一种促进人角质形成细胞表达炎症因子IL-8的方法

摘要

本发明公开了一种促进离体的人角质形成细胞表达炎症因子IL-8的方法，包括步骤a2)：用苯扎氯铵处理离体的人角质形成细胞。所述步骤a2)中，用浓度为0.973μg/mL的苯扎氯铵处理所述离体的人角质形成细胞；用苯扎氯铵处理离体的人角质形成细胞的条件参数为：37℃、2h。所述方法还包括如下步骤a1)：将离体的人角质形成细胞的细胞悬液接种至细胞培养板，培养；在进行所述步骤a2)前先进行所述步骤a1)。所述步骤a1)中，所述细胞悬液中的细胞浓度为19000个/cm2；培养条件为37℃、24h。实验证明，本发明提供的方法可以显著促进人表皮角质形成细胞中炎症因子IL-8的表达，从而可以用于筛选治疗炎症的药物。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种促进人角质形成细胞表达炎症因子IL-8的方法。

背景技术

炎症因子是一类小分子多肽和糖蛋白，具有调节和介导免疫反应、炎症反应的作用，包括白介素类、干扰素类、肿瘤坏死因子类、生长因子类以及趋化因子类。细胞受到刺激后产生大量的炎症因子，直接或间接影响淋巴细胞或周围细胞，在免疫调节、炎症反应、细胞凋亡中起重要作用。

白细胞介素-8(IL-8)是趋化因子超家族中的一员，又称趋化因子8，它与炎症性疾病密切相关。人的许多细胞经适当刺激后均能产生IL-8，如血管内皮细胞、上皮细胞、角质细胞、成纤维细胞等。人的IL-8基因(基因全长5191bp，由4个外显子和3个内含子组成)是一种早期应答基因，在细胞受到刺激后，IL-8基因表达量会迅速升高。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是促进人角质形成细胞表达炎症因子IL-8。

为解决上述问题，本发明首先提供了一种促进离体的人角质形成细胞表达炎症因子IL-8的方法，可包括如下步骤a2)：用苯扎氯铵处理离体的人角质形成细胞。

所述步骤a2)中，可用浓度为0.9-1.0μg/mL的苯扎氯铵处理所述离体的人角质形成细胞。

所述步骤a2)中，具体可用浓度为0.973μg/mL的苯扎氯铵处理所述离体的人角质形成细胞。

所述步骤a2)中，用苯扎氯铵处理离体的人角质形成细胞的条件参数可为：35-39℃、1.5h-2.5h。

所述步骤a2)中，用苯扎氯铵处理离体的人角质形成细胞的条件参数具体可为：37℃、2h。

所述方法还包括如下步骤：在进行所述步骤a2)前，进行步骤a1)；所述步骤a1)为：将离体的人角质形成细胞的细胞悬液接种至细胞培养板，培养。

所述步骤a2)可为：完成所述步骤a1)后，取所述细胞培养板，加入苯扎氯铵并培养。

所述步骤a1)中，所述细胞悬液中人角质形成细胞的浓度可为18000-20000个/cm²。

所述步骤a1)中，所述细胞悬液中人角质形成细胞的浓度具体可为19000个/cm²。

所述步骤a1)中，所述培养的条件可为：35-39℃、18h-26h。

所述步骤a1)中，所述培养的条件具体可为：37℃、24h。

所述步骤a1)中，所述细胞悬液的接种量可为100μL/孔。

上述任一所述炎症因子IL-8的基因序列可如序列表中序列1所示。

所述苯扎氯铵的加入形式可为苯扎氯铵溶液。

上述任一所述苯扎氯铵溶液可为用DMEM培养基溶解苯扎氯铵得到的溶液。

上述任一所述细胞悬液的制备方法具体如下：用0.25％胰蛋白酶消化离体的人角质形成细胞，然后用含10％胎牛血清(体积百分比)的DMEM培养基重悬。

上述任一所述DMEM培养基的制备方法具体如下：将高糖DMEM固体培养基(Gibco公司产品)13.5g和NaHCO₃3.7g依次溶于水，pH调至7.2-7.4，然后定容至1L。

