一种筛选布莱凯特黑牛优质牛种的方法及使用的引物和试剂盒

摘要

本发明公开了一种筛选布莱凯特黑牛优质牛种的方法，包括：PCR扩增布莱凯特黑牛PID1基因第2外显子的基因序列，选择PID1基因第2外显子第285位碱基为G的布莱凯特黑牛为优质牛种。本发明还公开了筛选所需的引物和试剂盒。本发明首次提出以检测PID1基因突变碱基来筛选优质牛种的方法，为培育优质布莱凯特肉牛品种提供了新的思路。本发明优选使用PCR-RFLP方法来检测布莱凯特黑牛碱基突变和基因型，通过电泳片段的个数即可筛选出优质牛种，把测序技术筛选SNP和PCR-RFLP技术结合起来，解决了SSCP的不稳定性和普通RFLP的局限性，简单、快速、成本低、精确度高、检测结果直观、便于推广。

说明书

技术领域

本发明涉及一种筛选布莱凯特黑牛优质牛种的方法，扩增PID1基因第2外显子所使 用的引物，以及筛选优质牛种所使用的试剂盒，属于动物分子遗传学技术领域。

背景技术

随着饮食文化的丰富和人们生活水平的不断提高，越来越多的人意识到牛肉特有的营 养价值。牛肉含有人体所需的必需氨基酸，具有高蛋白、低胆固醇的特点，营养丰富。随着 消费群体的增大，牛肉在肉类消费中的比重在逐年攀升，牛肉价格也连续走高。消费总量在 不断增长的同时，人们对牛肉的质量也有了更高的要求，“雪花牛肉”、“高档牛肉”逐渐成为 消费时尚，消费者对高档牛肉的需求也越来越迫切。国内现阶段大多数的“高档牛肉”主要依 赖进口，这一现实状况对我国高档肉牛品种的选育提出了新的挑战。我国肉牛现有五大品种， 八大地方品种，但多为兼用型，肉牛的综合生产水平较低，特别是牛肉的质量较国外有很大 的差距，高档肉牛的培育相对滞后，培育高档肉牛已是必然趋势。

布莱凯特黑牛是一种优质肉牛新品种，是通过体细胞克隆等现代生物技术结合常规育种 杂交方法，对当地的鲁西黄牛和渤海黑牛进行改良而获得的优良种质资源。该杂交种质充分 显现了杂种优势，保留了和牛肉质特性和部分外表特征，获得了鲁西黄牛和渤海黑牛适应本 土环境和地理条件的生理特性。由于致密化的脂肪具有一定的硬度，其肉块可切成小方块、 中方块和大方块，每个切面都成大理石花纹的独特特性。该牛最大特点是肉质好，呈典型的 大理石花纹，又称“雪花肉”，细嫩多汁，其牛肉含有丰富的蛋白质，氨基酸组成比猪肉更接 近人体需要，能提高机体抗病能力，CoQ10含量也相对较高，具有营养心肌、增强抵抗力的 功能，同时含铁量丰富，饱和脂肪酸含量很低，不饱和脂肪酸含量高，风味独特，肉质鲜美， 口感特别，营养丰富，肉用价值极高，是我国肉牛品种中不可多得的优质肉牛新种质，因此 快速高效的培育肉质、营养更加优良的肉牛品种是当务之急。

目前，对布莱凯特黑牛优质牛种进行筛选或者培育优质牛种的方法很少有报道，目前 常用SSCP和普通RFLP技术进行单核苷酸多态性(SinglenucleotidePolymorphisms，SNPs) 检测及群体遗传多态性分析，这些方法不稳定，有些突变不引起DNA弯曲，分子构象不改 变，在通常的条件下，这些突变可能未被检出，因而，只通过这些技术并不能证明完全没有 突变，实际应用中可能会遇到相当比例的假阴性结果；同时目前的检查技术灵敏度不高，受 多种因素如电泳温度、离子强度(即电泳缓冲液浓度)、凝胶浓度、甘油的浓度和交联剂亚甲 基双丙烯酰胺的浓度等的影响，导致重复性差；加之其操作过程复杂，这极大的限制了其在 生产中的应用。

