烈性传染病病原体检测引物组及试剂盒

摘要

本发明公开了烈性传染病病原体检测引物组及试剂盒，引物组包括埃博拉病毒、拉萨热病毒、马尔堡病毒、裂谷热病毒、黄热病毒和基孔肯雅热病毒中的至少一组RT-LAMP引物。本发明的引物体系，减少了扩增反应背景，灵敏度和特异性都非常好。由引物组构成的试剂盒，还包括检测液和微流控芯片，检测液体系省略了单独的RT-PCR的二次扩增步骤，缩短了检测时间，且没有核酸的变复性过程，减少了RNA酶和扩增核酸的污染机会，提高了检测的敏感性和安全性。微流控芯片系统提供的等温封闭环境，最终实现提取核酸模板的快速等温扩增及自动化结果判别，降低了对实验硬件的要求，减少了反应试剂用量，降低了检测成本，结果可直接通过颜色变化判定。

说明书

技术领域

本发明涉及烈性传染病病原体检测技术领域，特别是烈性传染病病原体检测引物组及试剂盒。

背景技术

2014年西非地区爆发了有史以来最为严重的埃博拉疫情，并第一次走出非洲，扩散至欧美等发达国家，造成11000多人死亡。中非友谊源远流长，经济贸易和文化交流频繁密切，因此，埃博拉疫情输入的风险很大。疫情发生后，中国政府不仅第一时间向非洲国家提供了大量物资和技术援助，还专门派出了医疗卫生专家，组成检测队和医疗队帮助当地对抗埃博拉疫情。

拉萨热(Lassafever)是发生在西非的一种病程1-4周的人畜共通疾病。其病源体为拉萨热病毒，因治疗难度和传染性被列为生物安全第四级(BiosafetyLevel4)病毒。此病毒为一种属于沙粒病毒科的单链核糖核酸(RNA)病毒。在几内亚、利比里亚、塞拉利昂和尼日利亚部分地区流行，但在其它西非国家也可能存在。

马尔堡出血热(Marburghemorrhagicfever)是由来自与引起埃博拉出血热的病毒同一科的一种病毒即马尔堡病毒引起的严重高致命性疾病。这些病毒属于已知感染人的最烈性病原体。

裂谷热(riftvalleyfever)是由裂谷热病毒引起的，经蚊类媒介或接触传播的急性病毒性感染病。临床上以发热、头痛、肌痛、衰竭、畏光及白细胞减少为特征。

黄热病(yellowfever)是黄热病毒所致的急性传染病，主要经伊蚊传播。重型患者有发热、黄疸和蛋白尿等。主要媒介在城市是埃及伊蚊，在农村为趋血蚊和非洲伊蚊，传播途径是经蚊的叮咬。

基孔肯雅热是由基孔肯雅病毒(CHIKV，为单股RNA病毒)引起，经伊蚊传播，以发热、皮疹及关节疼痛为主要特征的急性传染病。

发展针对埃博拉病毒等多种烈性传染病病原的快速检测技术是及时发现传染源，实施及时有效隔离和对症治疗的关键。目前主要采用荧光定量PCR技术进行检测，优点是快速、检测结果较准确，但荧光定量PCR技术操作比较繁琐，需要依赖不便于携带的大型仪器，这不利于在现场条件下开展检测。此外，对于与埃博拉病毒感染症状相似的病原体所致感染需要再次确诊，才能够得到有效救治。所以对于病源检测的灵敏度和特异性等具有较高要求。

发明内容

本发明是针对生物防控及新发突发传染病防控等领域特殊病原体的现场快速多通道检测的迫切需求而研发的，目的在于提供一种针对上述烈性传染病病原体的检测引物组，以及包括该引物组的试剂盒，能够方便快速且准确地检出样本中的病原体种类，特异性和灵敏度极佳。

