新的研究工具，特别是为以鲫鱼脑组织为靶器官的病毒的深入研究奠定了基础。

本申请的鲫鱼脑组织细胞系命名为鲫鱼脑星形胶质细胞系CAA，英文全称CarassiusAuratusAstrocyte，简称CAA。本申请的鲫鱼脑组织细胞系的保藏号为：CCTCCNo.C2015159；分类为：动物细胞系；保藏时间为：2015年9月23日；保藏单位是：中国典型培养物保藏中心；保藏地址是：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心。

附图说明

图1是本申请实施例中培养的鲫鱼脑组织细胞系的倒置相差显微镜的观察结果图；

图2是本申请实施例中鲫鱼脑组织细胞系在不同温度下的生长曲线图，图中右手边曲线末端由上到下的曲线为28℃下的生长曲线、25℃下的生长曲线、20℃下的生长曲线、15℃下的生长曲线；

图3是本申请实施例中鲫鱼脑组织细胞系的GFAP蛋白免疫荧光检测结果图；

图4是本申请实施例中鲫鱼脑组织细胞系的第80代细胞周期分布图；

图5是本申请实施例中鲫鱼脑组织细胞系表达外源基因的荧光显微镜观察结果图。

具体实施方式

感染鲫鱼的病毒中，有多种都是以鲫鱼的脑组织为靶器官的；但是，现有技术中并没有鲫鱼脑组织细胞系的相关研究和报道；这极大的限制了以鲫鱼脑组织为靶器官的病毒的研究。本申请的发明人在长期的研究和实践中，提出了该问题，并率先研究出了分离自鲫鱼脑组织中的鲫鱼脑组织细胞系，从而提出了本申请。

本申请的鲫鱼脑组织细胞系填补了鲫鱼病毒研究的空白，尤其是方便了以鲫鱼脑组织为靶器官的病毒的深入研究，为相关病毒的检测、疫病防治等奠定了基础。

此外，本申请的鲫鱼脑组织细胞系为上皮样的星形胶质细胞，具有很强的增殖能力和活性，正常的二倍体核型，对外源基因有高效率的表达，为感染鲫鱼的病毒性病原分离提供了一种新型的、稳定的、高敏感性的细胞模型，为进一步研究鲫鱼病毒的感染发病机理，提供了一种新的分子细胞水平理论研究的平台。特别是目前对鲫鱼造成极大危害的CyHV-2型病毒。

下面通过具体实施例和附图对本申请作进一步详细说明。以下实施例和附图仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。

实施例

一、鲫鱼脑组织细胞系的构建与保藏

1.组织分离

1.1培养基配置

全功能培养基：在基础培养基L-15中，依次加入20％胎牛血清、25ng/mL的人表皮生长因子、2mmol/L的L-谷氨酰胺、100IU/mL的青霉素、100μg/mL的链霉素、1％的虹鳟鱼血清。以上浓度均为各组份在全功能培养基中的终浓度，百分比为体积百分比。

PBS缓冲液：取8.00gNaCl，0.20gKCl，2.03gNa₂HPO₄·12H₂O，0.10gKH₂PO₄溶于三蒸水定容为1000mL，115℃高压灭菌20min，置于-4℃冰箱备用。

消化液：用于细胞消化传代的胰蛋白酶购自美国Sigma公司，将0.25g胰酶溶于100mL的PBS，过滤除菌，置于-20℃冰箱备用。

D-Hank’s液：取8.00gNaCl，0.40gKCl，0.13gNa₂HPO₄·12H₂O，0.06gKH₂PO₄，0.35gNaHCO₃，0.10g酚红溶入三蒸水配制成1000mL，115℃高压灭菌20min，置于-4℃冰箱备用。

本例的基础培养基L-15和胎牛血清购自GIBCO公司，人表皮生长因子、青霉素和链霉素购自Sigma公司，L-谷氨酰胺购自Merk公司，虹鳟鱼血清购自美国caissonlabs。

