肿瘤细胞捕获微流控芯片和肿瘤细胞捕获方法

摘要

本申请公开了一种肿瘤细胞捕获微流控芯片，包括基材、以及形成于所述基材内的微通道，该微通道沿平滑曲线方向延伸，其两端分别形成有入口和出口，所述微通道内沿竖直方向凸伸有微柱阵列，该微柱阵列沿所述微通道的延伸方向阵列分布，其位于入口处的一端贴合于所述微通道的一侧壁，其位于出口处的一端贴合于所述微通道的另一侧壁，所述微柱阵列的中部等间距阵列分布有三角形横截面的捕获腔体，该捕获腔体的三个顶角分别形成三个5微米的间隙，用于一个肿瘤细胞的2-3次捕获。本发明芯片实用于表达EpCAM与不表达EpCAM的CTCs，不表达和低表达EpCAM的CTCs及未连接上磁珠的CTCs可利用5微米间距的微柱阵列进行捕获。

说明书

技术领域

本申请涉及一种肿瘤细胞捕获微流控芯片和肿瘤细胞捕获方法，可应用于各种类型循环肿瘤细胞的微流控芯片捕获，属于生物物理领域。

背景技术

癌症，又名恶性肿瘤。是世界上导致人类死亡的首要原因之一。是危害人类生命健康、导致现代人类死亡的第一大恶疾和顽症。90％的癌症病人死于癌转移，攻克癌症是人类孜孜以求的目标。传统的手术，化疗，放疗的方法成本高，复杂，给病人带来较大痛苦且具有复发性。循环肿瘤细胞(CTCs)是从原生瘤脱落，进入血液循环系统中的肿瘤细胞。这些肿瘤细胞会流到其他位置处滋生滋长，发展为新的瘤。血液循环系统中检测到循环肿瘤细胞意味着癌症和可能的癌转移。CTCs的数目与癌症的严重程度有着密切的联系。数目多，病情严重，数目少病情轻或治疗有效。

微流控芯片的微通道与细胞的尺寸相当，非常适于细胞捕获的研究。微流控芯片被认为是一种非侵入性的新型诊断工具。现有的利用微流控芯片研究CTCs的捕获分离方法大体可分为两类：

一类利用亲和性(Affinityreaction)原理进行细胞的捕获与分离，该方法依赖于在微流控芯片内部的微通道或微结构上修饰能够与细胞表面抗原结合的特异性抗体如anti-EpCAM如CTC-chip,新近改进的微漩产生的鱼鳞形芯片改变微柱阵列为鱼鳞形，提高了细胞与抗体修饰的柱子碰撞几率。提高了捕获效率与纯度。但这种微流控芯片的结构通常非常复杂，修饰时间常，所用的抗体昂贵。且在不同的肿瘤细胞中，EpCAM的表达各有不同。且当肿瘤细胞发生上皮间质转化(EMT)时，肿瘤细胞的EpCAM的表达降低。因此依赖于该方法捕获CTCs有可能会失去一部分不表达或低表达EpCAM的肿瘤细胞。该捕获方法依赖于细胞与抗体修饰的柱子的碰撞几率。加速流速时，细胞与抗体修饰柱子的碰撞几率降低且相互作用的时间减少，捕获率下降。典型的微流控芯片结构有CTC-chip,HB-Chip，HTMSU，Onco-BeanChip。

另一类是基于物理特性比如尺寸形变(ISET：isolationbysizeofepithelialtumorcells)进行捕获的，利用CTCs比血细胞大且不易形变的特征，滤过血细胞。该方法操作简单，结构勿需过于复杂，不需修饰，不依赖于任何表面的标志物。但由于CTCs与白细胞的尺寸有重叠的部分，所以一部分CTCs可能会通过滤网或微柱间隙。可能会损失一部分和白细胞尺寸有重叠部分的CTCs，尤其是那些尺寸较小的CTCs。因为经历了EMT的转变，所以漏掉的CTCs恶性的程度更高。且容易破裂和纯度不高。容易发生堵塞的现象。但与亲和性或其他如双向电泳等方法相比较，该方法简易，切实可行，更适于临床的应用。

