一种利用两步扩增法检测MicroRNA的方法

摘要

本发明涉及一种利用滚环扩增-环介导等温扩增两步扩增法检测MicroRNA的方法。首先设计一个以目标microRNA为环化连接探针的线性滚环扩增模板，并以该线性滚环扩增模板为引物进行滚环扩增，实现信号的第一步放大；然后将滚环扩增产物用限制性内切酶切割成相同的短单链，以这些短单链为模板进行环介导扩增，实现信号的第二步放大。环介导等温扩增的扩增过程由实时荧光定量PCR监测，扩增的样品中加入DNA显色剂，当扩增的DNA产物增多时，DNA显色剂的荧光增强，其荧光信号被实时荧光定量PCR采集和输出。本发明采用两步扩增法放大microRNA的信号，是一种低背景高灵敏度的检microRNA的方法。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学和核酸化学领域，涉及一种利用滚环扩增-环介导等温扩 增两步扩增法检测MicroRNA的方法。

背景技术

微小RNA（microRNAs）是一种约21-23个碱基的内源非编码小RNA，长度约为21-22 个核苷酸，其长度变化范围也可以从19到25个核苷酸不等。MicroRNA在体内一般是由两步 酶解过程产生，最原始的是pri-microRNA，长度大约为300~1000个碱基；pri-microRNA经过 一次加工后，成为pre-microRNA即microRNA前体，长度大约为70~90个碱基；pre-microRNA 再经过Dicer酶酶切后，成为长约20~24nt的成熟microRNA。具体原理如下：pri-microRNA经 过Drosha酶消化得到一个茎-环结构的pre-microRNA，Drosha酶存在于细胞核中，而Drosha 催化的酶切过程也常在细胞的这一区域进行。Exportin5蛋白将pre-microRNA从核中转运 至细胞质。随后pre-microRNA被Dicer酶在细胞质中剪切得到双链RNA，解链后成为成熟的 microRNA。MicroRNA对靶基因mRNA的作用有三种方式:（1）切断靶基因的mRNA分子；（2）抑制 靶基因mRNA的翻译；（3）结合抑制。研究发现microRNA可以作为重要的疾病标志物，大量研 究证实其与多种重大疾病息息相关，在很多疾病的早期阶段，microRNA谱会有特征性的异 常。因此如果能够在microRNA变异的早期能够及时地加以检测，将会大大有助于重大疾病 的早期预警、早期诊断以及预后治疗。并且想要进一步确定microRNA在基因调控中的重要 地位，关键是要迅速、准确地定量检测microRNA。

目前检测MicroRNA的方法比较成熟主要有Northern印迹分析、微点阵 （microarray）分析和实时定量荧光PCR（quantitativeReal-TimePCR）。Northern印迹分 析和微点阵（microarray）需要的样品大、检出限高、线性范围窄、分析周期长、特异性差，已 经不能满足现代分析要求。实时定量PCR较前两者而言有明显优势，需要样品量少、检出限 较低、线性范围宽，分析时间相对缩短，特异性高，已成为一种定量MicroRNA的标准方法。随 着时代发展，这三种检测手段均已不能满足人类需求，对于实际样品的分析检测亟需更灵 敏的检测手段。滚环扩增（RCA，rollingcircleamplification）是90年代中期发展出一种 新的核酸等温扩增方法，能实现10⁵-10⁹倍的扩增效率。环介导等温扩增（loop-mediated isothermalamplification，LAMP）技术是2000年日本学者提出的一种适用于基因诊断的 恒温核酸扩增技术，能实现10⁹～10¹⁰倍的核酸扩增效率，目前已发展成为成熟的疾病检测 技术。而我们的实验则是运用一种巧妙的方法将滚环扩增技术和环介导等温扩增技术相结 合，以期实现MicroRNA的超灵敏检测。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种microRNA特异性的超灵敏低背景的利 用滚环扩增和环介导等温扩增两步扩增法检测microRNAs的方法。

本发明的技术方案具体如下：

一种利用两步扩增法检测microRNA的方法，包括以下步骤：首先设计含有限制性内切 酶位点的线性滚环扩增模板，以目标microRNA为连接探针将线性滚环扩增模板连接成环， 并以成环的滚环扩增模板为引物进行滚环扩增，实现信号的第一步放大；然后将滚环扩增 产物用限制性内切酶切割成相同的短单链，以上述短单链为模板进行环介导扩增，实现信 号的第二步放大。

