一种花生种子的黄曲霉田间侵染的方法

摘要

本发明公开了一种花生种子的黄曲霉田间侵染的方法。本发明包括种植花生试验材料、选择最佳侵染时期、制备黄曲霉孢子悬浮液、侵染、样品采集等步骤。本发明与现有技术相比，十分接近于田间花生生长环境，能够真实的模拟花生种子在田间被黄曲霉侵染的环境，利于后续进行科学鉴定等研究工作，能够提高鉴定结果的准确程度及其稳定性，对环境无污染。通过本发明的方法，能够提高花生种子的黄曲霉田间侵染效率，其侵染率达到100％。

说明书

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，特别涉及一种花生种子的黄曲霉田间侵染的方法，更特 别的涉及一种提高花生种子的黄曲霉田间侵染效率的方法。

背景技术

花生(ArachishypogaeaL.)是世界四大油料作物之一，是我国主要的油料作物、经济 作物和出口创汇作物，在国家油脂安全和农产品国际贸易中占有举足轻重的地位。近年来， 食品安全问题日益严重，花生食品安全备受关注。

花生很容易受到黄曲霉毒素(AFT)的污染。黄曲霉毒素是迄今毒性最强的一类生物毒素， 具有致畸、致癌和致诱变作用，严重威胁着人类的生命健康。黄曲霉毒素污染严重制约了我 国花生产业发展，已成为影响花生生产、加工、贸易和食品安全的世界性问题。各国都在加 大对黄曲霉的预防和控制，并实施严格的安全限量标准。因此，解决黄曲霉毒素污染，保障 我国油脂安全迫在眉睫。通过分子生物学手段，研究花生黄曲霉抗性相关基因，利用转基因 技术可以将外源有益基因资源引入花生，以及利用离体诱变可创造花生新种质，拓宽花生遗 传基础，提高栽培种花生的黄曲霉抗性。抗性基因的功能分析及抗性植株的筛选鉴定成功与 否依赖于花生种子田间黄曲霉侵染体系的建立。研究者们利用不同花生基因型、不同时期， 通过玉米培养基田间土壤侵染和盆栽侵染得到了侵染植株，建立了花生田间侵染的方法，但 侵染效率低而且出现假阳性，这就严重影响了这些工作的顺利进行。

目前鲜见提高花生种子田间黄曲霉侵染的相关报道，本试验在侵染过程的各个环节，包 括试验材料的种植，黄曲霉孢子悬浮液的制备，侵染操作以及侵染后的取样，都进行了系统 试验，旨在为花生种子田间黄曲霉高效率侵染及实验材料的制备提供有效方法。

发明内容

本发明提供一种花生种子的高侵染率的田间侵染的方法，以便于后续探索出一些较好的、 比较适用的方法来控制和预防花生种子的黄曲霉侵染。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一种花生种子的黄曲霉田间侵染 的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)种植花生实验材料：选择独立专用的沙土地地块，起垄，选取生长力旺盛、未感染黄 曲霉的花生种子进行播种并覆膜；

2)制备黄曲霉孢子悬浮液：在花生收获前50-38天制备孢子悬浮液，配制察氏培养基， 分装至试管，封口，经灭菌后，置于平面上，管口处垫高使试管倾斜角度为25-45°，室温 冷却30分钟以上，至培养基凝固后将黄曲霉菌株接种于察氏培养基斜面上，封口，置于培养 箱中光照培养5-10天，孢子浓度合适时加重蒸水洗脱并制备孢子悬浮液，加入助悬剂，使孢 子浓度为5×10⁶个/mL，分装于无菌离心管；

3)花生侵染：取出花生，在合适的花生荚果上制造伤口，用注射器吸取孢子悬浮液注射 至花生荚果伤口处，每1个荚果注射0.02-1mL孢子悬浮液并进行标记后将其放回原处并覆土， 5-10天内避免施水；

4)样品采集：步骤3)后10-20天取出侵染过的花生，分离种皮与籽仁，后处理后冷冻。

进一步地，步骤1)中所述的垄垄宽110cm，垄高40cm，播种采用一垄两行的方法，行 间距30cm，种间距30cm，种子距垄边40cm。

进一步地，步骤2)中所述制备孢子悬浮液的时间为花生收获前40-44天，所述察氏培 养基分装量为试管容量的四分之一，所述试管倾斜角度为30°，室温冷却时间为45分钟以 上。

