一种同时分离土大黄苷和去氧土大黄苷的工业化生产技术

摘要

本发明涉及一种同时分离土大黄苷和去氧土大黄苷的工业化生产技术，所述方法步骤如下：将大黄粉碎，用70％酒精回流提取两次，合并提取液浓缩至无酒精味，上聚酰胺层析柱吸附，用水洗掉大极性水溶性杂质，然后用酒精梯度洗脱，分别收集土大黄苷和去氧土大黄苷洗脱液，浓缩至有结晶析出，过滤干燥，再用酒精重结晶得含量≥98.5％的土大黄苷和含量≥98.5％的去氧土大黄苷。

说明书

技术领域

本发明属于医药领域，涉及一种能够同时分离土大黄苷和去氧土 大黄苷的工业化生产技术。

背景技术

土大黄苷的分子结构式如下：

CAS：155-58-8分子式：C21H24O9

去氧土大黄苷的分子结构式如下：

CAS：30197-14-9分子式：C21H24O8

大黄为蓼科植物掌叶大黄、唐古特大黄或药用大黄的干燥根及根 茎，是我国传统中药，已经有几千年的使用历史，里面所含的大量蒽 醌类化合物，具有泻下通便、破积滞、解毒消痈等作用，《中国药典》 里规定不得检出土大黄苷，但国内外研究结果表明土大黄苷和去氧土 大黄苷等二苯乙烯苷类化合物具有抗菌、改善微循环、降血脂、降血 压、降血糖、抗肿瘤、抑制过敏反应、调节机体免疫防御系统、抗血 栓及抗氧化等作用，韩国科学家的研究还表明土大黄苷具有一定的美 白作用，作为具有生物活性的天然有机化合物单体，有望将其开发为 创新药物。土大黄、河套大黄、西宁大黄、羊蹄大黄、华北大黄中的 土大黄苷和去氧土大黄苷含量比较高，开发一种适合于工业化生产的 技术大量制备土大黄苷和去氧土大黄苷，将其用于药物研究并最终开 发为新药造福人类具有重要的意义。

我们对现有工艺技术进行研究后发现，都存在或多或少的不足。 其中，专利申请号为201210139975.3，发明名称为《一种快速制备高 纯度土大黄苷和脱氧土大黄苷的方法》，由于受设备及工艺的限制， 每次只能制备几百毫克的样品，远远不能满足新药研究和生产的需要。 其中，专利申请号为201110212533.2，发明名称为《从河套大黄中提 取土大黄苷的方法》，制备过程中使用低沸点易燃易爆有机溶剂萃取， 不但收率低而且容易发生安全事故，而且只制备了土大黄苷一种化合 物，没有得到去氧土大黄苷，造成资源浪费。其中，专利申请号为 201210166053.1，发明名称为《一种高效率精准分离纯化去氧土大黄 苷的方法》，由于需要经过两次大孔树脂纯化，工艺冗长，而且只得 到去氧土大黄苷一种化合物，没有得到土大黄苷，也造成资源的浪费。

聚酰胺层析分离技术是八十年代发展起来的一种新技术，是分离 科学领域的重大创新，在天然有机化合物的分离纯化中得到广泛应用， 尤其是对酚类化合物的分离效果更好。它具有分离纯化工艺简单、聚 酰胺再生处理方便、聚酰胺化学性质稳定、可重复使用数百次甚至上 千次等诸多优点，深受植物活性成分提取行业的青睐。它的分离原理 是根据有机化合物的极性大小以及分子中羟基和羰基等官能团与聚 酰胺中的酰胺基团形成氢键的强弱进行分离，在用水和酒精溶液等强 极性溶剂为洗脱溶剂的情况下相当于反相色谱，极性大的先洗脱下来， 弱极性的后洗脱下来；当使用弱极性溶剂如二氯甲烷、石油醚、正己 烷等为洗脱溶剂的情况下相当于正相色谱。在工业化生产过程中，只 需食用酒精洗脱和再生就可以，制备的目标化合物无有毒有害溶剂残 留，因此，采用聚酰胺分离纯化天然有机化合物已经得到天然产物化 学、植物提取等领域专家的普遍认可。