上述利用两步扩增法检测microRNA的方法具体包括以下步骤：

（1）首先针对目标microRNA设计一个5’端磷酸化修饰的线性滚环扩增模板，所述的线 性滚环扩增模板包括三个区段：与目标microRNA一端互补的5’端区段、与目标microRNA其 余片段互补的3’端区段及含有一个限制性内切酶位点的中间区段；

（2）模板环化过程：向含目标microRNA的体系中加入DNA连接酶和5’端磷酸化修饰的线 性滚环扩增模板，目标microRNA与5’端磷酸化修饰的线性滚环扩增模板碱基互补配对使5’ 端磷酸化修饰的线性滚环扩增模板首尾相连，得到成环的滚环扩增模板；

（3）滚环扩增过程：以成环的滚环扩增模板为引物进行滚环扩增，得到滚环扩增产物；

（4）切割过程：用限制性内切酶将滚环扩增产物切割成若干个完全相同的短单链；

（5）环介导等温扩增过程：以步骤（4）所述的短单链为模板进行环介导等温扩增，然后 向环介导等温扩增产物中加入DNA显色剂，并用实时荧光定量PCR采集和分析扩增信号。

步骤（1）中所述的限制性内切酶位点为EcoRI酶的酶切位点。

步骤（1）中所述的含有一个限制性内切酶位点的中间区段为21nt。

步骤（2）所述的模板环化过程具体为：向含目标microRNA的体系中加入DNA连接酶 缓冲液和5’端磷酸化修饰的线性滚环扩增模板，22~37℃放置0.5~1小时；然后再加入DNA连 接酶，16~37℃连接2~24小时，65℃灭活15min。

步骤（3）所述的滚环扩增过程具体为：向体系中加入dNTP和DNA聚合酶，37℃扩增 4-6h，80℃灭活15min。

步骤（4）所述的切割过程具体为：向体系中加入与中间区段互补的限制性内切酶 互补序列，加水稀释，95℃退火1个小时，最后加入限制性内切酶，37℃酶切12~24小时，80℃ 灭活15min。

步骤（5）所述的环介导等温扩增过程具体为：将环介导等温扩增的四种引物、扩增 缓冲液加入到步骤（4）得到的短单链中，95℃加热5min，接着骤冷到4℃；接着加入dNTP、 DNA聚合酶、DNA显色剂，然后用超纯水定容，立即在实时荧光定量PCR上面65℃实时监控；根 据出峰时间或者“S”曲线的拐点的时间，进行定量或者定性分析。

本发明的检测原理如图1所示，含目标microRNA的体系中加入线性滚环扩增模板 和DNA连接酶，滚环扩增模板的两端分别与部分的microRNA互补配对，并且模板的5端是磷 酸基团修饰，滚环扩增模板在DNA连接酶的作用下与作为连接探针的目标microRNA连接成 环，接着以成环的滚环扩增模板作为引物，在DNA聚合酶的作用下进行滚换扩增，实现信号 的一级放大。

滚环扩增是以环状DNA为模板，通过一个短的DNA引物（与部分环状模板互补），在 酶催化下将dNTPs转变成单链DNA，此单链DNA包含成百上千个重复的模板互补片段。因此以 成环的滚环扩增模板为引物扩增出来的产物是一条包含成百上千个重复的环状DNA模板序 列的长单链DNA。我们在线性滚环扩增模板上设计了一个限制性内切酶位点，在其与互补序 列互补之后可被限制性内切酶切割断裂。

我们的第二部分实验就是将第一次滚环扩增得到的长单链DNA切割成相同的短单 链DNA，并以切割产生的短单链DNA为第二步扩增环介导等温扩增的模板，进行信号的二级 放大，此步的信号由实时荧光定量PCR接收和分析。

