一种海三棱藨草的快速繁育方法

摘要

本发明为一种海三棱藨草的快速繁育方法，采用破除部分种皮的海三棱藨草的成熟种子作为外植体，消毒后接种于萌发培养基中进行初代培养；挑选生长健壮的无菌苗转入增殖培养基培养；将增殖后的丛生芽转入壮苗培养基中培养；将壮苗后的组培苗以单芽的形式转接入生根培养基中；将生根培养后的完整组培苗移栽入基质中，基质由珍珠岩、草炭和蛭石组成，待新叶发出，根系与基质形成土球状，再次移栽入可降解穴盘中生长15天以上，最后连同可降解穴盘种植于湿地内。本发明的繁育方法具有繁殖速度快、种苗一致性好、容易实现标准化生产等特点。

说明书

技术领域

本发明属于植物学领域，涉及一种植物的繁育方法，具体来说是一种海三棱藨草的快速繁育方法。

背景技术

海三棱藨草(ScirpusmariqueterTang&F.T.Wang)是莎草科藨草属一种多年生草本植物，是真正具有上海特色的土著物种，也是东滩乃至整个长江河口湿地生态系统中的关键种，一旦消失，生态系统便会崩溃。

海三棱藨草是我国特有种，主要分布在长江河口与杭州湾，是滩涂潮间带原生裸地上的先锋植物，在长江河口湿地生态系统中扮演着十分重要的角色(欧善华,宋国元.1992.海三棱藨草的形态、分布与资源[J].上海师范大学学报(自然科学版),21:5-9)。海三棱藨草能够在河口潮间带形成绵延数十公里的大面积单一物种群落，具有消浪、护滩、促淤等功能。根据上世纪90年代的研究数据，海三棱藨草群落的平均年积淤量可达6.9～11.7cm，而裸露的海滩仅能积淤2.6cm(杨斌生,欧善华,宋国元.1992.南汇东滩海三棱藨草群落促淤效能的研究[J].上海师范大学学报(自然科学版),21:65-72)，可以说超过60％的上海土地的形成都拜这一物种所赐。海三棱藨草每年产生大量淀粉含量较高的小坚果和地下球茎，群落内的底栖动物十分丰富，可为栖息于此的湿地水鸟提供大量植物性和动物性饵料(虞快,王会志,杨斌生.1992.崇明东滩四种野鸭的食性与海三棱藨草关系的研究[J].上海师范大学学报(自然科学版),21:

78-84；童春富,章飞军,陆健健.2007.长江口海三棱藨草带生长季大型底栖动物群落变化特征[J].动物性研究,28:640-646；朱晶,敬凯,干晓静,马志军.2007.迁徙停歇期鸻鹬类在崇明东滩潮间带的食物分布[J].生态学报,27:2149-2159)。海三棱藨草也为许多水生动物提供产卵场所和栖息地，每年冬季枯死的地上部分腐烂分解后形成丰富的碎屑，成为维持长江河口食物网的基石(陈中义.2005.长江口海三棱藨草的生态价值及利用与保护[J].河南科技大学学报(自然科学版),2:64-67)。此外，海三棱藨草植株的蛋白质含量超过10％，是一种良好的天然牧草，晒干后还可在冬季做家畜饲料(徐生俊,欧善华,杨斌生.1992.上海市滩涂植物海三棱藨草的营养成分[J].上海师范大学学报(自然科学版),21:73-77.)。