由于土大黄苷分子和去氧土大黄苷分子的极性差别比较大又属 于酚类有机化合物，因此本发明使用聚酰胺对多种大黄中的土大黄苷 和去氧土大黄苷进行分离纯化，充分利用药材资源大批量生产高纯度 土大黄苷和去氧土大黄苷满足药物研究需要。选用聚酰胺作为分离材 料、梯度洗脱用酒精浓度的确定、重结晶方法以及重结晶母液中土大 黄苷和去氧土大黄苷的回收纯化等工艺的选择也得本发明主要改进 的地方。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够同时分离土大黄苷和去氧土大 黄苷的生产工艺，该工艺生产流程简单，操作方便，不使用有毒有害 溶剂，只使用食用酒精，而且还具有生产成本低，产品纯度高，适合 于工业化生产等特点。

本发明所述的生产工艺，包括以下步骤：

1)将大黄粉碎，

2)用酒精提取大黄，提取液浓缩至无酒精味，加水得大黄提取液，

3)将大黄提取液过滤后，上聚酰胺层析柱吸附，先用纯化水洗脱， 后用酒精梯度洗脱，将含有土大黄苷和去氧土大黄苷的洗脱液分 别收集并浓缩至有结晶析出，过滤，干燥，得到土大黄苷粗品和 去氧土大黄苷粗品，

4)将两种粗品分别用酒精重结晶，离心，过滤干燥，即得土大黄 苷和去氧土大黄苷，

5)将土大黄苷重结晶母液减压回收酒精，加水稀释，上聚酰胺层 析柱纯化得土大黄苷，将去氧土大黄苷重结晶母液减压回收酒精， 加水稀释，上聚酰胺树脂纯化得去氧土大黄苷。

其中，步骤1)中大黄是指土大黄、河套大黄、西 宁大黄、羊蹄大黄、华北大黄。

其中，步骤2)酒精提取是常温提取或加热回流提取，药材与 酒精质量体积比为1:1至1:20，酒精浓度是20％‐95％。

其中，步骤4)梯度洗脱用酒精浓度分别是0‐40％和50％‐95％。

其中，步骤4)制备得到的土大黄苷的含量≥98.5％，去氧土大 黄苷的含量≥98.5％。

其中，步骤5)重结晶用酒精浓度是20％‐95％，粗品与酒精的 质量体积比为1:1至1:20。

其中，步骤5)制备得到的土大黄苷，含量为98.9％，回收率≥ 90％；制备得到的去氧土大黄苷，含量为98.7％，回收率≥90％。

其中，本发明所述酒精为食用酒精。

优选的，本发明的生产工艺，步骤如下：

1)将大黄粉碎成粉末，

2)按1:1至1:20的质量体积比向大黄粉末中加入浓度为20％‐95％ 的酒精溶液，加热回流提取1‐3小时，提取次数为1‐3次，合并提取 液浓缩至无酒精味，加水得大黄提取液，

3)将大黄提取液过滤后上聚酰胺层析柱吸附，先用水洗脱，然 后用1‐3倍柱体积的浓度为10‐50％酒精洗脱，之后再用浓度50‐95％ 的酒精洗脱至目标分子完全洗脱下来，土大黄苷先被洗脱下来，去氧 土大黄苷后被洗脱下来，分别收集土大黄苷和去氧土大黄苷洗脱液， 浓缩至有结晶析出，过滤，干燥，得到土大黄苷粗品和去氧土大黄苷 粗品，

4)将土大黄苷粗品和去氧土大黄苷粗品分别用1‐20倍的20‐95％ 酒精加热回流溶解，加活性炭脱色，室温自然结晶过滤，干燥，得到 土大黄苷和去氧土大黄苷，

5)将土大黄苷重结晶母液减压回收酒精，加水稀释，上聚酰胺 层析柱纯化得土大黄苷，将去氧土大黄苷重结晶母液减压回收酒精， 加水稀释，上聚酰胺树脂纯化得去氧土大黄苷。

进一步优选的，本发明所述的生产工艺，包括以下步骤：

1)将大黄粉碎成粉末，

2)按1:7‐10的质量体积比向大黄粉末中加入浓度为50％‐85％的酒 精溶液，加热回流提取2小时，提取次数为2次，合并提取液浓缩至 无酒精味，加水得大黄提取液，