进一步地，步骤2)中，培养箱中光照培养7天，培养箱温度为28-30℃，所述助悬剂为 质量浓度为0.1％的吐温-80无菌水溶液。

进一步地，步骤3)中，取出花生的时机为花生收获前35天，所述合适的花生荚果为双 仁果。

进一步地，步骤3)中在合适的花生荚果上制造伤口的具体操作为：用工型钉将花生果 腰处果壳刺破，刺破荚果背面或者腹面，背面工型钉与果柄方向呈倾斜120-150°，腹面工 型钉与果柄方向呈倾斜30-60°，深度为超出果壳0.05-0.3cm。

进一步地，步骤3)中使用量程为1mL的无菌注射器每1个花生荚果注射0.1mL孢子悬 浮液。

进一步地，步骤4)中取出侵染过的花生的时间为步骤3)后14天，所述后处理为将种 皮与籽仁分别用带有标记的锡纸包裹，液氮冷冻后，放于冰箱保存。

再进一步地，步骤4)中冰箱保存温度为-80℃。

进一步地，步骤2)中所述的察氏培养基通过如下步骤配制：将NaNO₃3.0g、K₂HPO₄1.0g、 MgSO₄·7H₂O0.5、KCl0.5g、FeSO₄·4H₂O0.01g、蔗糖30、琼脂粉20g加入蒸馏水1L，加 热溶解，分装后于121℃以上灭菌20min。

本发明使用的黄曲霉菌株为As33.2890(中国科学院微生物研究所)。

本发明的有益效果：

本发明的发明人经大量创造性劳动得到了一种花生种子的高侵染率的黄曲霉田间侵染的 方法，能够便于后续探索出一些较好的、比较适用的方法来控制和预防花生种子的黄曲霉侵 染，可减少花生种子的黄曲霉侵染，有利于提高经济作物的收益率。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任 何形式对本发明进行限制。

实施例1：

1)种植花生实验材料：

选择独立专用的合适的沙土地地块，起垄，垄宽110cm，垄高40cm，选取生长力旺盛未 感染黄曲霉的花生种子，采用常规方法单粒播种，一垄两行，行间距30cm，种间距30cm，种 子距垄边40cm，覆膜，花生收获前35天实施黄曲霉侵染；

2)制备黄曲霉孢子悬浮液：

花生收获前42天制备孢子悬浮液，配制察氏培养基，分装至25cm试管，固体培养基分 装量为试管容量的四分之一，用棉塞封口，经高温高压灭菌后，放置于生物安全柜台面，管 口处垫高使试管倾斜30°角制作斜面，室温冷却45分钟以上，直至培养基凝固，用于接种 黄曲霉菌。使用接种环蘸取提前准备好的黄曲霉菌株，划线接种于察氏培养基斜面上，棉塞 封口，放置于28摄氏度培养箱，光照培养7天。血球计数板计数孢子浓度为10⁷-10⁸个/mL 时，加1mLddH₂O洗脱，制备孢子悬浮液，加0.1％吐温-80稀释，使孢子浓度为5×10⁶个/mL， 分装于2mL无菌离心管，用于侵染；

3)花生侵染：

侵染时期为花生收获前35天。使用爪形园艺工具从花生垄侧面扒土，避免花生机械损伤， 露出花生荚果，选择双仁果，用工型钉将花生果腰处果壳刺破，刺破荚果背面或者腹面，背 面工型钉与果柄方向呈倾斜135°，腹面工型钉与果柄方向呈倾斜45°，深度为超出果壳 0.1cm，用注射器，吸取孢子悬浮液1mL，通过花生荚果针孔处注射，每1个荚果注射0.1mL 孢子悬浮液，针头注射方式同工型钉果壳刺孔方式。用吸水纸擦去果壳表面多余的液体。侵 染的花生荚果果柄用黄色塑料皮筋系扣标记。使用铲土园艺工具，将花生荚果覆土，恢复垄 型。侵染后的花生苗1周内避免施水，1周后常规管理；