发明内容

针对现有技术中还没有一种快速有效的筛选优质牛种的方法的不足，本发明提供了一 种筛选布莱凯特黑牛优质牛种的方法，该方法能够快速、简洁的筛选出优质的布莱凯特黑牛 牛种，准确性高，为培育肉质、营养更加优良的莱凯特黑牛品种提供了技术支持。

本发明还提供了一种筛选布莱凯特黑牛优质牛种的试剂盒，使用该试剂盒可以方便的 筛选出优质牛种，便于应用。

本发明还提供了一种扩增布莱凯特黑牛PID1基因第2外显子的引物，该引物能准确 的扩增出布莱凯特黑牛PID1基因第2外显子，为优质牛种的筛选提供了良好的基础。

肌内脂肪(IntramuscularFat，IMF)是沉积在肌内脂肪细胞中的甘油三酯(Triglyceride， TG)，IMF含量与牛肉的品质密切相关，能直接影响肉的嫩度和风味，提高肌内脂肪含量也 成为现代育种的要求之一。在黑牛育种过程中发现，布莱凯特黑牛的肉质情况存在差异，并 非所有培育出来的布莱凯特黑牛都具有肉质好、营养丰富、风味独特的独特特性，为了使布 莱凯特黑牛保持优良的品种就必须不断筛选优良的牛种。

目前有关筛选、选育优质布莱凯特黑牛牛种方面的研究还比较少，没有很好的筛选方 法，发明人试图从分子生物学角度研究基因与黑牛肉质的关系，为培育优质布莱凯特肉牛品 种提供新的思路。在这一思想的指导下，发明人选择PID1、PDSS2、COQ2、COQ3等基因 进行研究，以布莱凯特黑牛养殖场的大量布莱凯特黑牛为研究对象，通过PCR扩增技术分析 黑牛的上述基因情况，寻找影响黑牛品质的基因因素。PID1(磷酸酪氨酸互作结构域1， Phosphotyrosineinteractiondomaincontaining1)基因有一个PTB(磷酸酪氨酸作用位点)结构 域，与信号蛋白Shc上的PTB结构域相似，参与生长因子刺激下细胞增殖等下游效应。COQ10 (辅酶Q10)是一种醌环类化合物，广泛存在于动植物及微生物细胞的线粒体内膜上，其在氧化 磷酸化、细胞凋亡、体内自由基清除和增强机体免疫力等方面起着重要作用，是生物有氧呼 吸电子传递链中的必要成分，其不仅对于ATP的产生至关重要，还具有清除体内活性氧自由 基及通过调控NAD⁺/NADH比率来控制细胞的氧化还原态等功能，是人体内唯一可利用的 CoQ类，被生物学家称为维生素Q。CoQ10除具备以上功能外，还是人体唯一可利用的CoQ 类，而十聚异戊二烯焦磷酸合成酶(decaprenyldiphosphatesynthase，DPPS)在CoQ10合成 过程中起决定性作用，其为同源二聚体蛋白，也称为异源四聚体，作为合成CoQ10的关键酶 之一，决定着十异戊二烯侧链的合成，而且具有专一性，该酶由PDSS1和PDSS2两个亚基 组成，并分别由PDSS1和PDSS2基因分别编码。COQ2基因为真核生物中对羟基苯甲酸聚异 戊二烯焦磷酸转移酶(PPT)的编码基因，PPT是COQ10生物合成过程的主要限速酶之一，影 响体内COQ10的合成。COQ3基因编码的氧-甲基转移酶催化辅酶Q10合成过程中两步重要 甲基化反应，甲基转移酶(methyltransferase,MT)广泛存在于生物体内，它是甲基转移酶大家族 中的一员。