本发明提供的烈性传染病病原体检测引物组，包括埃博拉病毒RT-LAMP引物、拉萨热病毒RT-LAMP引物、马尔堡病毒RT-LAMP引物、裂谷热病毒RT-LAMP引物、黄热病毒RT-LAMP引物和基孔肯雅热病毒RT-LAMP引物中的至少一种；具体核苷酸序列如下：

埃博拉病毒RT-LAMP引物：

Ebov-F3：SEQIDNO：1，

Ebov-B3：SEQIDNO：2，

Ebov-FIP：SEQIDNO：3，

Ebov-BIP：SEQIDNO：4；

拉萨热病毒RT-LAMP引物：

Lassa-F3：SEQIDNO：5，

Lassa-B3：SEQIDNO：6，

Lassa-FIP：SEQIDNO：7，

Lassa-BIP：SEQIDNO：8，

Lassa-LF：SEQIDNO：9，

Lassa-LB：SEQIDNO：10；

马尔堡病毒RT-LAMP引物：

Marburg-F3：SEQIDNO：11，

Marburg-B3：SEQIDNO：12，

Marburg-FIP：SEQIDNO：13，

Marburg-BIP：SEQIDNO：14，

Marburg-LF：SEQIDNO：15，

Marburg-LB：SEQIDNO：16；

裂谷热病毒RT-LAMP引物：

RVFV-F3：SEQIDNO：17，

RVFV-B3：SEQIDNO：18，

RVFV-FIP：SEQIDNO：19，

RVFV-BIP：SEQIDNO：20，

RVFV-LF：SEQIDNO：21，

RVFV-LB：SEQIDNO：22；

黄热病毒RT-LAMP引物：

yellowfever-F3：SEQIDNO：23，

yellowfever-B3：SEQIDNO：24，

yellowfever-FIP：SEQIDNO：25，

yellowfever-BIP：SEQIDNO：26，

yellowfever-LF：SEQIDNO：27，

yellowfever-LB：SEQIDNO：28；

基孔肯亚热病毒RT-LAMP引物：

CHIK-F3：SEQIDNO：29，

CHIK-B3：SEQIDNO：30，

CHIK-FIP：SEQIDNO：31，

CHIK-BIP：SEQIDNO：32。

本发明针对上述烈性传染病病原的相对保守序列分别设计相应的RT-LAMP引物，其中包括两条外引物(F3、B3)和两条内引物(FIP、BIP)，两条环结合引物(LB、LP)。扩增反应只有在六条引物完全与识别的靶序列中八个结合区匹配的情况下才能顺利进行，所有这些特性都在很大程度上减少了扩增反应的背景，从而使检测特异性得到改善。

本发明提供的一种烈性传染病病原体检测试剂盒，其包括以上所述的烈性传染病病原体检测引物组。

优选地，上述烈性传染病病原体检测试剂盒，还包括检测液，所述检测液中包括LAMP缓冲液、dNTPs、有链置换特性的DNA聚合酶、反转录酶、Betaine、MgSO₄、HNB和ddH₂O。

Betaine又称甜菜碱，三甲铵乙内酯，本发明检测液中加入Betaine用以调节解链温度。

HNB即羟基萘酚蓝，羟基萘酚蓝是一种钙镁离子指示剂，在反应中镁离子与dNTP反应形成焦磷酸镁，消耗镁离子，羟基萘酚蓝会从紫罗兰色变为蓝色。检测液中加入反转录酶，省略了单独的RT-PCR的二次扩增步骤，只需一步就可完成实验操作，没有核酸的变复性过程，减少了RNA酶和扩增核酸的污染机会，提高了检测的敏感性和安全性，同时RT-PCR也缩短了检测所需的时间。

优选地，上述烈性传染病病原体检测试剂盒中，检测液中各成分的浓度为：

优选地，以上任一所述的烈性传染病病原体检测试剂盒，还包括用于现场检测的微流控芯片，该芯片包括封接在一起的基板和盖片，基板上设有多个检测单元，每个检测单元由依次连通的进样通道、反应池和连接通道组成，盖片上设有进样孔和排气孔，进样孔对应于进样通道的末端(即进样通道远离反应池的一端)，排气孔对应于连接通道的末端(即连接通道远离反应池的一端)，排气孔的内部或表面有疏水透气介质。

