培美曲塞二钠或其药学上可接受的盐在制备治疗或预防疱疹病毒感染药物中的应用

摘要

本发明公开了培美曲塞二钠或其药学上可接受的盐在制备治疗或预防疱疹病毒感染药物中的应用，本发明选取选用完全无毒性浓度的培美曲塞二钠进行抗疱疹病毒实验，结果显示该化合物具有显著的抗疱疹病毒病毒活性并呈剂量依赖相关，培美曲塞二钠通过抑制病毒的复制来显示其抗疱疹病毒的效果。通过对不同亚型的疱疹病毒检测显示，培美曲塞二钠具有广谱的抗疱疹病毒的活性，并且选择指数高，可开发为治疗疱疹病毒感染疾病的药物，具有广泛的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地，涉及培美曲塞二钠或其药学上可接受的盐在制备治 疗或预防疱疹病毒感染药物中的应用。

背景技术

疱疹病毒科(Herpesviridae)是一类有包膜的，基因组为双链DNA的病毒科。该科的成 员能广泛地感染动物和人，并诱导相应疾病的产生。目前发现的能感染人的疱疹病毒有八种， 主要包括：单纯疱疹病毒I型(Herpessimplexvirus-1，HSV-1)，单纯疱疹病毒II型(He rpessimplexvirus-2，HSV-2)，水痘-带状疱疹病毒(Varicellazostervirus,VZV),EB病 毒(Epstein-Barrvirus，EBV)，巨细胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)，人类疱疹病毒V I型(HHV-6)，人类疱疹病毒VII型(HHV-7)和卡波氏疱疹病毒(Kaposi'ssarcoma-assoc iatedherpesvirus，KSHV)。根据基因组序列和结构及理化性质的不同,疱疹病毒科又可以分 为三个亚科：α-疱疹病毒亚科，β-疱疹病毒亚科和γ-疱疹病毒亚科。疱疹病毒生活周期分为 典型的裂解期复制和潜伏期复制：在裂解期感染过程中，病毒基因组复制，产生大量成熟的 病毒粒子，诱导多种疾病的发生；在潜伏期感染过程中，基因组处于静息状态，只有少量的 病毒基因表达，但基因组随细胞基因组复制而复制,病毒的潜伏状态同样可以造成机体疾病 的发生。

疱疹病毒的感染能够诱导多种疾病的产生，如造成人口、唇或生殖器的皮肤或粘液膜上 出现水泡、角膜炎、胎儿畸形、智力障碍和感觉神经性耳聋、幼儿急疹等等，甚至能够引起 多种肿瘤疾病的发生(如非霍金奇和霍金奇淋巴瘤、鼻咽癌、淋巴组织增生、卡波氏肉瘤等)。 疱疹病毒感染严重影响人们的生命健康。

然而，治疗或者预防疱疹病毒感染的药物仍有待进一步开发。

发明内容

本发明的目的在于提供培美曲塞二钠或其药学上可接受的盐在制备治疗或预防疱疹病 毒感染药物中的应用，为临床上疱疹病毒的治疗提供一种安全高效毒副作用小的药物。培美 曲塞二钠在无毒性范围内能显著地抑制感染性疱疹病毒粒子的产生、抑制疱疹病毒DNA的 复制，可进一步开发为治疗疱疹病毒感染疾病的药物，具有广泛的应用前景。

培美曲塞二钠(Pemetrexeddisodiumsalt)，商品名为爱宁达、力比泰(Alimta)。化学 名为N-[4-[2-(2-氨基-4,7-二氢-4-氧代-1H-吡咯[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酰]-L-谷氨酸二钠 (n-[4-[2-(2-amino-4,7-dihydro-4-oxo-1h-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)ethyl]benzoyl]-l-glutamic aciddisodiumsalt)。培美曲塞二钠是一类新的抗肿瘤药物，是一种结构上含有核心为吡咯 嘧啶基团的抗叶酸制剂。2004年美国食品药品管理局(FoodandDrugAdministration，FD A)批准培美曲塞用于治疗胸膜间皮瘤(Pleuralmesothelioma)及非小细胞肺癌(Non-smal lcelllungcancer)疾病。

