小麦-长穗偃麦草抗白粉病易位系选育方法及其分子标记

摘要

本发明提供一种小麦-十倍体长穗偃麦草抗白粉病易位系选育方法。本发明还提供以所述小麦-十倍体长穗偃麦草抗白粉病易位系选育方法选育得到的T5ES-5DL易位系偃11-20及其后代的分子鉴定方法。以本发明的方法所育的小麦-十倍体长穗偃麦草T5ES-5DL易位系偃11-20对当前黄淮麦区白粉病菌表现免疫，实现了抗源的多样化，其植物学特征特性表现优良，在小麦育种上具有更广泛的利用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及育种技术，具体是一种小麦-十倍体长穗偃麦草抗白粉病易位系选育方法及所育的T5ES-5DL易位系偃11-20的分子标记。

背景技术

小麦白粉病(Powderymildew)是危害小麦生产的的主要病害，是由小麦白粉病菌(Blumeriagraminisf.sp.tritici,Bgt)引起的一种世界性真菌病害。在我国，20世纪70年代以前，小麦白粉病主要在湿润多雨的西南地区及山东沿海地区流行，20世纪80年代以后，随着耕作制度、肥水条件和气候条件等因素的改变，以及小麦白粉病菌生理小种的变异，该病害发生面积不断扩大，已发展成为中国小麦生产中发病面积最大的常发性病害，重病地块小麦减产达20％～30％。据统计，2004～2009年白粉病在我国平均发生面积达685万hm²(见参考文献：何中虎,兰彩霞,陈新民,邹裕春,庄巧生,夏先春.小麦条锈病和白粉病成株抗性研究进展与展望.中国农业科学,2011,44(11):2193-2215)。因此，抗白粉病新品种的选育和新抗性资源的挖掘与利用一直是小麦育种工作者研究的热点。

小麦种内的遗传资源有限，缺少抗白粉病等许多有益基因。小麦近缘种属与普通小麦品种间遗传距离较远，是普通小麦遗传改良的重要基因资源，利用其与小麦杂交易育成抗性持久的小麦种质，改善病原菌的致病性变异不易克服的特性。因此，把小麦野生近缘属的有益基因导入普通栽培小麦已成为目前小麦品种改良的重要而有效的途径之一。

长穗偃麦草(Elytrigiaelongata)是小麦的一个重要野生近缘种，有二倍体(2n＝2x＝14，EE或E^eE^e或E₁E₁)、四倍体(2n＝4x＝28，E^eE^eE^bE^b或E₁E₁E₂E₂和十倍体(2n＝10x＝70，E^eE^eE^bE^bE^xE^xStStStSt或EEE₁E₁E₂E₂E₄E₄E₅E₅)3种类型。长穗偃麦草易与小麦杂交，是偃麦草属中最先同小麦杂交成功并广泛利用的物种之一，具有普通栽培小麦所缺少的优良性状，是普通小麦遗传改良的重要野生种质资源。通过数十年的研究，目前在长穗偃麦草中已发现的重要性状基因有抗赤霉病(见参考文献：FuS,LvZ,QiB,GuoX,LiJ,LiuB,HanF.Molecularcytogeneticcharacterizationofwheat-Thinopyrumelongatumaddition,substitutionandtranslocationlineswithanovelsourceofresistancetowheatFusariumHeadBlight.JGenetGenomics.2012,39:103-110)、秆锈(见参考文献：NiuZ,KlindworthDL,YuG,FriesenTL,ChaoS,JinY,CaiX,OhmJB,RasmussenJB,XuSS.DevelopmentandcharacterizationofwheatlinescarryingstemrustresistancegeneSr43derivedfromThinopyrumponticum.TheorApplGenet,2014,127:969-980)、条锈(见参考文献：郝薇薇,汤才国,李葆春,郝晨阳,张学勇.小麦-十倍体长穗偃麦草广谱抗锈易位系的鉴定及分析.中国农业科学,2012,45(16):3240-3248)、矮秆(见参考文献：ChenG,ZhengQ,BaoY,LiuS,WangH,LiX.MolecularcytogeneticidentificationofanoveldwarfwheatlinewithintrogressedThinopyrumponticumchromatin.JournalofBiosciences,2012,37:149-155)和光合作用(见参考文献：彭远英,彭正松,宋会兴.小麦中国春背景下长穗偃麦草光合作用相关基因的染色体定位.中国农业科学,2005,38(11):2182-2188)等。但是，从十倍体长穗偃麦草中发掘白粉病抗性基因的报道很少。