其中，微流控芯片的材料可以为多种，例如高分子化合物、金属、玻璃、石英、硅、陶瓷、高分子化合物、橡胶和硅铝酸盐化合物等，而以聚碳酸酯、聚丙烯或聚乙烯醇等高分子材料为最佳，附着效果最好。疏水透气介质可以是聚四氟乙烯、聚偏氟乙烯或聚丙烯等。

优选地，上述烈性传染病病原体检测试剂盒中，所述反应池中附着有权利要求1所述的烈性传染病病原体检测引物组，一个反应池对应于一种病毒的RT-LAMP引物。

优选地，上述烈性传染病病原体检测试剂盒中，一个反应池内的RT-LAMP引物量为：F3与B3均5pmol，BIP与FIP均40pmol，LP与LB均20pmol。

本发明还提供了以上所述烈性传染病病原体检测试剂盒的使用方法，是将待检测样品提取RNA，与检测液混合后，滴入进样孔，待其移动到各个反应池后用不透水不透气的封口膜封住进样孔和排气孔，将芯片在63℃环境下反应1小时，然后85℃灭活5分钟，结束反应；肉眼观察反应池中颜色变化，仍然未紫罗兰色的为阴性，从紫罗兰色变为天蓝色的为阳性。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

首先，引物设计恰当与否直接影响到LAMP的特异性和灵敏度，是LAMP反应的关键所在，也是整个体系的设计难点所在。本发明的引物体系，减少了扩增反应背景，使得灵敏度和特异性都非常好，实验验证其最低检出限能够达到1拷贝。

第二，检测液体系省略了单独的RT-PCR的二次扩增步骤，只需一步就可完成实验操作，缩短了检测时间，且没有核酸的变复性过程，减少了RNA酶和扩增核酸的污染机会，提高了检测的敏感性和安全性。

第三，利用微流控芯片和环介导等温扩增技术(LAMP法)，采用微流控芯片检测系统提供的等温、封闭环境和计算机识别软件，最终实现提取核酸模板的快速等温扩增及自动化结果判别。所有的扩增过程都可在63℃同温下完成，引入微流控芯片技术，降低了对实验硬件的要求，通过减少反应试剂用量来降低检测成本，颜色反应可以肉眼直接判定检测结果，无需电泳，无需PCR等复杂仪器。检测所需样本量极少，能够进行大批量同时检测，检测效率高。