式I

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

培美曲塞二钠或其药学上可接受的盐(如培美曲塞、七水培美曲塞二钠、二水培美曲塞 二钠等)在制备治疗或预防疱疹病毒感染药物中的应用，包括培美曲塞二钠在制备治疗或预 防疱疹病毒感染药物中的应用；包括培美曲塞二钠或其药学上可接受的盐与其他药物联合用 药用于制备治疗或预防疱疹病毒感染药物(即药物组合物)中的应用；或培美曲塞二钠或其 药学上可接受的盐作为唯一有效成分制备治疗或预防疱疹病毒感染的药物中的应用；或培美 曲塞二钠或其药学上可接受的盐用于制备在体外抑制疱疹病毒DNA复制的药物中的应用； 或培美曲塞二钠或其药学上可接受的盐用于制备治疗或者预防人类或者猴疱疹病毒感染的 药物中的应用。

培美曲塞二钠或其药学上可接受的盐在无毒性范围内能显著地抑制感染性疱疹病毒粒 子的产生、抑制疱疹病毒DNA的复制。培美曲塞二钠或其药学上可接受的盐能剂量依赖地 抑制KSHV可感染性病毒粒子的产生；剂量依赖地抑制HSV-1和HSV-2复制造成的细胞病 变；剂量依赖地抑制EBV裂解期复制；剂量依赖地抑制HCMV复制造成的细胞病变。

利用培美曲塞二钠或其药学上可接受的盐制备的治疗或预防疱疹病毒感染的药物，所述 药物的剂型包括但不限于目前药学上可接受任何剂型，包括片剂、注射剂、粉剂、酏剂、胶 囊、混悬液、糖浆、药丸或薄片。

以上所述的疱疹病毒包括但不限于：选自卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)、EB病毒 (EBV)、单纯疱疹病毒I型(HSV-1)、单纯疱疹病毒II型(HSV-2)、水痘-带状疱疹病毒 (VZV)、巨细胞病毒(CMV)、人类疱疹病毒VI型(HHV6)、或人类疱疹病毒VII型(H HV7)。

以上所述的其他药物包括但不限于以下的一种或多种：阿昔洛韦、更昔洛韦、泛昔洛韦、 伐昔洛韦、磷甲酸、西多福韦、缬更昔洛韦、喷昔洛韦、溴呋啶、类固醇、硼替佐米(Bor tezomib)、美罗华(Rituximab)、安挺乐(Tocilizumab)、Siltuximab、雷帕霉素(Rapamyc in)、紫杉醇、环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、强的松。所述的其他药物是疱疹病毒聚合酶 抑制剂，培美曲塞二钠或其药学上可接受的盐可显著抑制疱疹病毒粒子的产生和DNA的复 制，其他药剂和培美曲塞二钠或其药学上可接受的盐以病毒复制的不同阶段为靶标，从而， 所述药物组合物可更加有效地用于治疗或者预防疱疹病毒感染。

以培美曲塞二钠或其药学上可接受的盐为活性成分的药物可以包括药物上可接受的载 体，且药物组合物的剂型和给药方式不受特别限制。对于口服给药，该药物上可接受的载体 可以包括粘合剂，润滑剂，崩解剂，赋形剂，增溶剂，分散剂，稳定剂，悬浮剂，着色剂和 芳香剂。对于注射制剂，药物上可接受的载体可以包括缓冲剂，防腐剂，止痛剂，增溶剂， 等渗压剂(isotonicagent)和稳定剂。对于局部给药的制剂，药物上可接受的载体可以包括 碱，赋形剂，润滑剂和防腐剂。本发明的药物组合物可以与上述的药物上可接受的载体结合 被制备成各种剂型。例如，对于口服给药，药物组合物可以被制备成小片，片剂，胶囊，酏 剂，混悬液，糖浆或薄片。对于注射制剂，药物组合物可以被制备成例如一次剂量的剂型的 安瓿或例如多剂量容器的单元型剂型。药物组合物还可以被制备成溶液，悬浮液，药片，药 丸，胶囊和长效制剂。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.培美曲塞二钠或其药学上可接受的盐在实验中表现抗多种疱疹病毒感染的活性，说明培 美曲塞二钠或其药学上可接受的盐具有广谱的抗疱疹病毒感染的活性。

2.培美曲塞二钠或其药学上可接受的盐在实验对HSV-1、HSV-2、HCMV、EBV及KSHV 的治疗指数分别为：11764、2000、1173.6、1000及22222.2，这说明培美曲塞二钠或其药学 上可接受的盐具有良好的抗疱疹病毒感染的活性。