经过最后的研究结果显示：PID1、PDSS2、COQ2、COQ3这些基因都有位点的突变， 但是PDSS2、COQ2、COQ3基因的突变与肌内脂肪含量等性状并没有明显的对应关系，而 PID1基因的突变对布莱凯特黑牛的品质却有明显的对应关系，具体来说当布莱凯特黑牛PID1 基因第2外显子的第285位碱基发生了T※G转换时，布莱凯特黑牛的肉质更好，因此确定 了以检测PID1基因的突变来筛选优质黑牛的筛选方法。

本发明具体技术方案如下：

一种筛选布莱凯特黑牛优质牛种的方法，PCR扩增布莱凯特黑牛PID1基因第2外 显子的基因序列，选择PID1基因第2外显子的第285位碱基为G(鸟嘌呤)的布莱凯特黑牛 为优质牛种。

发明人根据研究结果得到了上述筛选方法，通过这一方法可以方便、快捷的判断黑牛 品质的优劣，为优化肉牛品质提供了更好的技术支持。

单核苷酸多态性(SNP)是指基因组DNA中某一特定核苷酸位置上发生转换、颠换、 插入或缺失等变化。单核苷酸多态性具有数量多、分布广和稳定遗传等特点，是一种进行分 子遗传育种的优良手段。PCR-RFLP的基本原理是用PCR扩增目的DNA，扩增产物再用特 异性内切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝胶电泳上分辨。不同等位基因的限制性酶切 位点分布不同，产生不同长度的DNA片段条带。此技术大大提高了目的DNA的含量和相对 特异性，而且方法简便，分型时间短。本发明PID1基因第2外显子酶切位点为ATTAAT，因 此可以被AseⅠ内切酶特异性识别，采用PCR-RFLP法能够快速、便捷、直观的判断出是否 存在285位碱基突变，因此采用PCR-RFLP法筛选优质牛种。

进一步的，PCR-RFLP法筛选优质牛种包括以下步骤：

(1)取布莱凯特黑牛待检样本，提取DNA，作为PCR扩增的模板DNA；

(2)采用PCR扩增布莱凯特黑牛PID1基因第2外显子，得PCR产物，扩增所用的引 物如下：

上游引物：5’GTGACCTATCTGGGTAAGGTGCCC3’

下游引物：5’TCAGCCATCATCAGATTCTAATTCCTGGG3’；

(3)利用限制性内切酶酶切扩增的PCR产物，再对酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳 检测，选择琼脂糖凝胶电泳产生1个片段的布莱凯特黑牛为优质牛种。

上述方法中，酶切后仅有一个电泳片段时，表示PID1基因第2外显子的第285位碱 基为G(鸟嘌呤)，其对应的基因型为BB纯合子，此牛种肉质最佳。

上述方法中，所述待检样本可以是布莱凯特黑牛的组织样本、血液样本、排泄物样本 等，选择范围广。

上述方法中，可以采用现有技术中公开的提取试剂盒提取DNA。

上述步骤(2)中，PCR反应条件为：94℃预变性7min、94℃变性30s、56℃退火30s、 72℃延伸45s，30个循环，最后72℃延伸10min。

上述步骤(2)中，PCR反应体系为：模板DNA2.0μL，含Mg²⁺的10×PCRBuffer5.0 μL，dNTP4.0μL，扩增布莱凯特黑牛PID1基因第2外显子的上、下游引物各1.0μL，5U/μL 的Taq酶0.3μL，加双蒸水即可至总体积为50.0μL。

上述步骤(3)中，所述限制性内切酶为限制性内切酶AseⅠ。

上述步骤(3)中，用限制性内切酶进行酶切时，酶切体系如下：10U/μL的限制性内 切酶0.5μL，10×NEBuffer3.12μL，PCR产物10μL，加双蒸水至总体积为20.0μL。