附图说明

图1为实施例1载有埃博拉病毒检测液微流控芯片上样后的显色结果；

图2为实施例1不同浓度埃博拉病毒质粒的浊度仪检测曲线；

图3为实施例1利用微流控芯片检测不同浓度埃博拉病毒质粒的结果；

图4为实施例2载有拉萨热病毒检测液微流控芯片上样后的显色结果；

图5为实施例2不同浓度拉萨热病毒质粒的浊度仪检测曲线；

图6为实施例2利用微流控芯片检测不同浓度拉萨热病毒质粒的结果；

图7为实施例3载有马尔堡病毒检测液微流控芯片上样后的显色结果；

图8为实施例3不同浓度马尔堡病毒质粒的浊度仪检测曲线；

图9为实施例3利用微流控芯片检测不同浓度马尔堡病毒质粒的结果；

图10为实施例4载有黄热病毒检测液微流控芯片上样后的显色结果；

图11为实施例4不同浓度黄热病毒质粒的浊度仪检测曲线；

图12为实施例4利用微流控芯片检测不同浓度黄热病毒质粒的结果；

图13为实施例5载有基孔肯亚热病毒检测液微流控芯片上样后的显色结果；

图14为实施例5不同浓度基孔肯亚热病毒质粒的浊度仪检测曲线；

图15为实施例5利用微流控芯片检测不同浓度基孔肯亚热病毒质粒的结果。

图中，1为阴性对照，2为埃博拉质粒样本，3为拉萨热质粒样本，4为马尔堡质粒样本，5为裂谷热质粒样本，6为黄热病质粒样本，7为基孔肯雅热质粒样本，8为空白，V1～V7代表样本质粒浓度，其中V1：10⁵拷贝/μL，V2：10⁴拷贝/μL，V3：10³拷贝/μL，V4：10²拷贝/μL，V5：10¹拷贝/μL，V6：10⁰拷贝/μL，V7：0拷贝/μL，V8：阴性对照。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。

所有引物的具体序列见表1

表1.五种烈性传染病病原体(埃博拉病毒、拉萨热病毒、马尔堡病毒、裂谷热病毒、黄热病毒和基孔肯亚热病毒)基因的RT-LAMP的引物序列

图1展示了本发明所述的微流控芯片大致结构，该芯片包括基板和盖片(均为透明的PMMA材质，作为商品使用时基板和盖片是封接在一起的)，基板上设有多个检测单元，每个检测单元由依次连通的进样通道、反应池和连接通道组成，盖片上设有进样孔和排气孔(图1中排气孔被封口膜挡住了，箭头示意封口膜下面为排气孔)，进样孔对应于进样通道的末端(图1的芯片，多个进样通道汇总成一个总进样通道，总进样通道与进样孔连通)，排气孔对应于连接通道的末端，排气孔的内部或表面有疏水透气介质(图中未示出)。

实施例中使用的病毒核酸均来自于西非现场检测提取的病人样本冻干粉末与人血混合制成模拟样本。

使用Qiagen试剂盒提取分别含有上述六种病毒RNA的模拟样本中的核酸，于上海生工生物科技有限公司分别合成含有埃博拉病毒基因组的质粒(以下简称埃博拉质粒)、含有马尔堡病毒基因组的质粒(以下简称马尔堡质粒)、含有裂谷热病毒基因组的质粒(以下简称裂谷热质粒)、含有黄热病毒基因组的质粒(以下简称黄热病质粒)和含有基孔肯雅热病毒基因组的质粒(以下简称基孔肯雅热质粒)并纯化测序，利用Promega大规模RNA制备试剂盒制备其RNA，与血液混合制成模拟样本，并将模拟样本使用Qiagen试剂盒提取核酸。

样本包括：阴性对照(去离子水)，埃博拉质粒，拉萨热质粒、马尔堡质粒、裂谷热质粒、黄热病质粒、基孔肯雅热质粒，空白(不添加任何物质，空白反应池用于表示本底)。

实施例1：埃博拉引物的特异性与灵敏度

试剂盒中埃博拉病毒检测液具体成分及用量如下表所示：

取各样本1μL，加入到反应液中，封闭，反应条件：63℃水浴1h。85℃，5min灭活中止反应，观察颜色变化，结果如图1所示，在含有埃博拉引物的检测液中，只有对应的埃博拉反应池变为天蓝色(图1中的2)，而其他均为紫罗兰色。

浊度仪检测：使用Qiagen试剂盒提取上述埃博拉质粒模拟样本中的核酸，并按照10倍梯度稀释(V1：10⁵拷贝/μL，V2：10⁴拷贝/μL，V3：10³拷贝/μL，V4：10²拷贝/μL，V5：10¹拷贝/μL，V6：10⁰拷贝/μL，V7：0拷贝/μL，V8：阴性对照)，建立如下扩增反应体系：1μL核酸样本、2.5μLBstDNA聚合酶缓冲液、1μLBstDNA聚合酶(8U/μL)、1μLAMV反转录酶(10U/μL)、25μLdNTP(10mmol/L)、8μLBetaine(250mmol/L)、1μLMgSO₄(150mmol/L)、1μLHNB(2.4mmol/L)，对应于被测基因的四条引物各1μL(引物浓度为F3与B3：5pmol/μL、BIP与FIP：40pmol/μL)、1μLddH₂O。混匀，63℃，于浊度仪上反应1h，85℃，5min灭活中止反应，结果如图2所示。