附图说明

图1本发明实施例1的培美曲塞二钠抑制KSHV裂解期复制的活性检测结果；

其中A显示了培美曲塞二钠对iSLK.219细胞的细胞毒性检测结果和抑制KSHV感染性病 毒粒子的产生的结果；

B显示了在iSLK.219细胞中，培美曲塞二钠抑制KSHV裂解期DNA复制的结果图；

C显示了培美曲塞二钠不影响KSHV病毒粒子的进入的结果图；

D显示了培美曲塞二钠对BCBL-1细胞的细胞毒性检测结果图；

E显示了在BCBL-1细胞中，培美曲塞二钠抑制KSHV裂解期DNA复制的结果图。

图2本发明实施例2的培美曲塞二钠抑制EBV裂解期DNA复制的活性检测结果；

其中A显示了培美曲塞二钠对B95-8细胞的细胞毒性检测结果；

B显示了培美曲塞二钠抑制EBV裂解期DNA复制的结果图。

图3本发明实施例3的培美曲塞二钠抗HSV-1及HSV-2的活性检测结果；

其中A显示了培美曲塞二钠对Vero细胞的细胞毒性检测结果图；

B显示了培美曲塞二钠抗HSV-1活性的结果图；

C显示了培美曲塞二钠抗HSV-2活性的结果图。

图4本发明实施例4的培美曲塞二钠抗HCMV的活性检测结果；

其中A显示了培美曲塞二钠对HFF细胞的细胞毒性检测结果图；

B显示了培美曲塞二钠抗HCMV活性的检测结果图。

具体实施方式

下面将结合具体实施例详细描述本发明的实施例，下面的实施例仅用于说明本发明，而 不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描 述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通 过市购获得的常规产品。本发明实施例以培美曲塞二钠为例对其抗疱疹病毒活性进行说明， 培美曲塞二钠药学上可接受的盐也能产生相同的抗疱疹病毒的效果。

实施例1：

培美曲塞二钠抑制KSHV裂解期复制的检测

1.实验材料

1.1细胞、病毒

iSLK.219细胞由Dr.DonGanem教授惠赠，该细胞为含有重组病毒rKSHV.219和多西 环素(Doxycycline)调控RTA表达系统的SLK细胞。在该细胞中，RTA表达序列被构建入p Retro-XTet-ON诱导表达系统中(Clontech，Mountainview，CA)，该系统的表达受多西 环素的调控，多西环素存的情况下，RTA表达才能发生；293T细胞为本实验室保存，购自美 国模式菌种保藏中心(ATCC)。

培美曲塞二钠购自翰香生物科技公司(Biochempartner)。

1.2试剂

DMEM培养基、1640培养基和FBS购自GIBCO公司；Alamarblue活性检测试剂盒购自P romega公司；SYBR混合液(iTaq^TMUniversalGreenSupermix)购自Bio-Rad公司。

1.3实验仪器

定量RCP仪(Bio-RadCFX96Touch^TMReal-TimePCRdetectionsystem)购自Bio-Ra d公司。多标记微孔板读取仪和高内涵细胞分析仪购自PerkinElmer公司。1.0R 型冷冻离心机和细胞培养箱购自Thermo公司。

2.实验方法与结果

2.1培美曲塞二钠对iSLK.219细胞的细胞毒性检测。

(1)将iSLK.219细胞按照8×10³个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，iSLK.219细胞 培养在37℃，5％CO₂的加湿培养箱中，采用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基培养，培 养基中添加1％青霉素和链霉素，100μg/mL遗传霉素(G418)，100μg/mL潮霉素B和4 μg/mL嘌呤霉素。

(2)多西环素联合丁酸钠可以激活KSHV裂解期发生。用含1μg/mL多西环素和1.2mM 丁酸钠的DMEM培养基梯度稀释培美曲塞二钠。药物(培美曲塞二钠)浓度分别为：2000 微摩尔/升、400微摩尔/升、80微摩尔/升、16微摩尔/升、3.2微摩尔/升、0.64微摩尔 /升、0.128微摩尔/升、0.0256微摩尔/升、0.00512微摩尔/升。含药物的培养基直接添 加到贴壁的iSLK.219细胞中，每组重复三个孔，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。

(3)48小时后，利用Alamarblue活性检测试剂盒检测药物的细胞毒性，此试剂的主要 成分刃天青(Resazurin)是一种氧化还原指示剂其在氧化状态下呈现紫蓝色无荧光性，而 在还原状态下，转变为呈粉红或红色荧光的还原产物，因此，通过细胞内氧化还原环境的改 变指证细胞的活性状态。并用PerkinElmer多标记读板仪(Envison2102MultilabelRea der)读取荧光信号，该仪器以激发波长为530-560nm，发射波长590nm为基础检测样品的 荧光信号。