因此，海三棱藨草是长江口湿地生态系统中最关键的初级生产者，地位特殊、功能广泛，具有无可替代的作用。然而近30年来，由于人为活动干扰以及外来物种互花米草入侵的影响，海三棱藨草等土著物种的生存受到了严重威胁，其分布面积从约135km²锐减到40km2以下，已经严重影响到崇明东滩湿地生态系统的完整性、健康和服务功能(LiB,LiaoCZ,ZhangXD,ChenHL,WangQ,ChenZY,GanXJ,WuJH,ZhaoB,MaZJ,ChengXL,JiangLF&ChenJK.2009a.SpartinaalterniflorainvasionsintheYangtzeRiverestuary,China:anoverviewofcurrentstatusandecosystemeffects.EcologicalEngineering,35:511-520.)。这种趋势如不能得到有效的遏制，海三棱藨草这一物种有可能在长江口走向整体灭绝，河口湿地生态系统也会崩溃(陈秀芝,孙瑛.2011.中国特有盐沼植物——海三棱藨草的现状及保护利用[J].湿地科学与管理,1:60-63.)。

鉴于海三棱藨草在长江口湿地生态系统中的重要性以及目前所面临的威胁，我们必须加强对这一物种的研究和保护工作,通过组织培养等人工手段，重建和复壮海三棱藨草等土著种的群落。

迄今为止，国内外报道了23个科43个属将近60种水生观赏植物已成功地进行了组织培养，但试验结果的可重复性较差，多数报道只有结果，对所采用的技术手段和原因分析较少，也未见产业化方面的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种海三棱藨草的快速繁育方法，所述的这种海三棱藨草的快速繁育方法解决了现有技术中的繁育海三棱藨草的方法重复性差，效果不佳的技术问题。

本发明提供了一种海三棱藨草的快速繁育方法，包括如下步骤：

1)无菌苗萌发：采用破除部分种皮的海三棱藨草成熟种子作为外植体，消毒后接种于萌发培养基中，培养温度为25～32℃，培养周期为28～32天；

2)增殖获得丛生芽：挑选生长健壮的无菌苗转入增殖培养基，所述的增殖培养基为MS+6-BA(1.0～3.0)mg·L^-1+TDZ0.002mg·L^-1+IBA(0.1～0.3)mg·L^-1，培养温度为25～32℃，培养周期为28～32天；

3)壮苗培养：将增殖后的丛生芽转入壮苗培养基中，所述的壮苗培养基为1/2MS+6-BA(0.0～0.5)mg·L^-1+IBA(0.0～0.05)mg·L^-1，培养温度为25～32℃，培养周期为26～30天；

4)生根培养：将壮苗后的组培苗以单芽的形式转接入生根培养基中，所述的生根培养基为1/2MS+IBA(0.05～0.5)mg·L^-1，培养温度为25～32℃，培养周期为18～23天；

5)温室移栽：将生根培养的完整组培苗移栽入基质中，所述基质由珍珠岩、草炭和蛭石组成，其体积比为1:1～2:0～1，待新叶发出，基部根系与基质形成土球状，再次移栽入可降解穴盘中。

6)湿地种植：在孔隙为5cm*5cm的可降解穴盘中生长半月以上，再次挑选健壮一致、高度在20cm以上的种苗，与可降解穴盘种植于湿地内。

进一步的，所述的种子萌发培养基为：MS+6-BA0.5mg·L^-1+GA₃0.5mg·L^-1。

进一步的，所述的最佳增殖培养为MS+6-BA2.0mg·L^-1+TDZ0.002mg·L^-1+IBA0.2mg·L^-1。

进一步的，在增殖培养过程中，选定最佳培养温度为30℃、最佳光照时间为12h/天、最佳光照强度为2500lx。

进一步的，所述的最佳壮苗培养基为1/2MS+6-BA0.05mg·L^-1+IBA0.01mg·L^-1。

进一步的，所述的最佳生根培养基为1/2MS+IBA0.2mg·L^-1。

进一步的，所述的生根培养选用120cm²的大容器，培养密度为每瓶25株。

进一步的，在步骤5)中，将基质设置在128孔穴盘中，种植密度为每孔1棵或2棵，前7天保持约85～95％的湿度，保证叶面湿润，并每隔3天喷施杀菌剂，7天后逐渐降低湿度至70～85％。