取上述梯度浓度的核酸，在上述试剂盒中埃博拉病毒检测液进行检测，结果如图3所示，结果表明，芯片检测结果与浊度仪的一致，最低检出限为1拷贝。

实施例2：拉萨热引物的特异性与灵敏度

试剂盒中拉萨热病毒检测液具体成分及用量如下表所示：

微流控芯片里的反应液全部为上述拉萨热病毒检测液。

取样本1μL，加入到反应液中，封闭，反应条件：63℃水浴1h。85℃，5min灭活中止反应，观察颜色变化，结果如图4所示，在含有萨拉热引物的检测液中，只有对应的萨拉热反应池变为天蓝色(图4中的3)，而其他均为紫罗兰色。

浊度仪检测：使用Qiagen试剂盒提取上述模拟样本拉萨热质粒中的核酸，并按照10倍梯度稀释(V1：10⁵拷贝/μL，V2：10⁴拷贝/μL，V3：10³拷贝/μL，V4：10²拷贝/μL，V5：10¹拷贝/μL，V6：10⁰拷贝/μL，V7：0拷贝/μL，V8：阴性对照)，建立如下扩增反应体系：1μL核酸样本、2.5μLBstDNA聚合酶缓冲液、1μLBstDNA聚合酶(8U/μL)、1μLAMV反转录酶(10U/μL)、2.5μLdNTP(10mmol/L)、8μLBetaine(250mmol/L)、1μLMgSO₄(150mmol/L)、1μLHNB(2.4mmol/L)，对应于被测基因的四条引物各1μL(引物浓度为F3与B3：5pmol/μL、BIP与FIP：40pmol/μL)、1μLddH₂O。混匀，63℃，于浊度仪上反应1h，85℃，5min灭活中止反应，结果如图5所示。同时使用上述梯度浓度的样本在上述试剂盒中拉萨热病毒检测液进行检测，结果如图6所示，结果表明，芯片检测结果与浊度仪的一致，该方法的最低检出限为1拷贝。

实施例3：马尔堡病毒引物特异性与敏感性

试剂盒中马尔堡病毒检测液具体成分及用量如下表所示：

微流控芯片的反应池中均使用上述马尔堡病毒检测液，检测方法与实施例1相同，结果见图7，只有对应的马尔堡病毒模板的反应池有颜色变化(图7中的4)，而其他均为紫罗兰色。

浊度仪检测：使用Qiagen试剂盒提取上述马尔堡质粒模拟样本中的核酸，并按照10倍梯度稀释(V1：10⁵拷贝/μL，V2：10⁴拷贝/μL，V3：10³拷贝/μL，V4：10²拷贝/μL，V5：10¹拷贝/μL，V6：10⁰拷贝/μL，V7：0拷贝/μL，V8：阴性对照)，建立如下扩增反应体系：1μL核酸样本、2.5μLBstDNA聚合酶缓冲液、1μLBstDNA聚合酶(8U/μL)、1μLAMV反转录酶(10U/μL)、2.5μLdNTP(10mmol/L)、8μLBetaine(250mmol/L)、1μLMgSO₄(150mmol/L)、1μLHNB(2.4mmol/L)，对应于被测基因的四条引物各1μL(引物浓度为F3与B3：5pmol/μL、BIP与FIP：40pmol/μL)、1μLddH₂O。混匀，63℃，于浊度仪上反应1h，85℃，5min灭活中止反应，结果如图8所示，同时使用上述梯度稀释的样本在上述试剂盒中拉萨热病毒检测液进行检测，结果图9所示，芯片结果与浊度仪一致，该方法的最低检出限为1拷贝。