本发明具有以下优点和有益效果：

本发明中滚环扩增模板的设计可以根据不同的microRNA序列设计特定的模板，达到检 测不同种类的microRNA的检测的目的。本发明的检测方法具有很低的检出限，可以检测到 浓度低至500aM的microRNA，较同等条件下单步滚环扩增的检出限200pM而言，检出限降 低了很多。并且，对从Hela细胞中提取的总RNA进行分析，即使存在各种RNA干扰，对 microRNA21依然有很好的检出能力，说明本发明的实验方法具有良好的抗干扰能力，选择 性好。

附图说明

图1为利用滚换扩增和环介导等温扩增两部扩增法检测microRNA流程示意图。

图2为温度条件优化图；从左到右依次代表55^oC、60^oC、65^oC。

图3为DNA聚合酶浓度条件优化图；从左到右依次代表DNA聚合酶的浓度为0.5 U、0.25U、0.125U、0U。

图4、图5为体外检出限测定图。

图6、图7为单步滚环扩增检出限图。

图8、图9为实际样品检出限图。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。为了以示区分，将滚 环扩增模板与目标microRNA聚合所用的DNA聚合酶称为DNA聚合酶1，环介导等温扩增反应 中所用的DNA聚合酶称为DNA聚合酶2。

实施例1

1.本发明中滚环扩增模板、限制性内切酶切割位点的互补序列以及环介导等温扩增的 四条引物的设计

（1）如图1所示，DNA由sangon公司合成，滚环扩增模板为针对microRNA21序列（5’- uagcuuaucagacugauguuga-3’）所设计，microRNA21是一种重要的肿瘤标志物。滚环扩增的 模板包括三个部分，5’端和3’端分别和一半的microRNA互补区，该区域负责识别相应的 microRNA，形成DNA-RNA杂交的双链结构并且将滚环扩增模板首尾相连成环，模板的5’端为 磷酸化修饰。滚环扩增模板的序列为5’-PO₄-CTGATAAGCTACGACTCTAGAGGATCCCCG GGTACGTTTCCGTGTGTAAATTGTTATCCGCTCACATCTCCACACAAGTAACCTCTATG ATATCGAATTCTCGCTCCAAACGCTGCAGGTGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACCGATT AAGATAGCTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGATCAACATCAGT-3’；限制性 内切酶的切割位点选取为EcoRI酶的酶切位点，设计的限制性内切酶的切割序列为一段与 滚环扩增模板互补的21nt的单链DNA，序列为ATGATATCTGAATTCTCGCTC。依据滚换扩 增的产物切割生成的环介导等温扩增的模板序列（短单链）设计了4条环介导等温扩增的引 物：引物1：CTCGCTCCAAACGCTGCAGGT，引物2：TCAACGTCGTGACTGGGAAAACCC TTTTTGTGCGGGCCTCTTCGCTATTAC，引物3：AATTCAGATATCATAGAGGTTACTTGT GTGG，引物4：CGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACTTTTAGATGTGAGCGGATAACAAT TTACACAC。

（2）所需达到的检测目标：对于相应目标microRNA，该方法能检测的检出限低。

2.实验条件的优化

为了反应达到更低的检出限，本发明首先对环介导等温扩增实验中BstDNA酶的用量 和扩增反应的温度进行优化。

（1）反应温度的优化

环介导等温扩增反应是在1×DNA聚合酶2缓冲液中进行的，该缓冲液中包含20mM Tris-HCl(pH8.8)，10mM(NH₄)₂SO₄，2mMMgSO₄,10mMKCl,0.1%TritonX-100。首 先在样品中加入不同浓度的引物，引物1和引物3的终浓度为100nM，引物2和引物4的终浓 度为3μM，LAMP模板浓度为10pM，加入超纯水补全总体积为8.5μL，95℃加热5分钟，接着 骤冷至4℃；然后加入500μMdNTP、0.2μL20×DNA显色剂和0.3UDNA聚合酶2，分别在55 ℃、60℃、65℃温度下反应2小时；最后，将反应产物进行12%中性聚丙烯酰胺凝胶电泳，比较 反应进行程度。

（2）酶用量的优化

按照温度优化部分的配样方式，在扩增前加入不同量（0.5U、0.25U、0.125U）的DNA 聚合酶，65℃反应两小时。最后，将反应产物进行12%中性聚丙烯酰胺凝胶电泳，比较反应进 行程度。