3)将大黄提取液过滤后上聚酰胺层析柱吸附，先用水洗脱，然 后用1‐3倍柱体积的浓度为20‐50％酒精洗脱，之后再用浓度50‐80％ 的酒精洗脱至目标分子完全洗脱下来，土大黄苷先被洗脱下来，去氧 土大黄苷后被洗脱下来，分别收集土大黄苷和去氧土大黄苷洗脱液， 浓缩至有结晶析出，过滤，干燥，得到土大黄苷粗品和去氧土大黄苷 粗品，

4)将土大黄苷粗品和去氧土大黄苷粗品分别用8‐12倍的70‐85％ 酒精加热回流溶解，加活性炭脱色，室温自然结晶过滤，干燥，得到 土大黄苷和去氧土大黄苷，

5)将土大黄苷重结晶母液减压回收酒精，加水稀释，上聚酰胺 层析柱纯化得土大黄苷，将去氧土大黄苷重结晶母液减压回收酒精， 加水稀释，上聚酰胺树脂纯化得去氧土大黄苷。

进一步优选的，本发明所述的生产工艺，包括以下步骤：

1)将大黄用万能粉碎机粉碎，得到目数为60目的药材粉末，

2)按1:10的料液质量体积比向所述药材粗粉中加入浓度为70％的 酒精溶液，置于带搅拌的提取罐中加热回流提取2小时，提取 次数为2次，合并提取液浓缩至无酒精味，加水得大黄提取液，

3)将大黄提取液过滤后上聚酰胺层析柱吸附，先用水洗去极性大 的水溶性杂质，然后用两倍柱体积的浓度为30％酒精洗脱，再 用60％酒精洗脱至目标分子完全洗脱下来，土大黄苷先被洗脱 下来，去氧土大黄苷后被洗脱下来，分别收集土大黄苷和去氧 土大黄苷洗脱液，浓缩至有结晶析出，过滤干燥得相应粗品，

4)将土大黄苷和去氧土大黄苷粗品分别用8倍的75％酒精加热回 流溶解，加活性炭脱色，室温自然结晶过滤，50℃以下热风 烘箱干燥，得到土大黄苷和去氧土大黄苷，

5)将土大黄苷重结晶母液减压回收酒精，加水稀释，上聚酰胺层 析柱纯化得土大黄苷，将去氧土大黄苷重结晶母液减压回收酒 精，加水稀释，上聚酰胺树脂纯化得去氧土大黄苷。

为了检测土大黄苷和去氧土大黄苷的含量，本发明提供了一种 可以对两种成分同时进行检测的方法，检测过程如下：

1.所需仪器和设备

Agilent1200高效液相色谱仪(配有：四元泵、柱温箱、DAD检 测器)；梅特勒-托利多XP205DR型电子天平；艾科浦AML-0502-M型 纯水制备机；KQ-250DB型超声波脱气机。

2.所需试剂

土大黄苷对照品(含量≥98％，购自四川省维克奇生物科技有限 公司，批号：150420)；去氧土大黄苷对照品(上海弘顺生物科技有 限公司，批号：150301)；乙醇为分析纯，北京化工厂；乙腈为色谱 纯，默克；水为超纯水，自制。

3.溶液配制

标准溶液：分别精密称取土大黄苷和去氧土大黄苷对照品3.2mg 和3.5mg，置于10mL容量瓶中用70％乙醇超声溶解并定容至刻度， 摇匀，即得对照品溶液。

样品溶液：分别精密称取一定质量的土大黄苷和去氧土大黄苷样 品置于容量瓶中，以70％乙醇超声溶解并定容，配制成一定浓度的溶 液，使之浓度在线性范围之内。

4.测定步骤

①高效液相色谱条件

色谱柱：AgilentZORBAXEclipsePlusC18(4.6mm×100mm， 3.5μm)；柱温：25℃；流动相：乙腈-水梯度洗脱，洗脱程序见下表； 流速：1.0mL/min；检测波长：320nm；柱温：30℃。

表1洗脱程序

②标准曲线的制备

以高效液相色谱仪自动进样器分别精密进样2、4、6、8、10μL 标准品溶液进行分析测定，以峰面积Y对进样量X(μg)进行线性回 归，得回归方程。土大黄苷：Y＝3909.8X-25.79(r＝0.9998)；去氧土 大黄苷：Y＝4205.1X+49.988(r＝0.9996)。