进一步的，在步骤6)中，将基质设置在孔隙为5cm*5cm的可降解穴盘中，移植入步骤5)中温室移栽成活的种苗，每孔种植4～6棵，种植15天以后，与可降解穴盘种植于湿地内。

本发明在深入研究海三棱藨草各培养环节的基础上，进一步优化培养基配方和生产流程，结合企业生产实际，调整培养温度、光照时间、光照强度和培养容器，从而降低生产成本提高生产效率，为海三棱藨草试管苗生产的标准化和产业化提供依据。

本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明的繁育方法具有繁殖速度快、种苗一致性好、容易实现标准化生产等特点。为海三棱藨草种质资源的保存及快速扩繁提供有效新途径。

附图说明

图1是海三棱藨草完全去种皮种胚的照片。

图2是海三棱藨草部分去种皮种胚的照片。

图3是海三棱藨草无菌萌发种苗的照片。

图4是海三棱藨草丛芽增殖的照片。

图5是海三棱藨草增殖苗的照片。

图6是海三棱藨草生根苗的照片。

图7是大塑料容器中的生根苗的照片。

图8是小塑料容器中的生根苗的照片。

图9是海三棱藨草组培苗栽培的照片。

具体实施方式

实施例1

1材料与方法

1.1试验材料

选取籽粒饱满的种子为外植体，分为三种处理：①完全去种皮的种胚，②破坏部分种皮的种子，③种皮完整的种子。

1.2试验方法

1.2.1外植体消毒

流水冲洗20min后，在超净工作台上，用72％酒精浸泡15s，0.1％升汞振荡消毒5～15min，再用无菌水冲洗5次洗去残留药液，用无菌滤纸吸干水分后接种于培养基上。

1.2.2培养基配方设计

种子萌发培养基为：MS+6-BA0.5mg·L^-1+GA₃0.5mg·L^-1(单位下同)，增殖培养以MS为基本培养基，壮苗和生根培养以1/2MS为基本培养基。

①增殖培养基：MS+6-BA1.0+IBA0.1；MS+6-BA1.0+TDZ0.002+IBA0.1；MS+6-BA1.0+TDZ0.002+IBA0.2；MS+6-BA2.0+TDZ0.002+IBA0.2；MS+6-BA2.0+TDZ0.002+IBA0.3；MS+6-BA3.0+TDZ0.002+IBA0.3；

②壮苗培养基：1/2MS；1/2MS+6-BA0.05+IBA0.01；1/2MS+6-BA0.1+IBA0.01；1/2MS+6-BA0.2+IBA0.02；1/2MS+6-BA0.5+IBA0.05。

③生根培养基：1/2MS+IBA0.05；1/2MS+IBA0.1；1/2MS+IBA0.2；1/2MS+IBA0.5；1/2MS+NAA0.2；1/2MS+IBA0.2+NAA0.2；

1.2.3切割方法

增殖培养采用丛芽接种的方法，即用手术刀和镊子顺着丛芽中间的缝隙分为2～3株/丛，以丛芽的形式转接，培养30d后统计增殖率、增殖系数。试验设3次重复。

壮苗阶段采用丛芽的方式进行壮苗培养，培养30d后，分切以单芽的形式进行生根培养，培养3周后统计生根率、生根系数。试验设3次重复。

1.2.4培养条件

除特别说明外，上述培养基均添加3％蔗糖和0.6％琼脂粉，pH5.8～6.0。试管苗培养温度为(23～32)℃，光照时间12h/d，光照强度2500lx。

1.2.5培养温度的筛选

选取100丛增殖苗，分为5组，每组20丛，设置培养温度为23℃、25℃、28℃、30℃、32℃，以散射光状态下(约500lx)生长的增殖苗为对照，观察记录不同培养温度对海三棱藨草生长的影响，相同的条件连续观察记录3个生长周期。

1.2.6不同培养容器对接种效率的影响试验

用玻璃容器(底面直径6cm、容量250mL)和大塑料容器(底面直径12cm，容量680mL)进行接种操作。分别统计2h内的接种数量，培养2周时统计污染率情况，培养3周时观察种苗的生根情况。