上述步骤(3)中，用限制性内切酶进行酶切时，温度为37℃，时间为2h。

上述步骤(3)中，用浓度为2％的琼脂糖凝胶对酶切后的片段进行电泳分离。

扩增布莱凯特黑牛PID1基因第2外显子的引物也是本发明的保护范围，具体如下：

上游引物：5’GTGACCTATCTGGGTAAGGTGCCC3’

下游引物：5’TCAGCCATCATCAGATTCTAATTCCTGGG3’。

本发明还保护筛选布莱凯特黑牛优质牛种的试剂盒，包括单独包装的：a、上述的扩 增布莱凯特黑牛PID1基因第2外显子的引物；b、限制性内切酶AseⅠ。

上述试剂盒中，还包括单独包装的含Mg²⁺的10×PCRBuffer、dNTP、Taq酶、 10×NEBuffer3.1等。

上述试剂盒中，各成分均单独包装，浓度和体积如下：

扩增布莱凯特黑牛PID1基因第2外显子的上游引物：1.0μL；

扩增布莱凯特黑牛PID1基因第2外显子的下游引物：1.0μL；

含Mg²⁺的10×PCRBuffer：5.0μL；

dNTP：4.0μL；

5U/μL的Taq酶：0.3μL；

10U/μL的限制性内切酶AseⅠ：0.5μL；

10×NEBuffer3.1：2μL。

本发明首次提出以检测PID1基因突变碱基来筛选优质牛种的方法，为培育优质布莱 凯特肉牛品种提供了新的思路。在检测时使用本发明特异的引物和试剂盒，优选使用 PCR-RFLP方法来检测布莱凯特黑牛碱基突变和基因型，通过电泳片段的个数即可筛选出优 质牛种，把测序技术筛选SNP和PCR-RFLP技术结合起来，解决了SSCP的不稳定性和普通 RFLP的局限性，简单、快速、成本低、精确度高、检测结果直观、便于推广。

附图说明

图1布莱凯特黑牛基因组DNA检测结果；

图2PID1基因第2外显子的第195位TT基因型测序峰图；

图3PID1基因第2外显子的第195位CC基因型测序峰图；

图4PID1基因第2外显子的第285位AA基因型测序峰图；

图5PID1基因第2外显子的第285位BB基因型测序峰图；

图6PCR-RFLP检测结果,图中，1：BB基因型；2：AB基因型；3：AA基因型。

具体实施方式

下面对本发明进行详细的描述和说明，以便更好的了解本发明。

实施例1对筛选优质牛种所用基因的选择

1、材料和方法

1.1试验动物

试验动物为117头育肥的布莱凯特黑牛，选自山东布莱凯特黑牛科技股份有限公司， 育肥周期为40月龄，为同一批次、同一育肥环境，屠宰后取第12～13肋骨间背最长肌，低 温保存备用。

1.2主要仪器和试剂

1.2.1主要仪器

AlphaImager凝胶成像分析系统、epPCR仪、IKA高速胶体匀浆机、 SIGMA3K-30高速冷冻离心机、上海纤检SZC-C脂肪测定仪、ELITE300水平电泳仪、 DYCP-31A水平电泳槽、Bio-TekELX800Gene5酶标仪、Milli-Q超纯水系统、ELITE300PLUS 普通电泳仪、BP211D精密电子天平等。

1.2.2主要试剂

组织基因组DNA提取试剂盒、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购自天根生化科 技(北京)有限公司；TaqDNA聚合酶、限制性内切酶AseⅠ、dNTPs、含Mg²⁺的10×PCRBuffer、 10×NEBuffer3.1、6×LoadingBuffer、石油醚(60℃～90℃沸程)、滤纸(经脱脂)、脱脂棉、 甘油三酯(TG)测试盒等均购自青岛溯源生物有限公司。