③供试液含量测定

将样品溶液用0.22μm的微孔滤膜过滤，按照高效液相色谱条件 进样10μL进行分析测定，以外标法分别计算样品溶液中土大黄苷和 去氧土大黄苷的含量。

④计算公式

样品中土大黄苷和去氧土大黄苷的含量(g/100g)计算公式为： C(g/100g)＝(Cx×V)×100/Ms

式中：Cx—样品溶液中的土大黄苷和去氧土大黄苷浓度(mg/mL)；

V—样品溶液体积，mL；

Ms—称取样品质量(mg)。

本发明考虑到，土大黄苷分子和去氧土大黄苷分子的极性差别比 较大又属于酚类有机化合物，本发明通过对现有分离方法进行改进， 意外的发现使用聚酰胺对多种大黄中的土大黄苷和去氧土大黄苷进 行分离纯化具有非常好的效果，可以有效提高产品的纯度和收率。此 外，本发明相对于现有方法还具有以下特点：快速有效的将土大黄苷 和去氧土大黄苷同时进行分离、纯化，工艺操作简单、分离过程用时 短、成本低、所用溶剂无毒，既保证生产人员的健康安全，又不破坏 周围环境。

此外，现有技术中很难同时从大黄中分离土大黄苷和去氧土大黄 苷两种成分，一般都是分别分离提取，而且工艺复杂，用时长。本发 明很好的解决该问题，能够快速有效的将土大黄苷和去氧土大黄苷同 时进行分离、纯化，所得产品的纯度都高于98.7％以上。

具体实施方式：

通过以下具体实施例对本发明作进一步的说明，但不作为本发明 的限制。

实施例1、

将200公斤河套大黄粉碎成40目，加1600公斤75％酒精，室温 搅拌提取2小时，按以上方法再提取一次，合并提取液，于60℃以 下减压浓缩至无酒精味，加1000公斤水并过滤，上已处理好的聚酰 胺层析柱吸附，用水洗去大极性杂质，然后用30％酒精洗脱两倍柱体 积，再用50％酒精洗脱至目标分子完全洗脱下来，先收集土大黄苷洗 脱液，然后收集去氧土大黄苷洗脱液，分别于60℃以下减压浓缩至 刚刚有结晶析出，冷至室温离心机分离，于50℃以下热风烘箱中干 燥，得土大黄苷粗品15.6公斤，含量为94.8％，去氧土大黄苷粗品 3.1公斤，含量为96.2％。将两种粗品分别投入反应釜中加10倍70％ 酒精加热回流溶解，加粗品质量10％的活性炭脱色30分钟，趁热过 滤，通冷却水自然结晶，次日离心机分离，于50℃以下热风烘箱中 干燥，得土大黄苷13.4公斤，含量为98.6％，去氧土大黄苷2.7公斤， 含量为98.8％.

实施例2、

将200公斤土大黄粉碎成80目，加1800公斤60％酒精，搅拌回 流提取1.5小时，按以上方法再提取一次，合并提取液，于60℃以 下减压浓缩至无酒精味，加1000公斤水并过滤，上已处理好的聚酰 胺层析柱吸附，用水洗去大极性杂质，然后用20％酒精洗脱三倍柱体 积，再用60％酒精洗脱至目标分子完全洗脱下来，先收集土大黄苷洗 脱液，然后收集去氧土大黄苷洗脱液，分别于60℃以下减压浓缩至 刚刚有结晶析出，冷至室温离心机分离，于50℃以下热风烘箱中干 燥，得土大黄苷粗品14.8公斤，含量为95.2％，去氧土大黄苷粗品 3.8公斤，含量为95.8％。将两种粗品分别投入反应釜中加8倍80％ 酒精加热回流溶解，加粗品质量10％的活性炭脱色30分钟，趁热过 滤，通冷却水自然结晶，次日离心机分离，于50℃以下热风烘箱中 干燥，得土大黄苷12.9公斤，含量为98.5％，去氧土大黄苷3.3公斤， 含量为98.9％.