(4)各组数据以未加药物对照组作为标准组进行归一计算，计算公式＝药物组/未加药物 组*100。计算结果通过GraphPadPrism5软件计算出平均值和标准差。

(5)利用步骤(4)中的计算结果绘制培美曲塞二钠对iSLK.219细胞的细胞毒性检测结 果图(即存活率曲线图)。存活率曲线图如图1A所示。

由图1A可以得出，培美曲塞二钠对iSLK.219细胞的CC₅₀(半数细胞毒性浓度)大于20 00微摩尔/升。

2.2培美曲塞二钠对BCBL-1细胞的细胞毒性检测。

(1)BCBL-1为悬浮细胞，实验时，将BCBL-1细胞按2.5×10⁴个/孔接种于96孔细胞培 养板中，并培养在37℃，5％CO2的加湿培养箱中，培养基采用含10％胎牛血清(FBS)的1 640培养基培养，培养基中添加1％青霉素和链霉素。

(2)佛波肉荳蔻醋酸(TPA)可以激活KSHV裂解期复制。用含TPA(20ng/mL)的1640 培养基梯度稀释药物，稀释后的药物直接添加到BCBL-1细胞中，药物(培美曲塞二钠)的 终浓度分别为：1000微摩尔/升、200微摩尔/升、40微摩尔/升、8微摩尔/升、1.6微摩尔 /升、0.32微摩尔/升、0.064微摩尔/升、0.0128微摩尔/升。每组重复三个孔，置于37℃、 5％CO₂培养箱中培养。

(3)48小时后，利用Alamarblue活性检测试剂盒检测药物的细胞毒性，并用PerkinEl mer多标记读板仪(Envison2102MultilabelReader)读取荧光信号。

(4)各组数据以未加药物对照组作为标准组进行归一计算，计算公式＝药物组/未加药物 组*100。结果通过GraphPadPrism5软件计算出平均值和标准差。

(5)利用步骤(4)中的计算结果绘制培美曲塞二钠对BCBL-1细胞的细胞毒性检测结果 图(即存活率曲线图)。存活率曲线图如图1D所示。

由图1D可以得出，培美曲塞二钠对BCBL-1细胞的CC₅₀大于1000微摩尔/升。

2.3培美曲塞二钠抑制KSHV感染性病毒粒子产生的检测。

(1)将iSLK.219细胞按照8×10³个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，采用10％胎牛血 清(FBS)的DMEM培养基，培养基中添加1％青霉素和链霉素，100μg/mLG418，100μg /mL潮霉素B和4μg/mL嘌呤霉素，并在37℃，5％CO2的加湿培养箱中培养。

(2)多西环素联合丁酸钠可以激活KSHV裂解期复制。用含1μg/mL多西环素和1.2mM 丁酸钠的DMEM培养基梯度稀释培美曲塞二钠。药物(培美曲塞二钠)浓度分别为：2000 微摩尔/升、400微摩尔/升、80微摩尔/升、16微摩尔/升、3.2微摩尔/升、0.64微摩尔 /升、0.128微摩尔/升、0.0256微摩尔/升。含药物的培养基直接添加到贴壁的iSLK.219 细胞中，每组重复三个孔，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。

(3)培养48小时后，收取上清添加到293T细胞中，感染293T细胞1个小时后更换新鲜 的培养基，37℃、5％CO₂培养箱中培养。

(4)48小时后，利用高内涵细胞分析系统检测GFP表达水平。

(5)各组数据以未加药物对照组作为标准组进行归一计算，计算公式＝(未 加药物组-药物组)/未加药物组*100。结果通过GraphPadPrism5软件计算出平均值和标 准差。

(6)利用步骤(5)中的计算结果绘制培美曲塞二钠抑制KSHV感染性病毒粒子产生的结 果图(即抑制率曲线图)，抑制率曲线图如图1A所示。

图1A结果显示培美曲塞二钠能剂量依赖地抑制KSHV可感染性病毒粒子的产生；培美曲 塞二钠对KSHV感染性病毒粒子产生的半数抑制浓度(IC₅₀)为90纳摩尔/升。

2.4培美曲塞二钠抑制KSHVDNA复制的检测。

2.4.1在iSLK.219细胞中，检测培美曲塞二钠抑制KSHVDNA复制的影响。

(1)将iSLK.219细胞按照8×10³个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，采用10％胎牛血 清(FBS)的DMEM培养基，培养基中添加1％青霉素和链霉素，100μg/mLG418，100μg/ mL潮霉素B和4μg/mL嘌呤霉素。在37℃，5％CO2的加湿培养箱中培养。