实施例4：黄热病毒引物特异性与敏感性

试剂盒中黄热病毒检测液具体成分及用量如下表所示：

微流控芯片的反应池中均使用上述黄热病毒检测液，检测方法与实施例1相同，结果见图10，只有对应的黄热病毒模板的反应池有颜色变化(图10中的4)，而其他均为紫罗兰色。

浊度仪检测：使用Qiagen试剂盒提取上述黄热病质粒模拟样本中的核酸，并按照10倍梯度稀释(V1：10⁵拷贝/μL，V2：10⁴拷贝/μL，V3：10³拷贝/μL，V4：10²拷贝/μL，V5：10¹拷贝/μL，V6：10⁰拷贝/μL，V7：0拷贝/μL，V8：阴性对照)，建立如下扩增反应体系：1μL核酸样本、2.5μLBstDNA聚合酶缓冲液、1μLBstDNA聚合酶(8U/μL)、1μLAMV反转录酶(10U/μL)、2.5μLdNTP(10mmol/L)、8μLBetaine(250mmol/L)、1μLMgSO₄(150mmol/L)、1μLHNB(2.4mmol/L)，对应于被测基因的四条引物各1μL(引物浓度为F3与B3：5pmol/μL、BIP与FIP：40pmol/μL)、1μLddH₂O。混匀，63℃，于浊度仪上反应1h，85℃，5min灭活中止反应，结果如图11所示，同时使用上述梯度稀释的样本在上述试剂盒中黄热病毒检测液进行检测，结果图12所示，对应芯片上的结果，其结果一致。

实施例5：基孔肯亚热病毒引物特异性与敏感性

试剂盒中基孔肯亚热病毒检测液具体成分及用量如下表所示：

微流控芯片的反应池中均使用上述基孔肯亚热病毒检测液，检测样本与方法与实施例1相同，结果见图13，只有对应的基孔肯亚热病毒模板的反应池有颜色变化(图13中的5)，而其他均为紫罗兰色。

浊度仪检测：使用Qiagen试剂盒提取上述基孔肯亚热病毒质粒模拟样本中的核酸，并按照10倍梯度稀释(V1：10⁵拷贝/μL，V2：10⁴拷贝/μL，V3：10³拷贝/μL，V4：10²拷贝/μL，V5：10¹拷贝/μL，V6：10⁰拷贝/μL，V7：0拷贝/μL，V8：阴性对照)，建立如下扩增反应体系：1μL核酸样本、25μLBstDNA聚合酶缓冲液、1μLBstDNA聚合酶(8U/μL)、1μLAMV反转录酶(10U/μL)、2.5μLdNTP(10mmol/L)、8μLBetaine(250mmol/L)、1μLMgSO₄(150mmol/L)、1μLHNB(2.4mmol/L)，对应于被测基因的四条引物各1μL(引物浓度为F3与B3：5pmol/μL、BIP与FIP：40pmol/μL)、1μLddH₂O。混匀，63℃，于浊度仪上反应1h，85℃，5min灭活中止反应，结果如图14所示，同时使用上述梯度稀释的样本在上述试剂盒中黄热病毒检测液进行检测，结果图15所示，对应芯片上的结果，其结果一致，基孔肯雅热病原的检测方法最低检出限为10拷贝。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

SEQUENCELISTING

<110>中国人民解放军疾病预防控制所

<120>烈性传染病病原体检测引物组及试剂盒

<130>P20150248

<160>32

<170>PatentInversion3.5

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<213>埃博拉病毒

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<210>28

<211>24

<212>DNA

<213>黄热病毒

<400>28

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<210>29

<211>20

<212>DNA

<213>基孔肯亚热病毒

<400>29

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<210>30

<211>19

<212>DNA

<213>基孔肯亚热病毒

<400>30

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<210>31

<211>42

<212>DNA

<213>基孔肯亚热病毒

<400>31

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<210>32

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<212>DNA

<213>基孔肯亚热病毒

<400>32

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