精巧地设计微流控芯片就可以满足理想的CTCs检测平台的要求。(1)高敏感性：能够检测到每一个CTC。1ml的血液中仅有1-100个肿瘤细胞却有10⁷个白细胞和10⁹个红细胞。所以检测到血样中的每一个肿瘤细胞具有至关重要的意义；(2)高纯度：分离的CTCs没有其他的细胞如白细胞与红细胞等血细胞，更利于检测与识别；(3)高通量：为了分出尽可能多的肿瘤细胞以便培养和分子生物分析，临床中所使用的血样是7.5ml,高效快速地分离出肿瘤细胞以满足临床的需求；(4)保持细胞的活性和完整性：捕获后肿瘤细胞的洗释，活性，生物学的基因分析与孵育有利于对病人病情的进一步的分析，检测与鉴定。目前唯一应用于临床的只有捕获率不高的得到美国FDA认证的CellSearch。仅局限于乳腺癌，结直肠癌和前列腺癌。还有可能的非上皮细胞或非肿瘤上皮细胞的上皮表达所致的假阳性结果。该方法也存在半自动，高成本，低效率的缺陷。

发明内容

本发明的目的在于提供一种肿瘤细胞捕获微流控芯片和肿瘤细胞捕获方法，以克服现有技术中的不足。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本申请实施例公开了一种肿瘤细胞捕获微流控芯片，包括基材、以及形成于所述基材内的微通道，该微通道沿平滑曲线方向延伸，其两端分别形成有入口和出口，所述微通道内沿竖直方向凸伸有微柱阵列，该微柱阵列沿所述微通道的延伸方向阵列分布，其位于入口处的一端贴合于所述微通道的一侧壁，其位于出口处的一端贴合于所述微通道的另一侧壁，所述微柱阵列的中部等间距阵列分布有三角形横截面的捕获腔体，该捕获腔体的三个顶角分别形成三个5微米的间隙，用于一个肿瘤细胞的2-3次捕获。

优选的，在上述的肿瘤细胞捕获微流控芯片中，微柱阵列中各微柱之间的间距为5微米，梯形微柱之间及梯形与微圆柱之间的间距均为5微米。

肿瘤细胞的尺寸介于10-20μm,红细胞4-6μm，白细胞7-12μm。该尺寸满足小于肿瘤细胞的直径，并为很多文献中的实验验证。

优选的，在上述的肿瘤细胞捕获微流控芯片中，所述微柱阵列包括并列设置的梯形微柱阵列和圆柱形微柱阵列，所述梯形微柱阵列包括沿微通道延伸方向等间距阵列分布且具有梯形横截面的多个梯形微柱，所述圆柱形微柱阵列包括沿微通道延伸方向等间距阵列分布且具有圆形横截面的多个圆柱形微柱，所述梯形微柱阵列和圆柱形微柱阵列并列设置，相邻2个所述梯形微柱和1个圆柱形微柱围成一个所述具有三角形横截面的捕获腔体。

优选的，在上述的肿瘤细胞捕获微流控芯片中，所述微通道自入口向外呈螺旋形分布。

优选的，在上述的肿瘤细胞捕获微流控芯片中，螺旋形的所述微通道具有4圈。

优选的，在上述的肿瘤细胞捕获微流控芯片中，所述微通道包括多个呈螺旋形的通道，该多个通道具有同一个入口，且多个通道呈交替分布。

优选的，在上述的肿瘤细胞捕获微流控芯片中，位于中间段的所述梯形微柱阵列的长边与其相对的微通道侧壁之间的距离为80μm。

优选的，在上述的肿瘤细胞捕获微流控芯片中，位于中间段的所述圆柱形微柱阵列与其相对的微通道侧壁之间的距离为120μm。

优选的，在上述的肿瘤细胞捕获微流控芯片中，所述基材的下方设有永磁铁，捕获时设有永久性磁铁，富集时移除永久性磁铁。。

相应的，本申请还公开了一种捕获肿瘤细胞的方法，包括：将血样从微流控芯片的入口注入，该血样中肿瘤细胞事先孵育有磁珠，在强磁场的作用下，血样通过微通道中微柱阵列的内侧，被梯形及圆柱形微柱阵列捕获滤过，从微通道外侧的空白位置处流走，同时，具有磁性的肿瘤细胞被强磁场吸引在微流控芯片的底面，粘附在芯片上，血细胞钻过微柱阵列，从微通道外侧的空白位置处流走，捕获之后，通入磷酸盐缓冲液冲洗，富集时，移除永久性磁铁，磁性消失，先闭合一端出口，从另一出口处以培养液或缓冲液向圆心即入口处冲洗，即可将此微流通道内捕获的肿瘤细胞冲洗下来，然后将该出口闭合，将另一出口打开，从另一出口处以培养液或缓冲液向圆心处冲洗，即可将另一通道内捕获的肿瘤细胞冲洗下来，实现富集。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1)、本发明芯片易操作，将血样从圆心处通入，即可实现全血的分离；