1.3基因组DNA提取

根据DNA提取试剂盒说明书，提取布莱凯特黑牛基因组DNA，用1.0％琼脂糖凝胶 检测基因组DNA的完整性，核酸蛋白测定仪测定浓度，-80℃保存备用。图1是提取的9个 样本的基因组DNA的检测结果，从图中可以看出，提取成功。

1.4引物设计与合成

根据NCBI中公布的牛PID1基因的第2外显子序列设计引物,扩增包含第2外显子 序列，引物序列为上游引物：5′-GTGACCTATCTGGGTAAGGTGCCC-3′和下游引物:5′ -TCAGCCATCATCAGATTCTAATTCCTGGG-3′，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司 合成。按照同样的方法，也对PDSS2、COQ2、COQ3基因设计扩增引物。

1.5PCR扩增

按照下列PCR扩增方法，分别对PID1第2外显子、PDSS2、COQ2、COQ3进行扩 增，得扩增产物。

PCR反应体系

PCR反应条件为：94℃预变性7min，然后进入94℃变性30s、56℃退火30s和72℃延伸 45s，30个循环，最后72℃延伸10min。取5μL产物，1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。

1.6序列测定

采用天根生化科技(北京)有限公司的普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行PCR产物 的纯化回收，选取回收效果好的胶回收扩增产物由上海生工直接进行测序。测序结果与NCBI 中公开的序列进行比较，结果显示：部分布莱凯特黑牛的PID1第2外显子序列、PDSS2基 因序列、COQ2基因序列、COQ3基因序列中存在基因突变。其中，PID1第2外显子中有两 处突变，第一处为第195位发生了T※C突变，第二处为第285位发生了T※G突变，形成 2个多态位点。PID1第2外显子中第195位发生T※C转换产生了3种基因型，定义TT基 因型为T195T纯合子(其测序峰图见图2)，CC基因型为C195C纯合子(其测序峰图见图 3)，TC基因型为T195C杂合子；第285位发生T※G转换也产生3种基因型，定义AA基 因型为T285T纯合子(其测序峰图见图4)，BB基因型为G285G纯合子(其测序峰图见图5)， AB基因型为T285G杂合子。PDSS2基因第1外显子第189位发生了T/C突变。COQ2基 因第3外显子第102位发生了A/T突变。COQ3基因第5外显子第36位发生了C/A突变。

1.7肉质性状的测定

1.7.1肌内脂肪含量的测定

肌内脂肪(IntramuscularFat，IMF)含量的测定采用脂肪测定仪进行，每个样品做3个 重复。具体步骤如下：

(1)按照取样要求，取胴体第12～13肋骨间背最长肌。试样用塑料膜密封低温保存带 回实验室，尽快进行分析。

(2)将滤纸折叠后置于滤纸筒架内，将其置于103℃±2℃干燥箱中干燥4h后，冷却后 准确称取滤纸筒的重量。

(3)使用小型粉碎机将试样打碎。称取打碎后的样品5g左右，转移至滤纸筒，并准确 称取滤纸筒及样品的总重量，计算出样品的重量。

(4)将滤纸筒及样品一起置于103℃±2℃干燥箱内干燥4h，冷却。冷却后称量滤纸筒的 总重量。

(5)通过软轴使速节提至适当位置，将滤纸筒上口对准速接吸合即可，将抽提筒中加入 60mL石油醚，将抽提筒移入加热板上使抽提筒上口对准下保护套的园柱孔，保证二平面接 触良好，拉下压杆使勾子同座子锁牢，将试样降入抽提筒底，浸泡，开启冷凝管旋塞，将温 控仪温度和调温旋扭设置在90℃，抽提6h。