实施例3、

将200公斤羊蹄大黄粉碎成60目，加2000公斤50％酒精，搅拌 回流提取1小时，按以上方法再提取一次，合并提取液，于60℃以 下减压浓缩至无酒精味，加1000公斤水并过滤，上已处理好的聚酰 胺层析柱吸附，用水洗去大极性杂质，然后用40％酒精洗脱一点五倍 柱体积，再用55％酒精洗脱至目标分子完全洗脱下来，先收集土大黄 苷洗脱液，然后收集去氧土大黄苷洗脱液，分别于60℃以下减压浓 缩至刚刚有结晶析出，冷至室温离心机分离，于50℃以下热风烘箱 中干燥，得土大黄苷粗品15.3公斤，含量为94.1％，去氧土大黄苷粗 品6.3公斤，含量为96.6％。将两种粗品分别投入反应釜中加12倍 85％酒精加热回流溶解，加粗品质量10％的活性炭脱色30分钟，趁 热过滤，通冷却水自然结晶，次日离心机分离，于50℃以下热风烘 箱中干燥，得土大黄苷12.8公斤，含量为98.7％，去氧土大黄苷5.3 公斤，含量为99.0％.

实施例4、

将200公斤华北大黄粉碎成40目，加1400公斤85％酒精，室温 搅拌提取2小时，按以上方法再提取一次，合并提取液，于60℃以 下减压浓缩至无酒精味，加1000公斤水并过滤，上已处理好的聚酰 胺层析柱吸附，用水洗去大极性杂质，然后用25％酒精洗脱两点五倍 柱体积，再用75％酒精洗脱至目标分子完全洗脱下来，先收集土大黄 苷洗脱液，然后收集去氧土大黄苷洗脱液，分别于60℃以下减压浓 缩至刚刚有结晶析出，冷至室温离心机分离，于50℃以下热风烘箱 中干燥，得土大黄苷粗品14.2公斤，含量为95.7％，去氧土大黄苷粗 品4.2公斤，含量为96.8％。将两种粗品分别投入反应釜中加9倍70％ 酒精加热回流溶解，加粗品质量10％的活性炭脱色30分钟，趁热过 滤，通冷却水自然结晶，次日离心机分离，于50℃以下热风烘箱中 干燥，得土大黄苷11.8公斤，含量为99.1％，去氧土大黄苷3.7公斤， 含量为98.6％.

实施例5、土大黄苷和去氧土大黄苷重结晶母液的纯化

将土大黄苷重结晶母液合并，于60℃以下减压回收酒精至无酒 精味，加水稀释上已处理好的聚酰胺层析柱吸附，先用水将大极性杂 质洗掉，然后用35％酒精洗脱，洗脱液合并于60℃以下减压浓缩至 刚刚有结晶析出，冷至室温离心机分离，得土大黄苷，含量为98.9％， 回收率≥90％；将去氧土大黄苷重结晶母液合并，于60℃以下减压 回收酒精至无酒精味，加水稀释上已处理好的聚酰胺层析柱吸附，先 用水将大极性杂质洗掉，然后用45％酒精洗脱，洗脱液合并于60℃ 以下减压浓缩至刚刚有结晶析出，冷至室温离心机分离，得去氧土大 黄苷，含量为98.7％，回收率≥90％。

实验例1、

本发明的生产工艺是经过大量实验研究后得到的，本发明对分离 条件进行系统的筛选，以下列举部分筛选实验：

1)分离材料的筛选(50％酒精等度洗脱)

分离材料 土大黄苷含量 去氧土大黄苷含量 AB‐8大孔树脂 64.8％ 68.2％ D‐101大孔树脂 76.4％ 74.6％ HDP‐200A大孔树脂 69.5％ 67.3％ 聚酰胺 86.6％ 88.7％

从以上数据可以看出，聚酰胺的分离效果明显好于其他分离材料。

2)酒精洗脱方法的筛选

以上数据表明，经过梯度洗脱，粗品中土大黄苷和去氧土大黄苷 含量明显提高。

3)重结晶方法的筛选

以上实验结果表明，重结晶时用活性炭脱色后产品内在质量得到 明显提高。

4)重结晶母液纯化方法的筛选

以上实验结果表明，重结晶母液用聚酰胺纯化是最佳选择。

实验例2、本发明与现有工艺进行比较

比较结果如下：