当前，在小麦生产上依然有效且利用较多的抗白粉病基因有Pm2、Pm4和Pm21，其中Pm21被认为是目前世界上抗谱最广、抗性最稳定的白粉病抗性基因，对我国所有的白粉病菌株均表现很好的抗性(见参考文献：詹海仙,畅志坚,杨足君,张晓军,李欣.小麦抗白粉病基因来源及抗性评价的研究进展.中国农学通报,2010,26(10):42-46)。Pm21抗白粉病基因位于簇毛麦6V染色体短臂，通过T6VS·6AL易位系转入普通小麦，已被转育到栽培小麦品种(见参考文献：CaoA,XingL,WangX,YangX,WangW,SunY,QianC,NiJ,ChenY,LiuD,WangX,ChenP.Serine/threoninekinasegeneStpk-V,akeymemberofpowderymildewresistancegenePm21,conferspowderymildewresistanceinwheat.ProcNatlAcadSciUSA,2011,108:7727-7732)。但是，大面积长时间使用Pm21必会使它面临强大的寄主选择压，导致病原菌群体的毒性结构在时空上发生变化，逐渐形成适应该基因的优势毒性菌群，最终导致具有Pm21抗性的品种在一定面积上推广几年后抗性被新的毒性小种所克服。因此，发掘新的抗病基因是当前小麦育种的迫切任务。

发明内容

针对当前小麦育种有效抗白粉病基因偏少、抗病品种单一化的问题，本发明提供具体是一种小麦-十倍体长穗偃麦草抗白粉病易位系选育方法及所育的T5ES-5DL易位系偃11-20的分子标记。

本发明所述一种小麦-十倍体长穗偃麦草抗白粉病易位系选育方法，包括以下步骤：

1)以澳大利亚十倍体长穗偃麦草和普通小麦品种兰考矮早八的杂交一代为母本，以普通小麦品种科育818为父本杂交，获得杂交种子；

2)种植杂交种子选苗期抗病株为母本，以矮抗58为父本杂交，杂交后代选苗期抗病株用矮抗58回交；

3)种植回交种子选苗期抗病株，以引物pLeUCD2F2检测选出含有长穗偃麦草遗传物质的单株，进行染色体数目鉴定获得染色体数目2n＝42的单株；

4)以长穗偃麦草基因组DNA为探针和小麦D基因组特异质粒pAs1为探针分别进行荧光原位杂交，选择长穗偃麦草的一对染色体臂代换了普通小麦的一对5DS染色体臂的单株；并以SSR引物鉴定该单株纯合，得到所育的小麦-长穗偃麦草抗白粉病易位系。

其中，所述选苗期抗病株，为将种子经H₂O₂侵泡后冲洗干净种植于温室进行苗期白粉病抗性鉴定，待植株充分感病后，拔掉感病植株，留下抗病株移栽到大田。

其中，所述H₂O₂为体积百分浓度2％的溶液。

其中，所述侵泡为浸泡24小时。

其中，所述SSR引物鉴定为以Xwmc233、Xcfd165、Xbarc130、Xcfd18、Xgwm190和Xcfd189扩增亲本和待选单株DNA，表现为亲本均扩增出5DS的DNA条带，但在该单株中未扩增出5DS特异带。

本发明还提供筛选鉴定以上述选育方法所育易位系及其后代的分子标记的方法，其为：将选育得到小麦-长穗偃麦草抗白粉病易位系以EST-SSR引物和/或EST-STS引物对其进行多态性筛选，得到用以鉴别所选小麦-十倍体长穗偃麦草抗白粉病易位系及其后代的分子标记。

其中，所述EST-SSR引物和/或EST-STS引物选自小麦全基因组的343个EST-SSR和241个EST-STS引物(见参考文献：陈海梅，李林志，卫宪云，李斯深，雷天东，胡海洲，王洪刚，张宪省.小麦EST-SSR标记的开发、染色体定位和遗传作图.科学通报，2005，50(20)：2208-2216；

http://wheat.pw.usda.gov/SNP/new/pcr_primers.shtml)。

本发明还提供上述筛选分子标记的方法在小麦育种中的应用。

本发明以所述小麦-十倍体长穗偃麦草抗白粉病易位系选育方法选育得到的偃11-20，并提供鉴定偃11-20及其后代的分子标记，其为以引物Xcwem42、BE443538、BF293016、CD452608、BE444644、BF202632、BE500291、BE498768、BE352603、BF146187、BE499257和BE606654中的任一种对待测植物进行扩增，能扩增出相应的约180、595、485、610、695、630、1600、630、540/850、980、990和500bp的DNA条带的即为含有该偃11-20遗传资源的植物材料(即偃11-20或其后代)。