(6)取下抽提筒，回收石油醚，将滤纸筒置于103℃±2℃干燥箱中干燥4h，置于干燥器 中冷却至室温，准确称量。

(7)计算试样中肌内脂肪含量：

$W=\frac{m_1-m_2}{m_0}\times 100$

式中：

W─试样中肌内脂肪含量，％；

m1─抽提前滤纸筒的重量，单位为克(g)；

m2─抽提后滤纸筒的重量，单位为克(g)；

m0─试样的重量，单位为克(g)；

1.7.2TG含量测定

操作过程：

1)、样本处理

组织样本：准确称取组织重量，按重量(g):体积(ml)＝1：9的比例，加入9倍体积的 匀浆介质，冰水浴条件下机械匀浆，2500转/分，离心10分钟，取上清液以甘油三酯(TG) 测试盒测定。

2)、操作表：(样本：工作液＝1:100)

混匀后37℃保温5分钟，546nm处，酶标仪测定各孔吸光度值。

1.8数据统计分析

1.8.1基因和基因型频率分析

基因型频率是指决定该性状的基因座上的两个等位基因或多个复等位基因所组成的各种 基因型的个体分别在群体中所占的比率:基因频率是指同一基因座上两个等位基因或多个复 等位基因分别在群体内该基因座上的基因总数中所占的比率。各基因的频率之和等于1。

Pi＝〔2(ii)+(ij1)+(ij2)+……(ijn)〕/2N

其中,Pi:第i个等位基因的频率；i:纯合复等位基因；j1,j2,……,jn:与i共显的第1 到第n个等位基因。

对上述各基因的基因频率和基因型频率进行分析，用于研究基因突变与肉质品质之间的关 系。

表1-1PID1第2外显子195位基因频率及基因频率分布

表1-2PID1第2外显子285位基因频率及基因频率分布

表1-3PDSS2基因频率及基因频率分布

表1-4COQ2基因频率及基因频率分布

表1-5COQ3基因频率及基因频率分布

1.8.2PID1基因不同基因型与肉质品质关系

根据所检测群体的数据结构，利用SPSS18.0统计软件包的最小二乘分析方法对所发现的 突变位点与肉质品质之间的关系进行了统计分析。结果显示：PID1基因第2外显子第195 位T※C转换的突变对布莱凯特黑牛的肌内脂肪含量、TG含量未产生显著影响(P＞0.05)； PDSS2、COQ2、COQ3基因中的突变对布莱凯特黑牛的肌内脂肪含量、TG含量也未产生显 著影响；但PID1基因第2外显子第285位T※G转换的突变对布莱凯特黑牛的肌内脂肪含 量、TG含量有显著影响(P＜0.05)。

表2-1布莱凯特黑牛PID1基因第2外显子不同基因型与肌内脂肪含量的分析

注：同行、列数据不同字母间差异显著(P＜0.05)，相同字母差异不显著(P>0.05)

表2-2布莱凯特黑牛PID1基因第2外显子不同基因型与肌内脂肪含量的分析

注：同行、列数据不同字母间差异显著(P＜0.05)，相同字母差异不显著(P>0.05)

表3-1布莱凯特黑牛PID1基因第2外显子不同基因型与组织中TG含量的分析

注：同行、列数据不同字母间差异显著(P＜0.05)，相同字母差异不显著(P>0.05)

表3-2布莱凯特黑牛PID1基因第2外显子不同基因型与组织中TG含量的分析

注：同行、列数据不同字母间差异显著(P＜0.05)，相同字母差异不显著(P>0.05)

表4-1布莱凯特黑牛PDSS2基因不同基因型与肌内脂肪含量的分析

注：同行、列数据不同字母间差异显著(P＜0.05)，相同字母差异不显著(P>0.05)

表5-1布莱凯特黑牛COQ2基因不同基因型与肌内脂肪含量的分析

注：同行、列数据不同字母间差异显著(P＜0.05)，相同字母差异不显著(P>0.05)

表6-1布莱凯特黑牛COQ3基因不同基因型与肌内脂肪含量的分析

注：同行、列数据不同字母间差异显著(P＜0.05)，相同字母差异不显著(P>0.05)