1.2动物和组织来源

本例采用的鲫鱼为4-5cm的幼年健康鲫鱼。先用冰块使鲫鱼进入无知觉状态，然后在75％的乙醇中浸泡10min，准备采取组织。

1.3组织分离

在无菌状态下用剪刀剪开鲫鱼顶骨，打开脑腔，用镊子小心的分离出脑组织，迅速放入事先准备好的含有1000IU/mL的青霉素和1000μg/mL的链霉素冰冷的PBS中，清洗干净；剥离脂肪组织，然后将脑组织在含有1000IU/mL的青霉素和1000μg/mL的链霉素冰冷的PBS中剪成2mm的小块，用含有1000IU/mL的青霉素和1000μg/mL的链霉素冰冷的PBS充分清洗后，放置于含有0.1％ⅩⅣ型链酶蛋白酶的消化液中，37℃振荡消化15min；消化完全的组织悬液用400目的网筛进行过滤，收集滤液，缓缓的将滤液放入无菌的25cm²细胞培养瓶中，细胞培养瓶购自美国BD公司，添加配置好的全功能培养基，定容至5mL，显微镜下观察细胞密度和状态，判断细胞的活力以及密度能否第二天铺满细胞瓶，一般采用活细胞计数法统计细胞数量，达到1×10⁶个/mL即可，随后放入细胞培养箱培养，培养温度为28℃，无需CO₂。

2.原代培养

每天观察细胞生长情况，待生长大约2～3天，可见细胞铺满细胞瓶底部，形态似铺路石状，即获得原代的鲫鱼脑组织细胞。

3.传代培养

原代细胞在大约5天左右，进入生长平台期，此时弃去旧的培养基，用2mL缓冲液D-Hank’s液(PH＝7.0)，清洗细胞，清洗完后，再加入0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA的混合消化液，消化30s左右，待到贴壁细胞变圆，细胞之间发生分离，此时用移液器吸走消化液，弃掉，细胞仍然贴在细胞瓶壁上，用全功能培养基重悬，按照1:2的比例进行传代，具体的，将一瓶的细胞消化后的细胞悬液，分成2份，1份在原瓶，另一份放入新的培养瓶内，然后2瓶分别补加全功能培养基，分别定容到5mL。获得传代脑组织细胞系。

4.细胞冻存

选取传代培养的鲫鱼脑组织细胞系中，处于指数生长期，且细胞密度达到90％以上的传代培养脑细胞。一般，培养3天可达到指数生长期，细胞密度通过显微镜观察其生长密度来判断，覆盖细胞培养瓶瓶底的90％即细胞密度达到90％。

然后再加入0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA的混合消化液，消化30s左右，待到贴壁细胞变圆，细胞之间发生分离，此时用移液器吸走消化液，弃掉。用含有1％二甲基亚砜的胎牛血清，重悬细胞，将细胞悬液加入无菌冻存管中大约每管1mL，放入程序降温盒，并置于-80℃超低温冰箱，过夜，于次日将细胞转移到液氮罐长期保存。

以上即获得本例的鲫鱼脑组织细胞系，将“4.细胞冻存”保存于液氮罐中的无菌冻存管取出，用干冰冷链寄送中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCCNo.C2015159。

5.细胞复苏

自液氮中取出保存的冻存管，迅速置于37℃水浴中融化，1500r/min离心5min，弃上清，并加入1mL上述1.1中配制的全功能培养基重悬细胞，接种到25cm²培养瓶中，放置于培养箱中28±0.2℃培养，备用。

二、鲫鱼脑组织细胞系的生态学检测

1.细胞形态观察

取细胞复苏后，指数生长期的鲫鱼脑组织细胞，在倒置相差显微镜下观察细胞形态。结果如图1所示，观察显示，细胞呈单层贴壁细胞，形态似上皮样铺路石状的星形胶质细胞，细胞之间存在接触抑制。

2.细胞生长情况

采用MTT法测定细胞的生长曲线，取生长状况良好的80代细胞，弃去培养基，用2mL缓冲液D-Hank’s液(PH＝7.0)，清洗细胞，清洗完后，加入0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA的混合消化液，消化30s左右，待到贴壁细胞变圆，细胞之间发生分离，此时用移液器吸走消化液，弃掉。加入全功能培养基，制成单细胞悬浮液，采用活细胞计数板计数，以1×10⁴个/mL均匀接种细胞于96孔细胞培养板，每孔加细胞悬液200μL，分别培养在15、20、25、28℃的培养箱中，每个温度组设5个复孔，共接种4块培养板。分别在连续孵育24小时、48小时、72小时、96小时、120小时、148小时和172小时后，测试细胞的生长情况。测试方法为，向孔中加入20μL浓度为0.5mg/mL的MTT溶液，继续孵育4h后终止培养；快速翻转培养板，弃去上清液，每孔加入150μL的二甲基亚砜(缩写DMSO)，振荡10min，使MTT蓝紫色结晶完全溶解。用酶联免疫检测仪于490nm处检测各孔的吸光值，即OD值，并以未接种细胞只加培养基孔的吸光值为空白对照调零，取5孔平均值。实验重复3次，以培养“时间”为横轴，“吸光值”为纵轴绘制细胞生长曲线。