上述任一所述人角质形成细胞可为人表皮角质形成细胞。

所述苯扎氯铵具体可为北京百灵威科技有限公司产品，产品目录号为#928512。

实验证明，本发明提供的方法可以显著促进人表皮角质形成细胞中炎症因子IL-8的表达，从而可以用于筛选治疗炎症的药物。本发明对于抗炎药物的开发具有重大价值。

附图说明

图1为MTT法测定不同浓度的苯扎氯铵溶液处理人表皮角质形成细胞的存活率。

图2为炎症因子IL-8在苯扎氯铵溶液不同处理时间下的表达量。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量实验，如无特殊说明均设置三次重复，结果取平均值。

苯扎氯铵为北京百灵威科技有限公司产品，产品目录号为#928512。

人表皮角质形成细胞为北京富隆康泰生物技术有限公司产品；胎牛血清为Hyclone公司产品，产品目录号为SH30084.03；0.25％胰蛋白酶为Hyclone公司产品，产品目录号为SH30042.01；DMSO为sigma公司产品，产品目录号为D2650。

DMEM培养基：将高糖DMEM固体培养基(Gibco公司产品)13.5g和NaHCO₃3.7g依次溶于水，pH为7.2-7.4，定容至1L。使用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，于4℃保存。

MTT溶解液：将MTT(sigma公司产品)5g溶于上述DMEM培养基，定容至1L。使用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，于4℃保存。

PBS缓冲液：购买自hyclone公司，货号SH30256.01B。

实施例1、确定人表皮角质形成细胞的最佳接种细胞密度和苯扎氯铵处理浓度

设置试验组，进行三次重复试验，每次重复试验的步骤均如下：

1、用0.25％胰蛋白酶消化人表皮角质形成细胞，然后用含10％胎牛血清(体积百分比)的DMEM培养基重悬并稀释，获得细胞密度为15600个/cm²的细胞悬浮液1、细胞密度为19000个/cm²(实际应用中18000-20000个/cm²均可)的细胞悬浮液2、细胞密度为22000个/cm²的细胞悬浮液3和细胞密度为25000个/cm²的细胞悬浮液4。

2、用DMEM培养基溶解苯扎氯铵，获得苯扎氯铵溶液。

3、取96孔培养板，每孔接种100μL步骤1获得的细胞悬浮液(细胞悬浮液1、细胞悬浮液2、细胞悬浮液3或细胞悬浮液4)，在37℃(实际应用中37±2℃均可)、5％CO₂环境中培养24h(实际应用中18h-26h均可)。

4、完成步骤3后，取所述96孔板，加入步骤2制备的苯扎氯铵溶液，得到处理体系，处理体系中的苯扎氯铵的浓度为0.05μg/mL、0.15μg/mL、0.46μg/mL、1.37μg/mL、4.11μg/mL、12.35μg/mL、37.03μg/mL、111.1μg/mL、333.3μg/mL或1000μg/mL(每个苯扎氯铵浓度设置3个复孔)，5％CO₂、37℃培养44h(实际应用中40h-48h均可)，然后加入20μLMTT溶解液，继续5％CO₂、37℃培养4h。

5、完成步骤4后，取所述96孔板，吸弃孔内的液体，用PBS缓冲液清洗2次，然后每孔加入150μLDMSO，采用酶标仪检测570nm处的吸光值。

设置空白对照组：用等体积含10％胎牛血清(体积百分比)的DMEM培养液代替细胞悬浮液，其它操作同试验组。每个苯扎氯铵浓度设置3个复孔。

设置细胞对照组：用等体积DMEM培养基代替苯扎氯铵溶液，其它操作同试验组。每种细胞悬浮液设置3个复孔。

以苯扎氯铵在处理体系中的浓度为横坐标，人表皮角质形成细胞的存活率为纵坐标，比较不同浓度的苯扎氯铵处理后人表皮角质形成细胞的存活率。

实验结果见图1。在细胞密度分别为15600个/cm²、19000个/cm²、22000个/cm²和25000个/cm²，细胞存活率为80％的条件下，苯扎氯铵溶液在处理体系中的浓度分别为0.931μg/mL、0.973μg/mL、1.22μg/mL和0.98μg/mL。综合考虑苯扎氯铵在处理体系中的浓度较低且细胞铺板密度较低两个因素，确定人表皮角质形成细胞的最佳接种细胞密度为19000个/cm²，苯扎氯铵在处理体系中的浓度为0.973μg/mL。