(2)多西环素联合丁酸钠可以诱导KSHV裂解期复制。用含1μg/mL多西环素和1.2mM 丁酸钠的DMEM培养基梯度稀释培美曲塞二钠。药物(培美曲塞二钠)浓度分别为：200微 摩尔/升、20微摩尔/升、2微摩尔/升、0.2微摩尔/升、0.02微摩尔/升。含药物(培美 曲塞二钠)的培养基直接添加到贴壁的iSLK.219细胞中，每组重复三个孔，置于37℃、5％ CO₂培养箱中培养。

(3)48小时后去除上清，PBS洗细胞2-3次，利用苯酚-氯仿的方法提取细胞内DNA，利 用酒精沉淀DNA，然后将DNA晾干后溶解到TE中。

(4)通过基因组定量PCR方法(QPCR)检测KSHV基因组复制水平。定量RCR引物针对K SHV的LANA基因序列，定量RCR引物如下：

5'-CCGAGGACGAAATGGAAGTG-3'；

5'-GGTGATGTTCTGAGTACATAGCGG-3'。

选择管家基因GADPH作为校正的内参对照基因，针对GADPH的定量RCR引物如下：

5'-GCTCCCTCTTTCTTTGCAGCAAT-3'；

5'-TACCATGAGTCCTTCCACGATAC-3'。

(5)定量的Ct值通过内参基因(GAPDH)进行校对，各组数据以未诱导组作为标准组 进行归一计算，计算公式＝药物组/未诱导对照组。结果通过GraphPadPrism5软件计算出 平均值和标准差。

(6)利用步骤(5)中的计算结果绘制培美曲塞二钠抑制KSHV裂解期DNA复制的结果 图。结果如图1B所示。

图1B结果显示：在iSLK.219细胞中，培美曲塞二钠能剂量依赖地抑制KSHV裂解期DN A复制水平。

2.4.2在BCBL-1细胞中，培美曲塞二钠抑制KSHVDNA复制的检测。

(1)将BCBL-1细胞每孔按2.5×10⁴个细胞接种于96孔细胞培养板中，采用含10％胎牛 血清(FBS)的1640培养基，培养基中添加1％青霉素和链霉素。在37℃，5％CO2的加湿 培养箱中培养。

(2)TPA处理BCBL-1细胞，可以激活KSHV裂解期复制。用含TPA(20ng/mL)的1640 培养基梯度稀释药物，稀释后的药物直接添加到BCBL-1细胞中，药物(培美曲塞二钠)的 终浓度分别为：1000微摩尔/升、200微摩尔/升、40微摩尔/升、8微摩尔/升、1.6微摩尔 /升、0.32微摩尔/升、0.064微摩尔/升、0.0128微摩尔/升。每组重复三个孔，置于37℃、 5％CO₂培养箱中培养。

(3)48小时后，离心收集细胞，PBS洗2-3次，利用苯酚-氯仿的方法提取细胞内DNA， 利用酒精沉淀DNA，晒干后溶解到TE中。

(4)通过基因组定量PCR方法(QPCR)检测KSHV基因组复制水平。定量的引物针对KS HV的LANA基因序列，引物：

5'-CCGAGGACGAAATGGAAGTG-3'；

5'-GGTGATGTTCTGAGTACATAGCGG-3。

选择管家基因GADPH作为校正的内参对照基因。针对GADPH的定量RCR引物如下：

5'-GCTCCCTCTTTCTTTGCAGCAAT-3'；

5'-TACCATGAGTCCTTCCACGATAC-3'。

(5)定量的Ct值通过内参基因进行校对，各组数据以未诱导组作为标准组进行归一计算， 计算公式＝药物组/未诱导对照组。结果通过GraphPadPrism5软件计算出平均值和标准差。

(6)利用步骤(5)中的计算结果绘制培美曲塞二钠抑制KSHV裂解期DNA复制的结果图。 结果如图1E所示。

图1E结果显示：在BCBL-1细胞中，培美曲塞二钠能剂量依赖地抑制KSHV裂解期DNA 复制水平。

2.5培美曲塞二钠对KSHV病毒粒子的进入的影响。

(1)利用多西环素(1μg/mL)和丁酸钠(1.2mM)诱导iSLK.219细胞进入裂解期，处 理48小时。

(2)收集细胞上清，通过超速离心收集病毒，转速为30000转，时间为3小时，去除上 清。病毒用无血清培养基重悬稀释。

(3)用步骤(2)所得病毒感染293T，通过检测293T细胞GFP荧光的方法测定病毒的滴 度，并确定合适的病毒感染滴度。

(4)一定滴度的病毒粒子(moi＝10)与不同浓度的药物混合后加入到293T细胞中，药物 浓度梯度为：2000微摩尔/升、400微摩尔/升、80微摩尔/升、16微摩尔/升、3.2微摩 尔/升。感染1小时后，293T细胞更换新鲜的DMEM培养基。每组重复三个孔，置于37℃、5％ CO₂培养箱中培养。