3.检出限

连接成环反应中，125nM滚环扩增模板、不同浓度的microRNA21（100fM、10fM、1fM 和500aM），10×DNA连接酶缓冲液（400mMTris-HCl，pH7.6，100mMMgCl₂，100mMDTT， 2.5mMATP），补加超纯水到9μL，在22℃孵育30min；接着加入1μLDNA连接酶22℃连接1 h，65℃灭活15min；然后向上述体系中加入250μMdNTP、0.2μLDNA聚合酶1和10×DNA聚 合酶1缓冲液（500mMTris-HCl,pH7.5,100mMMgCl₂），37℃扩增4-6h，80℃灭活15 min；随后加入2.5μM限制性内切酶酶切位点互补序列，补全体积到19μL的超纯水，95℃ 缓慢退火（时间约1个小时）；最后加入1μL限制性内切酶，37℃酶切过夜，80℃灭活15min。

取百分之一的上一步体系的酶切产物做第二步扩增实验。环介导等温扩增反应是 在1×DNA聚合酶2缓冲液中进行的，其中包含20mMTris-HCl(pH8.8)，10mM(NH₄)₂SO₄， 2mMMgSO₄,10mMKCl,0.1%TritonX-100；样品中加入不同浓度的引物，引物1和引物 3的终浓度为100nM，引物2和引物4的终浓度为3μM，加入超纯水补全总体积为8.5μL，95 ℃加热5分钟，接着骤冷至4℃；然后加入500μMdNTP、0.2μL20×DNA显色剂和0.3μL DNA聚合酶2，并立即在实时定量荧光PCR仪器上65℃温度下实时监控荧光变化。根据出峰时 间，或者“S”曲线的拐点的时间，进行定量或者定性分析。

4.单步滚环扩增的检出限

为了验证两步扩增反应优于单步滚环扩增反应，本发明测定了单步滚环扩增的检出 限。连接成环反应中，125nM滚环扩增模板、不同浓度的microRNA21（10nM、5nM、2nM、1nM、 500pM、200pM、0pM），10×DNA连接酶缓冲液（400mMTris-HCl，pH7.6，100mMMgCl₂，100 mMDTT，2.5mMATP），补加超纯水到9μL，在22℃孵育30min；接着加入1μLDNA连接酶22 ℃连接1h，65℃灭活15min；然后向上述体系中加入250μMdNTP、0.2μLDNA聚合酶1和 10×DNA聚合酶1缓冲液（500mMTris-HCl,pH7.5,100mMMgCl₂），37℃扩增4-6h，80 ℃灭活15min；最后，加入1μL20×DNA显色剂和200μL1×PBS缓冲液，在494nm激发光下 测定520-660nm波长范围内的荧光光谱。

5.实际样品的检出限

用TROzol试剂提取Hela细胞的总RNA。按照体外检出限相同的方式配样，用总RNA代替 前述MicroRNA21配制总RNA样品浓度梯度为100ng、50ng、1ng、500pg、0pg的样品。同样，在 实时定量荧光PCR仪器上实时监控荧光变化。

SEQUENCELISTING

<110>武汉顺可达生物科技有限公司，武汉大学

<120>一种利用两步扩增法检测MicroRNA的方法

<130>2016

<160>7

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>22

<212>RNA

<213>未知

<400>1

uagcuuaucagacugauguuga22

<210>2

<211>198

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

ctgataagctacgactctagaggatccccgggtacgtttccgtgtgtaaattgttatccg60

ctcacatctccacacaagtaacctctatgatatcgaattctcgctccaaacgctgcaggt120

gtgcgggcctcttcgctattaccgattaagatagctaacgccagggttttcccagtcacg180

acgttgatcaacatcagt198

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>未知

<400>3

atgatatctgaattctcgctc21

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>未知

<400>4

ctcgctccaaacgctgcaggt21

<210>5

<211>51

<212>DNA

<213>未知

<400>5

tcaacgtcgtgactgggaaaaccctttttgtgcgggcctcttcgctattac51

<210>6

<211>31

<212>DNA

<213>未知

<400>6

aattcagatatcatagaggttacttgtgtgg31

<210>7

<211>56

<212>DNA

<213>未知

<400>7

cgactctagaggatccccgggtacttttagatgtgagcggataacaatttacacac56