测试结果如图2所示，可见，本例的鲫鱼脑组织细胞系在28℃培养条件下生长状态最好，细胞在贴壁生长后，第1天生长较慢，第2天生长开始加快，进入对数生长期，持续3天左右进入平台期。

3.细胞类型鉴定

取80代鲫鱼脑组织细胞系，以1×10⁵/cm²密度接种于预先放置盖玻片的6孔培养板中，其中放置有全功能培养基，培养24h后，弃掉全功能培养基，用PBS冲洗3次，然后加入4％的多聚甲醛固定15min，再用PBS冲洗，滴加2.5μL一抗，4℃孵育24h，PBS洗涤3次，再滴加2.5μL二抗，25℃避光作用30min，PBS洗涤3次，然后采用荧光显微镜观察。本例采用的荧光显微镜为ZeissAXIOOBSERVERA1倒置荧光显微镜。本例中，一抗由Rabbitanti-GFAP[ERP1034Y]ab68428溶于200μL的浓度为1％的BSA制成，其中Rabbitanti-GFAP[ERP1034Y]ab68428购自abcam公司，BSA购自GIBCO公司。二抗为羊抗兔FITC-IgG，购自Sigma公司。

观察结果如图3所示，结果显示，有绿色荧光的表达，表明本例的鲫鱼脑组织细胞系为星形胶质细胞。

4.细胞周期分析

采用第80代的鲫鱼脑组织细胞系进行细胞周期研究，将细胞转至6孔板中，其中含有全功能培养基，培养约36h左右，此时细胞处于指数生长期，形成70％～80％的汇合层。弃去培养基，用2mL缓冲液D-Hank’s液(PH＝7.0)，清洗细胞，清洗完后，加入0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA的混合消化液，消化30s左右，待到贴壁细胞变圆，细胞之间发生分离，此时用移液器吸走消化液，弃掉。加入全功能培养基，制成单细胞悬浮液；室温下1000r/min离心5min，收集沉淀，用PBS洗2次，1000r/min离心5min，收集沉淀。先用20～50μl/ml的杜氏磷酸盐缓冲液(缩写D-PBS)将细胞沉淀充分打散成单个细胞，用4℃预冷的70％冰乙醇1mL重悬，4℃过夜，采用CytomicsFC500BeckmanCoulter型号的流式细胞仪进行细胞周期检测。

检测结果如图4所示，可见，本例的鲫鱼脑组织细胞系核型正常，为二倍体。测试结果显示，鲫鱼脑组织细胞系在G1期的DNA含量占51.36％，在S期的DNA含量占32.62％，G2期为12.38％，G2/G1为1.91，表明鲫鱼脑组织细胞系增殖活力旺盛，且为正常的二倍体细胞。

三、外源基因在鲫鱼脑组织细胞系中的表达

采用LONZA4D电转仪转染方法，取80代鲫鱼脑细胞星形胶质细胞系，以1×10⁴/cm²密度接种于96孔板中，待细胞生长36h后，即贴壁稳定生长，采用3中的传代方法，在原细胞生长孔，将细胞消化制成细胞悬液，然后吸出放于LONZA4D电转仪专用电转板条内，每个孔对应相应的电转板条孔，根据SECellLine4D-NucleofectorXKit)说明书，配置电转液，试剂盒中soulution16.4μL与supplement3.6μL混合，制成电转混合液，即每孔用量，将此混合液加入电转板条中一个孔的细胞悬液中，每孔加入0.1μgGFP质粒，采用EN-150电转程序进行转染，转染完成后，将细胞悬液放入96孔板中，置于28℃培养箱培养2～3天，然后在荧光显微镜下观察转染情况。

结果如图5所示，可见，有30％的细胞表达较强的绿色荧光，说明外源基因可以在鲫鱼脑组织细胞系中稳定高效表达。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本申请的保护范围。