实施例2、处理时间的优化

进行三次重复试验，每次重复试验的步骤均如下：

1、将实施例1制备的细胞悬浮液2接种于6孔板，37℃、5％CO₂环境中培养24h(实际应用中18h-26h均可)。

2、用DMEM培养基溶解苯扎氯铵，获得苯扎氯铵溶液。

3、取6孔板：向6孔板中的第一个孔中加入苯扎氯铵溶液，使处理体系中的苯扎氯铵浓度为0.973μg/mL(实际应用中0.9-1.0μg/mL均可)，5％CO₂、37℃培养1h，吸弃上层培养基，加适量PBS缓冲液洗涤，吸弃，收取细胞，命名为细胞A；向6孔板中的第二个孔中加入苯扎氯铵溶液，使处理体系中的苯扎氯铵浓度为0.973μg/mL(实际应用中0.9-1.0μg/mL均可)，5％CO₂、37℃培养2h(实际应用中1.5-2.5h均可)，吸弃上层培养基，加适量PBS缓冲液洗涤，吸弃，收取细胞，命名为细胞B；向6孔板中的第三个孔中加入苯扎氯铵溶液，使处理体系中的苯扎氯铵浓度为0.973μg/mL(实际应用中0.9-1.0μg/mL均可)，5％CO₂、37℃培养4h，吸弃上层培养基，加适量PBS缓冲液洗涤，吸弃，收取细胞，命名为细胞C；向6孔板中的第四个孔中加入苯扎氯铵溶液，使处理体系中的苯扎氯铵浓度为0.973μg/mL(实际应用中0.9-1.0μg/mL均可)，5％CO₂、37℃培养6h，离心，去上层培养基，加适量PBS缓冲液洗涤，吸弃，收取细胞，命名为细胞D；向6孔板中的第五个孔中加入苯扎氯铵溶液，使处理体系中的苯扎氯铵浓度为0.973μg/mL(实际应用中0.9-1.0μg/mL均可)，5％CO₂、37℃培养8h，吸弃上层培养基，加适量PBS缓冲液洗涤，吸弃，收取细胞，命名为细胞E；将6孔板中的第六个孔，吸弃上层培养基，加适量PBS缓冲液洗涤，吸弃，收取细胞，命名为细胞F。

4、用EastepTM总RNA提取试剂盒(普洛麦格(北京)生物技术有限公司产品，产品目录号为CAT#LS1030)提取细胞(细胞A、细胞B、细胞C、细胞D、细胞E或细胞F)的总RNA，提取步骤按试剂盒自带说明书进行。

5、将步骤4获得的总RNA用FastQuantRTKit(WithgDNase)(天根生化科技(北京)有限公司产品，产品目录号为KR106-01)进行cDNA第一条链合成反应，得到cDNA，向上述cDNA加入ddH₂O稀释，得到cDNA浓度为1000ng/μL的模板溶液。

6、荧光定量PCR扩增：

以步骤5得到的模板溶液为模板，通过荧光定量PCR检测细胞中炎症因子IL-8的相对表达量(以GADPH基因为内参基因)。炎症因子IL-8的基因序列如序列表中序列1所示，GADPH基因的序列如序列表中序列2所示。

鉴定炎症因子IL-8的引物为5’-TCAGAGACAGCAGAGCACAC-3’和5’-GGCAAAACTGCACCTTCACA-3’，目的片段如序列表中序列1自5’末端第72位至第230位所示。

内参为管家基因GADPH，内参的引物为actin-F：5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’和actin-R：5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’，目的片段如序列表中序列2自5’末端第748位至第1199位所示。

其中荧光定量PCR上样体系按照OneStepPrimeScript^TMRT-PCRKitII(PerfectRealTime)(TaKaRa公司产品)的说明书上样，反应体系为共20μl，10.0μlMIX、0.4μlDyeⅡ、0.5μl正向引物(含5ng引物)、0.5μl反向引物(含5ng引物)、1μl模板溶液和7.6μlddH₂O。

将细胞F中炎症因子IL-8的相对表达量作为1，各个细胞(细胞A、细胞B、细胞C、细胞D或细胞E)中炎症因子IL-8的相对表达量见图2。

细胞A、细胞B、细胞C、细胞D和细胞E中炎症因子IL-8的表达量分别为细胞F中炎症因子IL-8的表达量的0.68倍、1.03倍、0.37倍、0.42倍和0.39倍。可见，苯扎氯铵的最佳处理时间为2h。

结果表明，提高人表皮角质细胞中炎症因子IL-8的表达量的最佳条件为：接种细胞密度19000个/cm²、苯扎氯铵在处理体系中的浓度为0.973μg/mL和处理时间2h。