本发明还提供所述的小麦-十倍体长穗偃麦草抗白粉病易位系选育方法在小麦育种中的应用。

本发明还提供所述鉴定偃11-20及其后代的分子标记在小麦育种中的应用。

本发明的有益效果是：

1、以本发明的方法所育的小麦-十倍体长穗偃麦草T5ES-5DL易位系偃11-20对当前黄淮麦区白粉病菌表现免疫，实现了抗源的多样化。

2、小麦-十倍体长穗偃麦草T5ES-5DL易位系偃11-20遗传背景主要为当前黄淮麦区大面积种植品种矮抗58，平均株高61cm，穗长8.0cm，小穗数21个，穗粒数43，在小麦育种上具有更广泛的利用价值。

附图说明

图1为实施例1小麦-十倍体长穗偃麦草T5ES-5DL易位系的GISH和FISH分析图。图A：以长穗偃麦草DNA为探针的原位杂交图，箭头示易位的长穗偃麦草染色体片段；图B：分别以PAS1和长穗偃麦草为探针的FISH图，箭头示长穗偃麦草易位片段。

图2为实施例2长穗偃麦草E基因组特异引物在小麦-十倍体长穗偃麦草T5ES-5DL易位系及其亲本的扩增结果。从左往右依次是Marker、兰考矮早八、科育818、矮抗58、十倍体长穗偃麦草和偃11-20，箭头表示长穗偃麦草的扩增条带。

图3为实施例1小麦5D染色体短臂特异SSR引物在小麦-十倍体长穗偃麦草T5ES-5DL易位系及其亲本扩增结果。从左往右依次是Marker、兰考矮早八、科育818、矮抗58、长穗偃麦草、偃11-20、中国春、CSN5D-T5A和CSN5A-T5D，箭头表示小麦染色体5DS的扩增条带。

图4为实施例1小麦-十倍体长穗偃麦草T5ES-5DL易位系中长穗偃麦草染色质特异EST-SSR和EST-STS标记。从左往右依次是Marker、兰考矮早八、科育818、矮抗58、十倍体长穗偃麦草和偃11-20，箭头表示长穗偃麦草的扩增条带。

图5为实施例1小麦-十倍体长穗偃麦草T5ES·5DL易位系偃11-20的植株。

图6为实施例1小麦-十倍体长穗偃麦草T5ES·5DL易位系偃11-20苗期白粉病抗性鉴定。左为感病对照品种中国春。

图7为实施例1小麦-十倍体长穗偃麦草T5ES-5DL易位系偃11-20成株期白粉病抗性鉴定。从上往下依次为十倍体长穗偃麦草、兰考矮早八、科育818和矮抗58，其中兰考矮早八、科育818和矮抗58为开花期倒二叶叶片。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例涉及如下植物品种：

科育818：引自河南科丰种业集团有限公司。

澳大利亚十倍体长穗偃麦草：是河南科技学院从澳大利亚采集回来的植物材料。

兰考矮早八：河南天民种业有限公司所育品种，2003年9月通过国家品种审定委员会审定。

矮抗58：河南科技学院小麦育种中心育成，国审麦2005008。

以上品种均为公知公用品种，可市购，也可从各育种单位或种质库引进。

实施例1小麦-十倍体长穗偃麦草T5ES-5DL易位系偃11-20的选育

(1)以普通小麦品种科育818为父本，与澳大利亚十倍体长穗偃麦草和普通小麦品种兰考矮早八杂交获得的F₁植株杂交，获得杂交种子；

(2)9月初将杂交种子经体积百分浓度2％的H₂O₂侵泡24小时后，用流水冲洗干净种植于育苗盘，放在人工智能温室进行苗期白粉病抗性鉴定，待植株充分感病后，拔掉感病植株，将抗病植株在10月中旬移栽到大田；

所述的在人工智能温室进行苗期白粉病抗性鉴定：是将感病对照中国春和杂交种子种在自然菌源充足的温室，室内温度控制在18℃左右，待杂交种子幼苗生长到一叶一心期时，采集感病品种上培养的混合白粉菌孢子均匀抖落在塑料钵中的幼苗叶片上，重复多次接种。期间温室保持高湿环境，即可充分诱发白粉病。在感病品种充分发病时调查抗病性，病级鉴定按盛宝钦等提出的反应型标准0～4级进行记载。