4)样品采集：

黄曲霉侵染花生后14天取样。取样时，深层松土，避免花生机械损伤，摘取黄曲霉侵染 荚果，迅速剥壳去壳，将种皮与籽仁分离，分别用带有标记的锡纸包裹，液氮冷冻后，于-80℃ 冰箱保存。

实施例2：

1)种植花生实验材料：

选择独立专用的合适的沙土地地块，起垄，垄宽110cm，垄高40cm，选取生长力旺盛未 感染黄曲霉的花生种子，采用常规方法单粒播种，一垄两行，行间距30cm，种间距30cm，种 子距垄边40cm，覆膜，花生收获前35天实施黄曲霉侵染；

2)制备黄曲霉孢子悬浮液：

花生收获前40天制备孢子悬浮液，配制察氏培养基，分装至25cm试管，固体培养基分 装量为试管容量的二分之一，用棉塞封口，经高温高压灭菌后，放置于生物安全柜台面，管 口处垫高使试管倾斜25°角制作斜面，室温冷却45分钟以上，直至培养基凝固，用于接种 黄曲霉菌。使用接种环蘸取提前准备好的黄曲霉菌株，划线接种于察氏培养基斜面上，棉塞 封口，放置于28摄氏度培养箱，光照培养7天。血球计数板计数孢子浓度为10⁷-10⁸个/mL 时，加1mLddH₂O洗脱，制备孢子悬浮液，加0.1％吐温-80稀释，使孢子浓度为5×10⁶个/mL， 分装于2mL无菌离心管，用于侵染；

3)花生侵染：

侵染时期为花生收获前35天。使用爪形园艺工具从花生垄侧面扒土，避免花生机械损伤， 露出花生荚果，选择双仁果，用工型钉将花生果腰处果壳刺破，刺破荚果背面或者腹面，背 面工型钉与果柄方向呈倾斜120°，腹面工型钉与果柄方向呈倾斜60°，深度为超出果壳 0.05cm，用注射器，吸取孢子悬浮液1mL，通过花生荚果针孔处注射，每1个荚果注射0.02mL 孢子悬浮液，针头注射方式同工型钉果壳刺孔方式。用吸水纸擦去果壳表面多余的液体。侵 染的花生荚果果柄用黄色塑料皮筋系扣标记。使用铲土园艺工具，将花生荚果覆土，恢复垄 型。侵染后的花生苗1周内避免施水，1周后常规管理；

4)样品采集：

黄曲霉侵染花生后10天取样。取样时，深层松土，避免花生机械损伤，摘取黄曲霉侵染 荚果，迅速剥壳去壳，将种皮与籽仁分离，分别用带有标记的锡纸包裹，液氮冷冻后，于-80℃ 冰箱保存。

实施例3：

1)种植花生实验材料：

选择独立专用的合适的沙土地地块，起垄，垄宽110cm，垄高40cm，选取生长力旺盛未 感染黄曲霉的花生种子，采用常规方法单粒播种，一垄两行，行间距30cm，种间距30cm，种 子距垄边40cm，覆膜，花生收获前35天实施黄曲霉侵染；

2)制备黄曲霉孢子悬浮液：

花生收获前44天制备孢子悬浮液，配制察氏培养基，分装至25cm试管，固体培养基分 装量为试管容量的三分之一，用棉塞封口，经高温高压灭菌后，放置于生物安全柜台面，管 口处垫高使试管倾斜45°角制作斜面，室温冷却45分钟以上，直至培养基凝固，用于接种 黄曲霉菌。使用接种环蘸取提前准备好的黄曲霉菌株，划线接种于察氏培养基斜面上，棉塞 封口，放置于28摄氏度培养箱，光照培养7天。血球计数板计数孢子浓度为10⁷-10⁸个/mL 时，加1mLddH₂O洗脱，制备孢子悬浮液，加0.1％吐温-80稀释，使孢子浓度为5×10⁶个/mL， 分装于2mL无菌离心管，用于侵染；