(5)培养48小时后，利用高内涵细胞分析系统分析293T细胞中GFP的表达情况，结果 如图1C所示。

图1C结果显示，培美曲塞二钠不影响KSHV病毒粒子的进入。

实施例2：

培美曲塞二钠抑制EBV裂解期DNA复制的检测

1.实验材料

1.1细胞、病毒

B95-8细胞由武汉大学基础医学院孙晓平教授惠赠，该细胞中含有EBV病毒基因组全序 列。用20ng/mLTPA联合诱导可以使该病毒进入裂解期复制。

1.2试剂

1640培养基和FBS购自GIBCO公司；Alamarblue活性检测试剂盒购自Promega公司；S YBR混合液(iTaq^TMUniversalGreenSupermix)购自Bio-Rad公司。

1.3实验仪器

多标记微孔板读取仪购自PerkinElmer公司；荧光定量PCR仪(Bio-RadCFX96Touch ^TMReal-TimePCRdetectionsystem)购自伯乐公司；1.0R型冷冻离心机和细胞 培养箱购自Thermo公司。

2.实验方法与结果

2.1培美曲塞二钠对B95-8细胞的细胞毒性检测。

(1)B95-8细胞为半贴壁细胞，实验时，按照5×10³个细胞/孔接种于96孔细胞培养板 中，采用加有10％胎牛血清(FBS)的1640培养基培养，培养基添加1％青霉素和链霉素。 细胞在37℃，5％CO₂加湿培养箱中培养。

(2)TPA可以激活EBV裂解期复制。用含20ng/mLTPA的1640培养基梯度稀释培美曲 塞二钠，将含药物的培养基直接添加到B95-8细胞中，使细胞悬液中所含药物(培美曲塞二 钠)的终浓度分别为：2000微摩尔/升、200微摩尔/升、20微摩尔/升、2微摩尔/升、0. 2微摩尔/升、0.02微摩尔/升。每组重复三个孔，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。

(3)48小时后，利用Alamarblue活性检测试剂盒检测药物的细胞毒性,并用PerkinElm er多标记读板仪(Envison2102MultilabelReader)读取荧光信号。

(4)各组数据以未加药物为对照组作为标准组进行归一计算，计算公式＝药物组/未加药 物组*100。

结果通过GraphPadPrism5软件计算出平均值和标准差。

(5)利用步骤(4)中的计算结果绘制培美曲塞二钠对B95-8细胞的细胞毒性检测结果 图。结果如图2A所示。

由图2A结果显示：培美曲塞二钠对B95-8细胞的CC₅₀大于2000微摩尔/升。

2.2培美曲塞二钠抑制EBV基因组复制的检测

(1)B95-8细胞为半贴壁细胞，实验时，按照5×10³个细胞/孔接种于96孔细胞培养板 中，采用加有10％胎牛血清(FBS)的1640培养基培养，培养基添加1％青霉素和链霉素。 细胞在37℃，5％CO₂加湿培养箱中培养。

(2)TPA可以激活EBV裂解期复制。用含20ng/mLTPA的1640培养基梯度稀释培美曲 塞二钠，将含药物的培养基直接添加到B95-8细胞中，使细胞悬液中所含药物(培美曲塞二 钠)的终浓度分别为：2000微摩尔/升、200微摩尔/升、20微摩尔/升、2微摩尔/升、0. 2微摩尔/升、0.02微摩尔/升、0.002微摩尔/升。每组重复三个孔，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。

(3)药物处理48h后，离心收集细胞，利用苯酚-氯仿的方法提取细胞内DNA。

(4)通过定量PCR方法(QPCR)检测EBV基因组复制水平。定量PCR的引物为特异性针 对EBV的EBNA1基因的序列。定量PCR引物如下：

5'-GCCGGTGTGTTCGTATATGG-3'

5'-CAAAACCTCAGCAAATATATGAG-3'。

选择管家基因GADPH为校正的内参对照基因。针对GADPH的定量PCR引物下：

5'-GCTCCCTCTTTCTTTGCAGCAAT-3'；

5'-TACCATGAGTCCTTCCACGATAC-3'。

(5)各组数据以未加药物对照组作为标准组进行归一计算，计算公式＝(未加药物-药物组) /未加药物*100。结果通过GraphPadPrism5软件计算出平均值和标准差。