(3)以黄淮麦区主栽品种矮抗58为父本与抗病植株杂交。获得的杂交种子经过步骤(2)的处理过程，并用矮抗58回交1次。获得的回交种子经过步骤(2)的处理过程，提取抗病植株的基因组DNA；

(4)利用从长穗偃麦草分离的E基因组特异DNA重复序列引物pLeUCD2F2对抗病植株的染色体组成进行检测，找出含有pLeUCD2F2扩增出的277bp的长穗偃麦草特异条带的单株，这些单株含有长穗偃麦草的遗传物质。扩增结果见图2。(见参考文献：李洪杰，王晓鸣，陈怀谷，李伟，刘东涛，张会云.小麦-偃麦草杂种后代及小麦种质资源对纹枯病的抗性.2013，39(6):999-1012；WangRRC,WeiJZ.VariationsoftworepetitiveDNAsequencesinseveralTriticeaegenomesrevealedbypolymerasechainreactionandsequencing.Genome,1995,38:1221-1229)。

(5)对标记选择的含有长穗偃麦草遗传物质的单株进行染色体数目鉴定，获得根尖细胞染色体数目2n＝42的单株，以长穗偃麦草基因组DNA为探针和小麦D基因组特异质粒pAs1为探针进行多色荧光原位杂交(见参考文献：王敬昌.柱穗山羊草G2C诱导小麦-冰草附加系产生染色体易位的研究.2007，西北农林科技大学硕士研究生论文)，选择长穗偃麦草的一对染色体臂代换了普通小麦的一对5DS染色体臂的单株，详见图1；

(6)利用小麦基因组特异SSR引物对上述确定的易位单株及其亲本进行分子鉴定，结果见图3，发现，5DS上的6个SSR引物(Xwmc233、Xcfd165、Xbarc130、Xcfd18、Xgwm190和Xcfd189)在3个小麦亲本(兰考矮早八、科育818和矮抗58)中均扩增出5DS的DNA条带，但在易位系中未扩增出5DS特异带，说明该易位系缺少了小麦的5D染色体短臂，进一步验证了该易位系为纯合易位系。

(7)利用分布于小麦全基因组的343个EST-SSR和241个EST-STS引物在小麦亲本(兰考矮早八、科育818和矮抗58)和长穗偃麦草间进行多态性筛选，利用扩增出长穗偃麦草特异DNA条带的引物对上述确定的易位单株进行分子检测，结果见图4，发现来自小麦第5同源群(5AS、5BS和5DS)的1个EST-SSR引物和11个EST-STS引物分别在易位系中扩增出长穗偃麦草特异带，该易位系被确认为T5ES-5DL易位系，这些标记可以作为追踪易位系中长穗偃麦草5ES的特异标记。

所述EST-SSR引物为Xcwem42，其在长穗偃麦草扩增出约180bp的DNA条带。

所述11个EST-STS引物为BE443538、BF293016、CD452608、BE444644、BF202632、BE500291、BE498768、BE352603、BF146187、BE499257和BE606654(已在http://wheat.pw.usda.gov/SNP/new/pcr_primers.shtml公布)，它们在长穗偃麦草分别扩增出约595、485、610、695、630、1600、630、540/850、980、990和500bp的DNA条带。

本实施例得到的小麦-十倍体长穗偃麦草T5ES-5DL易位系命名为偃11-20，其植株照片见图5，其遗传背景主要为当前黄淮麦区大面积种植品种矮抗58，平均株高61cm，穗长8.0cm，小穗数21个，穗粒数43，在小麦育种上具有更广泛的利用价值。

实施例2偃11-20白粉病抗性的鉴定

白粉病的鉴定参考《小麦品种抗白粉病田间鉴定技术规程(DB51T1034-2010)》。

验证结果见图6和图7：

图6为小麦-十倍体长穗偃麦草T5ES-5DL易位系偃11-20苗期白粉病抗性鉴定，左为感病对照品种中国春。鉴定结果表明偃11-20苗期抗白粉病。

图7为小麦-十倍体长穗偃麦草T5ES-5DL易位系偃11-20成株期白粉病抗性鉴定，从上往下依次为十倍体长穗偃麦草、兰考矮早八、科育818和矮抗58，其中兰考矮早八、科育818和矮抗58为开花期倒二叶叶片。鉴定结果表明表明偃11-20成株期抗白粉病。