2)、本发明芯片具有高捕获率，同时结合了2种捕获方法，2层微柱阵列的3次捕获确保了高的捕获效率。

3)、本发明芯片实用于表达EpCAM与不表达EpCAM的CTCs，不表达和低表达EpCAM的CTCs及未连接上磁珠的CTCs可利用5微米间距的微柱阵列进行捕获。

4)、高通量，圆形与螺旋形的结构确保血样流动时的较小阻力，血样在芯片内快速高效地实现分离。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1所示为本发明具体实施例中微流控芯片的俯视图；

图2所示为本发明具体实施例中微通道的放大示意图；

图3所示为本发明具体实施例中微流控芯片的立体结构示意图；

图4所示为肿瘤细胞的外表面连接上具有磁性的免疫磁珠的照片；

图5所示为一个肿瘤细胞外侧各面连接具有磁性的免疫磁珠的照片；

图6所示为本发明具体实施例中微流控芯片捕获效果的照片；

具体实施方式

本实施例提供一种微流控芯片，可实现7.5ml临床血样的检测，该芯片每个圆形螺旋形大约有4圈，互相套嵌在一起。在该微流控芯片的圆形螺旋形微通道内，有一个梯形微柱阵列与一个与该梯形微柱阵列平行的圆柱形微柱阵列组成，梯形微柱阵列的两个下底相邻两个棱角之间的间距为5微米。微圆柱位于相邻两个微梯形上底所形成的间隙处，与两个微梯形上底的两个棱角之间的间距亦为5微米。这两层平行的微柱阵列基本上位于微通道的中间位置处。两个圆形螺旋形微柱阵列的相连接的圆心位置处是入口，左右外端两侧各有一个出口。两层平行的微柱阵列在入口处与通道的外侧相连，在出口处与通道的内侧相连。

所述芯片其将捕获，分离和富集循环肿瘤细胞(CTCs)集于一体，该芯片易于操作，不依赖于肿瘤细胞的标记物，不局限于肿瘤细胞是否表达上皮粘附分子(EpCAM)，分为两种，表达和不表达EpCAM的循环肿瘤细胞的捕获测试；对于表达EpCAM(上皮粘附分子)的循环肿瘤细胞，通过将一块磁性很强的永久性磁铁置于微流控芯片的下方，可在微流控芯片的表面产生强磁场,将循环肿瘤细胞包被具有磁性的免疫磁珠，在圆心处通入血样，血样在两个互相嵌套的圆形螺旋形通道内流动时，一方面被基于尺寸的微柱阵列捕获，而另一方面，在强磁场的作用下，连接免疫磁珠而具有磁性的肿瘤细胞在强磁场的作用下，被吸附在微流控芯片的底部，该芯片实现了的表达EpCAM的肿瘤细胞的尺寸与磁性的双重捕获。而对于不表达EpCAM的肿瘤细胞，则可直接将血样从圆心入口处通入，肿瘤细胞在圆形螺旋形通道内微柱阵列的间隙处被捕获。白细胞与红细胞则可通过微柱阵列流走。富集时，移走磁铁，磁场消失，从出口处用培养液或缓冲液冲洗，即可将被捕获的肿瘤细胞冲洗下来，实现富集。

微流控芯片内的微柱阵列可以有效地实现尺寸的捕获，或尺寸与磁性相结合的双重捕获。圆形与螺旋形结构的设计，可以有效地避免流体流动时的各种阻力，血样在微通道内可以通畅的流动，快速有效地实现循环肿瘤细胞的分离。

微流控芯片表达EpCAM的循环肿瘤细胞的捕获方式，采用强磁场产生的磁性与尺寸的双重捕获，撤除磁铁，磁场消失，实现富集。对于不表达EpCAM的循环肿瘤细胞的捕获方式，则借助于尺寸的捕获，富集时，从出口处向入口处冲洗，即可将捕获的CTCs洗释，实现富集。230微米的通道宽度同时可以实现捕获后肿瘤细胞芯片上的培养。同时该芯片亦可实现2个血样的检测，先闭合一出口，将血样从入口注入，从其中一个螺旋结构流出；然后将另一出口闭合，将该出口打开，从入口注入另一血样，该血样在另一螺旋通道内实现捕获。所述芯片可实现一块芯片2个样本的检测。

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行详细的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

结合图1所示，肿瘤细胞捕获微流控芯片，包括基材、以及形成于基材内的微通道5，该微通道沿平滑曲线方向延伸，其两端分别形成有入口1和出口2，微通道内沿竖直方向凸伸有微柱阵列，该微柱阵列沿微通道的延伸方向阵列分布，其位于入口处的一端贴合于微通道的一外侧壁，其位于出口处的一端贴合于微通道的另一内侧壁，微柱阵列的中部等间距阵列分布有三角形横截面的捕获腔体，该捕获腔体的三个顶角分别形成三个5微米的间隙，用于一个肿瘤细胞的2-3次捕获。。