1.2.7数据统计

每种处理调查20个，统计诱导率、增殖率、生根率、移栽成活率。诱导率＝(出芽外植体数/接种数)×100％；增殖率＝(增殖株数/接种数)×100％；生根率＝(生根株数/接种数)×100％；移栽成活率＝(成活数/接种数)×100％。

统计数据使用Statistica统计分析软件，对各试验数据进行单因素方差分析(ANOVA)，采用Duncan's新复极差法统计各处理显著性水平。

2结果与分析

2.1无菌材料获得试验

海三棱藨草种皮致密坚硬，种子萌发率低，取种子做外植体时，种子做了以下三种处理：①完全去种皮的种胚(100粒，图1)，②去掉部分种皮的种子(300粒，图2)，③种皮完整的种子(200粒)。海三棱藨草种皮与种胚贴合紧密，很难剥取出完整的种胚，剥取过程中对种胚有部分损伤。种子消毒后接种于萌发培养基上2周时，统计发现种皮完整的种子污染率最高，约为38％；而完全去掉种皮的种胚消毒后污染率最低，约为1％。剔除污染材料和消毒死亡的外植体，去掉部分种皮的种子无菌萌发率接近15％。刚萌发的幼苗纤细嫩黄(图3)，随着培养时间的延长，植株逐渐变绿基部变粗壮，并开始有新叶抽出，培养30d左右时，株高可达3cm左右，可进行诱导分化培养。

表1种皮不同处理方式对海三棱藨草无菌萌发的影响

2.2不同植物生长调节剂组合对海三棱藨草增殖的影响

挑选生长健壮的丛生芽转入不同的增殖培养基，接种丛数均为20丛，培养30d时观察生长情况并进行统计。表2结果显示随着6-BA浓度的增加(1.0～3.0mg·L^-1)，增殖系数随之增加，当6-BA浓度达到2.0时，增殖系数可达到2.75；当6-BA浓度提高到3.0mg/L时，芽点虽多，但丛生芽矮化成团状，影响正常生长。因此选用培养基MS+6-BA2.0+TDZ0.002+IBA0.2为海三棱藨草继代增殖的最佳培养基。本试验筛选的培养基组合所得增殖系数可达到2.75，长势良好。

表2不同植物生长调节剂配比对海三棱藨草组培苗增殖的影响

2.3不同温度对海三棱藨草增殖的影响

以MS+6-BA2.0+TDZ0.002+IBA0.2为培养基，设置培养温度为23℃、25℃、28℃、30℃、32℃，观察记录不同培养温度对海三棱藨草生长的影响，相同的条件连续观察记录3个生长周期。表3结果显示，温度低于25℃时，海三棱藨草增殖率低，叶色黄绿色，并有逐渐枯萎现象(图4)，随着培养温度的提高，增殖率显著提高，叶色浓绿，长势旺盛，至30℃时增殖率达到3.25，状态处于最佳(图5)。

表3不同培养温度对海三棱藨草组培苗增殖的影响

2.4不同植物生长调节剂组合对海三棱藨草壮苗的影响

在不同的壮苗培养基中，每瓶接种20株试管苗，培养4周时进行观察统计，如表4所示：不同的壮苗培养基具有不同的增殖系数，随着壮苗培养基中6-BA浓度的升高增殖系数随之增加，各处理间差异显著，而丛生芽的株高则逐渐降低。综合丛生芽的株高和长势情况，选取1/2MS+6-BA0.05+IBA0.01为海三棱藨草的最佳壮苗培养基。通过壮苗阶段，可以提高海三棱藨草种苗的质量和一致性，便于后期生根。