(6)利用步骤(5)中的计算结果绘制培美曲塞二钠抑制EBV裂解期DNA复制的结果图。 结果如图2B所示。

图2B结果显示：培美曲塞二钠能剂量依赖地抑制EBV裂解期复制，对EBV裂解期DNA 复制的IC₅₀为2微摩尔/升。

实施例3:培美曲塞二钠抗HSV-1及HSV-2活性的检测

1.实验材料

1.1细胞、病毒

Vero细胞为本实验室保存，购自美国模式菌种保藏中心(ATCC)。HSV-1为F株，为中 科院武汉病毒所保藏中心保存。HSV-2为G株，为中科院武汉病毒所保藏中心保存。

1.2试剂

DMEM培养基和FBS购自GIBCO公司；Alamarblue活性检测试剂盒购自Promega公司； 结晶紫染色液。

1.3实验仪器

多标记微孔板读取仪和高内涵细胞分析仪购自PerkinElmer公司；细胞培养箱为Therm o公司产品。

2.实验方法与结果

2.1培美曲塞二钠对Vero细胞的细胞毒性检测。

(1)将Vero细胞按照8×10³个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，采用加有10％胎牛血 清(FBS)的DMEM培养基，培养基中添加1％青霉素和链霉素。在37℃，5％CO2的加湿培 养箱中培养。

(2)Vero细胞贴壁后添加梯度药物(培美曲塞二钠)处理。药物浓度分别为：2000微 摩尔/升、400微摩尔/升、80微摩尔/升、16微摩尔/升、3.2微摩尔/升、0.64微摩尔/ 升、0.128微摩尔/升、0.0256微摩尔/升、0.00512微摩尔/升。稀释后的药物直接添加到 贴壁的Vero细胞中，每组三个重复。将加有药物的细胞置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。

(3)48小时后，利用Alamarblue活性检测试剂盒检测药物的细胞毒性，并用PerkinEl mer多标记读板仪(Envison2102MultilabelReader)读取荧光信号。

(4)各组数据以未加药物对照组作为标准组进行归一计算，计算公式＝(未加药物-药物 组)/未加药物*100。结果通过GraphPadPrism5软件计算出平均值和标准差。

(5)利用步骤(4)中的计算结果绘制培美曲塞二钠对Vero细胞的细胞毒性检测结果图。 如图3A所示。

图3A结果显示：培美曲塞二钠对的Vero细胞的CC₅₀大于2000微摩尔/升。

2.2培美曲塞二钠抑制HSV-1导致的细胞空斑形成的检测。

(1)提前24小时将vero细胞接种到24孔板中，待细胞生长至100％汇合度时，更换含2％ FBS的培养基，并接种病毒。

(2)HSV-1病毒按0.1PFU每细胞的滴度加入细胞中，37℃培养2小时。

(3)更换添加了梯度药物(培美曲塞二钠)的培养基，药物浓度分别为：20微摩尔/升、 2微摩尔/升、0.2微摩尔/升、0.02微摩尔/升、0.002微摩尔/升。稀释后的药物直接添 加到Vero细胞中，每组三个重复。将加有药物的细胞置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。

(4)48小时后，去除上清，PBS洗细胞，之后加入500μl的结晶紫染液，摇晃20分钟， 用大量水清洗至空斑清晰，统计空斑数目。

(5)各组数据以未加药对照组作为标准进行归一计算，计算公式＝(未加药物组-药物组) /未加药物组*100。结果通过GraphPadPrism5软件计算出平均值和标准差。

(6)利用步骤(5)中的计算结果绘制培美曲塞二钠抑制HSV-1病毒复制空斑形成的检测 结果图。结果如图3B所示。

由图3B结果显示，培美曲塞二钠抑制HSV-1复制空斑形成的IC₅₀为0.17微摩尔/升。

2.3培美曲塞二钠影响HSV-2造成细胞空斑形成的检测。

(1)提前24小时将vero细胞接种到24孔板中，待细胞生长至100％汇合度时，更换含2％ FBS的培养基，并接种病毒。

(2)HSV-2病毒按0.1PFU每细胞的滴度加入细胞中，37℃培养2小时。

(3)更换添加含有梯度药物(培美曲塞二钠)的培养基，药物浓度分别为：200微摩尔/ 升、20微摩尔/升、2微摩尔/升、0.2微摩尔/升、0.02微摩尔/升。稀释后的药物直接添 加到Vero细胞中，每组三个重复。将加有药物的细胞置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。