1.8.3结论：

通过对各种基因突变的研究分析，仅PID1基因第2外显子第285位发生的T※G转换 突变对布莱凯特黑牛的肌内脂肪含量、TG含量有显著影响(P＜0.05)，彼此有明显的对应 关系，因此确定了通过对该突变的检测来筛选优质牛种的方法。

实施例2

PCR-RFLP法筛选优质牛种，步骤如下：

1、按上述实施例1的方法取布莱凯特黑牛的耳组织，用天根生化科技(北京)有限公司的 组织基因组DNA提取试剂盒提取布莱凯特黑牛基因组DNA，作为PCR扩增的模板DNA；

2、采用PCR扩增布莱凯特黑牛PID1基因第2外显子，得PCR产物，扩增所用的引物 如下：

上游引物：5’GTGACCTATCTGGGTAAGGTGCCC3’

下游引物：5’TCAGCCATCATCAGATTCTAATTCCTGGG3’；

PCR反应体系和条件如下：模板DNA(50ng/μL)2.0μL，10×buffer(Mg²⁺)5.0μL，dNTP (2mmol/L)4.0μL，上下游引物(10pmol/2μL)各1.0μL，Taq酶(5U/μL)0.3μL，加双蒸水 至总体积为50.0μL。PCR反应条件为：94℃预变性7min，然后进入94℃变性30s、56℃退 火30s和72℃延伸45s，30个循环，最后72℃延伸10min。取5μL产物，1.0％琼脂糖凝胶电 泳检测。

3、采用天根生化科技(北京)有限公司的普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行PCR产物 的纯化回收，利用限制性内切酶AseI消化酶切纯化的PCR产物，再对酶切后的片段用浓度 2％的琼脂糖凝胶电泳检测，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定PID1基因第2外显子第285位的 碱基多态性。

酶切体系如下：

将酶切体系各组分混匀，于37℃金属浴中反应2h。

上述方法用浓度为2％的琼脂糖凝胶对消化后的PCR产物进行电泳分离，可以检测出 PID1基因第2外显子第285位T/G变异位点。当布莱凯特黑牛PID1基因第2外显子的基因 型为AA基因型即T285T纯合子时，序列为ATTAAT，此位点能被AseI内切酶识别，经内 切酶消化后的PCR产物会产生2个片段；BB基因型为G285G纯合子，不会产生AseI内切 酶酶切位点，经AseI内切酶消化后的PCR产物仍为1个片段；AB基因型为T285G杂合子， 经AseI内切酶消化后的PCR产物会产生3个片段。因此在实际应用中，可以通过酶切片段 的个数判断285位基因型，从而能简单的判断出我们所需要的G285G纯合子优质基因型。即 选择内切酶消化后的PCR产物仍为1个片段的布莱凯特黑牛为优质牛种。

PCR-RFLP的基本原理是用PCR扩增目的DNA，扩增产物再用特异性内切酶消化切 割成不同大小片段，直接在凝胶电泳上分辨。不同等位基因的限制性酶切位点分布不同，产 生不同长度的DNA片段条带。此项技术大大提高了目的DNA的含量和相对特异性，而且方 法简便，分型时间短。与现有技术相比，本发明把测序技术筛选SNP和PCR-RFLP技术结合 起来，解决了SSCP的不稳定性和普通RFLP的局限性，提供了一种用简单、快速、低成本、 精确度高的、便于推广的DNA水平筛查和检测与布莱凯特黑牛生产性状密切相关的遗传标 记，可用于布莱凯特黑牛的分子育种。

<110>董雅娟

<120>一种筛选布莱凯特黑牛优质牛种的方法及使用的引物和试剂盒

<160>2

<210>1

<211>24

<212>DNA

<213>人工合成

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<212>DNA

<213>人工合成

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TCAGCCATCATCAGATTCTAATTCCTGGG29