在一优选实施例中，用于捕捉肿瘤细胞的微流控芯片主要由4圈两个圆形螺旋形的结构互相嵌套形成，可由PDMS(聚二甲基硅氧烷)制作而成。微流控芯片入口1，位于圆心位置处，左右各连接一个圆形与螺旋形微通道。微流控芯片的出口2，各位于微流控芯片左右外侧。通道内梯形的微柱结构3，上底20微米，下底40微米，高30微米。该微柱阵列基本上与微通道平行，在靠近入口位置处与微通道的外侧对相连，在靠近出口处与微通道的内侧相连。

利用上述微流控芯片捕获循环肿瘤细胞的方法，该捕获方法分为两种，表达和不表达EpCAM的循环肿瘤细胞的捕获测试；对于表达EpCAM(上皮粘附分子)的循环肿瘤细胞，将循环肿瘤细胞包被具有磁性的免疫磁珠，并在微流控芯片的下方放置一块磁性很强的永久磁铁，在微流控芯片内产生磁性很强的磁场，当血样注入入口1时，在强磁场的作用下，血样通过微通道中微柱的内侧，被梯形及圆柱形微柱阵列3次捕获滤过，从微通道外侧的空白位置处流走。同时，具有磁性的CTCs被强磁场吸引在微流控芯片的底面，粘附在芯片上。血细胞如白细胞与红细胞则由于小尺寸，易形变的特点可以钻过微柱阵列，从微通道外侧的空白位置处流走。捕获之后，通入磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，即可提高捕获的纯度。富集时，移除磁铁，磁性消失，先闭合一端出口，从另一出口处以培养液或缓冲液向圆心即入口处冲洗，即可将此微流通道内捕获的肿瘤细胞冲洗下来，然后将该出口闭合，将另一出口打开，从另一出口处以培养液或缓冲液向圆心处冲洗，即可将另一通道内捕获的肿瘤细胞冲洗下来，实现富集。对于不表达EpCAM或低表达EpCAM的肿瘤细胞，则不连接免疫磁珠，直接利用尺寸与形变捕获。

参图2所示，由于微通道内，微柱阵列前方的间距6为80微米，微柱阵列后方的间距7为120微米，所以该圆形螺旋形微流控芯片可以实现高通量，满足临床7.5ml的需求。足够的空间实现捕获的肿瘤细胞芯片上的培养。

图3是该双通道圆形螺旋形微流控芯片的结构简图示意图，从该图中可以看出微柱阵列的走势。

该微流控芯片是否能够成功在很大的程度上取决于循环肿瘤细胞连接免疫磁珠的效率。如果所有的CTCs都能连接上直径4.5微米的免疫磁珠，并且每个肿瘤细胞连接的免疫磁珠越多，就能够使得CTCs具有磁性越强，在强磁场的作用被强磁场的作用吸引在微流控芯片底面上的可能性越大，同时将肿瘤细胞的尺寸放大，可以进一步确保磁性捕获的成功性。图5所示是乳腺癌细胞MCF-7连接磁性免疫磁珠的图片，在该图片中，所有的肿瘤细胞都连接上了直径4.5微米的磁性免疫磁珠。使得肿瘤细胞具有磁性并放大了4.5微米-9微米。确保2种捕获方法的有效实施。CTCs连接磁性免疫磁珠的方法实施起来也极为简单，在1ml的肿瘤细胞悬液中加25微升的免疫磁珠，半小时之内上下颠倒混匀该细胞悬液，即可得到如图4的效果。

经验证，几乎所有的表达EpCAM的CTCs在半小时之内即可近100％的连接上带有磁性的免疫磁珠，仅靠磁性即可实现CTCs的捕获。

图5是一个肿瘤细胞连接具有磁性的免疫磁珠，连接效果十分好的图片。在该图片中，乳腺癌细胞MCF-7在各个方位都连接上具有磁性的免疫磁珠。从而有效确保磁性捕获的成功。并且该肿瘤细胞的尺寸被有效的放大了9微米，确保了尺寸捕获的极大可能。

图6是该微流控芯片的捕获效果图片，从该图片中可以看出染了色的肿瘤细胞被捕获在芯片上，且在微流通道的内测，在该微流通道的外侧没有任何的肿瘤细胞，证实了该微流控芯片在捕获时的有效性。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

以上所述仅是本申请的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。