(4)48小时后，去除上清，PBS洗细胞，之后加入500μl的结晶紫染液，摇晃20分钟， 用大量水清洗至空斑清晰，统计空斑数目。

(5)各组数据以未加药对照组作为标准进行归一计算，计算公式＝(未加药物组-药物组) /未加药物组*100。结果通过GraphPadPrism5软件计算出平均值和标准差。

(6)利用步骤(5)中的计算结果绘制培美曲塞二钠抗HSV-2病毒复制的检测结果图。检 测结果如图3C所示。

图3C结果显示：培美曲塞二钠抑制HSV-2复制空斑形成的IC₅₀为1微摩尔/升。

实施例4:培美曲塞二钠抑制HCMV复制的检测

1.实验材料

1.1细胞、病毒

HFF细胞及HCMV(Towen株)为中科院武汉病毒所罗敏华研究员惠赠。

1.2试剂

DMEM培养基和FBS购自GIBCO公司；Alamarblue活性检测试剂盒购自Promega公司； 含0.5％琼脂糖的DMEM；4％的甲醛；1％(W/V)结晶紫染液。

1.3实验仪器

多标记微孔板读取仪和高内涵细胞分析仪购自PerkinElmer公司；细胞培养箱购自The rmo公司。

2.实验方法与结果

2.1培美曲塞二钠对HFF细胞的细胞毒性检测。

(1)将每孔10⁴个HFF细胞铺入96孔板中，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，待细胞贴 壁。

(2)细胞贴壁后添加梯度药物(培美曲塞二钠)处理。药物浓度分别为：1000微摩尔/ 升、200微摩尔/升、40微摩尔/升、8微摩尔/升、1.6微摩尔/升、0.32微摩尔/升、0. 064微摩尔/升、0.0128微摩尔/升、0.00256微摩尔/升。稀释后的药物直接添加到贴壁的 HFF细胞中，每组三个重复。将加有药物的细胞置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。

(3)培养5天后，利用Alamarblue活性检测试剂盒检测药物的细胞毒性，并用PerkinE lmer多标记读板仪(Envison2102MultilabelReader)读取荧光信号。

(4)各组数据以未加药物对照组作为标准组进行归一计算，计算公式＝(未加药物组-药 物组)/未加药物组*100。结果通过GraphPadPrism5软件计算出平均值和标准差。

(5)利用步骤(4)中的计算结果绘制培美曲塞二钠对HFF细胞的细胞毒性检测结果图。 结果如图4A所示。

由图4A结果得出：培美曲塞二钠对HFF细胞的CC₅₀大于1000微摩尔/升。

2.2培美曲塞二钠抗HCMV活性检测。

(1)提前将每孔10⁵个HFF细胞铺入24孔板中，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，待细 胞贴壁。

(2)细胞贴壁后，感染MOI为0.001的HCMV，感染3个小时后，更换含梯度药物(培美 曲塞二钠)和0.5％琼脂的培养基。待培养基凝固后放入培养箱培养。药物浓度分别为：200 微摩尔/升、40微摩尔/升、8微摩尔/升、1.6微摩尔/升、0.32微摩尔/升。

(3)培养5天后，吸弃覆盖物，每孔加入一定量的3.7％甲醛，室温放置30分钟；吸弃 甲醛，加入1％(W/V)结晶紫，于室温放置30分钟，用流水冲洗，凉干后即可数斑。

（4）各组数据以未加药对照组作为标准进行归一计算，计算公式=（未加药物组-药物组） /未加药物组*100。结果通过GraphPadPrism5软件计算出平均值和标准差。

（5）利用步骤（4）中的计算结果绘制培美曲塞二钠抑制HCMV病毒复制空斑形成的检测 结果图。结果如图4B所示。

图4B结果显示：培美曲塞二钠抑制HCMV复制空斑形成的IC₅₀为5.77微摩尔/升。

实施例1～4检测的培美曲塞二钠对宿主细胞的CC_5O和对疱疹病毒的IC₅₀的结果如表1所示。

表1

“a”和“b”表示在Vero细胞中检测的结果

“c”表示在HFF细胞中检测的结果

“d”表示在B95-8细胞中检测的结果

“e”表示iSLK.219细胞中检测的结果

“f”表示选择指数(SI)，计算公式：SI＝CC₅₀/IC₅₀

综上结果可以看出，培美曲塞二钠具有广谱的抑制疱疹病毒裂解期复制的效果。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、 或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包 含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针 对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或 多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员 可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的， 不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进 行变化、修改、替换和变型。