表4不同植物生长调节剂配比对海三棱藨草组培苗壮苗的影响

2.5不同植物生长调节剂组合对海三棱藨草生根的影响

壮苗培养4周时，以单芽的形式转接入生根培养基进行生根培养，每种组合试验株数20株。由表5可以看出，当单独添加IBA时，海三棱藨草根系发达，当浓度为0.2mg·L^-1时生根率最高达到100％，试管苗长势良好，一致性高，根系长度数量均匀适合移栽(图6)，当浓度增加到0.5mg·L^-1时，虽然生根率高，根系发达，但是生根数量过多过长，不利于后期移栽操作。增加NAA时，根基部容易形成愈伤组织，也不利于后期移栽。综合考虑生根率、根系情况、一致性等情况，选择1/2MS+IBA0.2为海三棱藨草的最佳生根培养基。

表5植物生长调节剂对海三棱藨草组培苗生根的影响

2.6不同培养容器对接种效率的影响

统计生根培养中不同容器接种的效果，结果显示：采用较大塑料盒接种速度198株/h，比用玻璃瓶132株/h的速度提高了约50％，而污染率均为5％左右，差别不明显。在两种容器内，海三棱藨草的生根率几乎无差别，但在塑料容器内植株相对较高，这与塑料容器生长空间较大有关(图7、8)。

表6不同培养容器对海三棱藨草接种效率的影响

2.7移栽

海三棱藨草生根培养3周后，根系长达1～2cm，可洗苗移栽。温室移栽时，须洗净根部培养基，再移植入表7所示不同的基质配比中。海三棱藨草植株比较细小，温室移栽初期先选择使用128孔穴盘，种植密度为每孔1棵或2棵。初期保持85～95％的湿度，保证叶面湿润，并定期喷施杀菌剂，后期逐渐降低湿度至70～85％，3个月后，设计的几种基质配比中，珍珠岩：草炭：蛭石＝1：1:1的成活率可达85％以上。(图9)。待种苗根系与基质形成土球状，长势旺盛，再次移栽入可降解穴盘中，生长15天以上，再次选择健壮一致，高度达到20cm的整齐种苗，连同降解穴盘一同安置的湿地中种植。

表7不同介质以及不同种植密度对海三棱藨草组培苗生根的影响

3.结论

水生植物表皮对杀菌剂的通透性强，一般针对陆生植物已成熟的消毒方法不适用水生植物，属于极易污染的植物，离体培养过程中外植体表面灭菌和尔后内生菌抑制的难度都较其它植物高。海三棱藨草生长在滩涂沼泽地，生长点纤细并且埋入土壤中，易感染土壤中各种病菌等微生物，表面消毒处理困难，污染率高。本试验采用种子作为外植体，通过破除部分种皮，即保护内部完整的种胚不受破坏，又破除了种皮致密导致的种子休眠，通过严格控制消毒程序，得到需要的无菌试管苗，是整个离体培养体系的关键起始步骤。

多数陆生植物在离体培养时，适宜温度为25℃，根据孙江成等研究，发现杉叶藻、荇菜、三裂碱毛莨等水生植物离体培养时，最佳温度为20±2℃，而海三棱藨草离体培养时，需要较高的温度，经测试，30℃是其最佳培养温度。这与其自然状态下，生长旺季集中于6～8月需要较高温度的自然特性相一致。

本发明进一步优化了培养流程和培养基的激素组合，并对生根阶段的大容器组培育苗进行了试验，能够有效地降低生产成本，提高生产效率，有利于进行海三棱藨草的标准化生产。大容器育苗在提高接种效率方面具有重要作用，但因为大容器的单瓶接种数量较多、操作时间较长，污染风险相对较高，所以大容器接种适用于硬件设施和环境控制较好的组培室。另外，生根阶段时间相对较短且生根培养后试管苗直接出库，而增殖培养是一个循环的过程而且对材料的无菌性要求高，所以大容器育苗技术应首先应用于生根阶段。

本发明建立了稳定完善的离体培养体系，还首次进行了海三棱藨草的标准化生产，先期生产出了种性一致的种苗5万株，为进一步推广海三棱藨草的应用奠定了种源基础。