3)花生侵染：

侵染时期为花生收获前35天。使用爪形园艺工具从花生垄侧面扒土，避免花生机械损伤， 露出花生荚果，选择双仁果，用工型钉将花生果腰处果壳刺破，刺破荚果背面或者腹面，背 面工型钉与果柄方向呈倾斜150°，腹面工型钉与果柄方向呈倾斜30°，深度为超出果壳 0.3cm，用注射器，吸取孢子悬浮液1mL，通过花生荚果针孔处注射，每1个荚果注射1mL 孢子悬浮液，针头注射方式同工型钉果壳刺孔方式。用吸水纸擦去果壳表面多余的液体。侵 染的花生荚果果柄用黄色塑料皮筋系扣标记。使用铲土园艺工具，将花生荚果覆土，恢复垄 型。侵染后的花生苗1周内避免施水，1周后常规管理；

4)样品采集：

黄曲霉侵染花生后20天取样。取样时，深层松土，避免花生机械损伤，摘取黄曲霉侵染 荚果，迅速剥壳去壳，将种皮与籽仁分离，分别用带有标记的锡纸包裹，液氮冷冻后，于-80℃ 冰箱保存。

对比例1：

1)种植花生实验材料：

选择独立专用的合适的沙土地地块，起垄，垄宽110cm，垄高40cm，选取生长力旺盛未 感染黄曲霉的花生种子，采用常规方法单粒播种，一垄两行，行间距30cm，种间距30cm，种 子距垄边40cm，覆膜，花生收获前35天实施黄曲霉侵染；

2)制备黄曲霉孢子悬浮液：

花生收获前42天制备孢子悬浮液，配制察氏培养基，分装至25cm试管，固体培养基分 装量为试管容量的四分之一，用棉塞封口，经高温高压灭菌后，放置于生物安全柜台面，管 口处垫高使试管倾斜60°角制作斜面，室温冷却45分钟以上，直至培养基凝固，用于接种 黄曲霉菌。使用接种环蘸取提前准备好的黄曲霉菌株，划线接种于察氏培养基斜面上，棉塞 封口，放置于28摄氏度培养箱，光照培养7天。血球计数板计数孢子浓度为10⁷-10⁸个/mL 时，加1mLddH₂O洗脱，制备孢子悬浮液，加0.1％吐温-80稀释，使孢子浓度为5×10⁶个/mL， 分装于2mL无菌离心管，用于侵染；

3)花生侵染：

侵染时期为花生收获前35天。使用爪形园艺工具从花生垄侧面扒土，避免花生机械损伤， 露出花生荚果，选择双仁果，用工型钉将花生果腰处果壳刺破，刺破荚果背面或者腹面，背 面工型钉与果柄方向呈倾斜90°，腹面工型钉与果柄方向呈倾斜90°，深度为超出果壳 0.1cm，用注射器，吸取孢子悬浮液2mL，通过花生荚果针孔处注射，每1个荚果注射1mL 孢子悬浮液，针头注射方式同工型钉果壳刺孔方式。用吸水纸擦去果壳表面多余的液体。侵 染的花生荚果果柄用黄色塑料皮筋系扣标记。使用铲土园艺工具，将花生荚果覆土，恢复垄 型。侵染后的花生苗1周内避免施水，1周后常规管理；

4)样品采集：

黄曲霉侵染花生后14天取样。取样时，深层松土，避免花生机械损伤，摘取黄曲霉侵染 荚果，迅速剥壳去壳，将种皮与籽仁分离，分别用带有标记的锡纸包裹，液氮冷冻后，于-80℃ 冰箱保存。

实施例4：

将不同品种的花生分别按照实施例1-3与对比例1的方法得到的花生种子侵染率测定数 据对比试验：

将花生种子取出用无菌水清洗并干燥，打碎，过20目筛，使用ELISA试剂盒进行检测， 试验结果如下表：

表1花生种子侵染率

由上表结果能够看出，本发明通过大量创造性的劳动得到了高侵染率的花生种子田间侵 染的方法及其具体参数，能够方便高效的得到侵染黄曲霉菌的花生种子，能够为后续科学研 究、鉴定提供便利，降低科研成本，减少科研人员的不必要的劳动，有利于抗黄曲霉花生种 质鉴定创新以及黄曲霉抗性相关重要基因资源的发掘鉴定。

上述实施例只是为了说明本发明的技术构思及特点，其目的是在于让本领域内的普通技 术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡是根据本 发明内容的实质所作出的等效的变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。