脱细胞真皮基质角膜及眼表组织修复材料的制备方法

摘要

本发明公开了一种脱细胞真皮基质角膜及眼表组织修复材料的制备方法，其包括以下步骤：步骤A：选取哺乳动物体或人体的一定部位的真皮组织；步骤B：通过对比所述真皮组织与角膜组织的结构，确定所述真皮组织结构中与所述角膜组织结构相近且相邻5层的真皮组织β层结构；步骤C：去除所述真皮组织中除真皮组织β层结构以外的其他层，获得真皮组织β层初级原料。本发明的制备方法拓宽了制备角膜以及眼表组织修复材料的原料来源，降低了生产角膜或眼表组织修复材料的成本，制备的脱细胞真皮基质角膜可广泛应用于感染、外伤或组织病变导致角膜损伤的眼角膜再生性修复。

说明书

技术领域

本发明涉及一种脱细胞真皮基质角膜及眼表组织修复材料的制备方法。

背景技术

目前，眼角膜病变是多发病、常见病，尤其是外伤、感染局部组织病变、晶体病变会导致眼角膜边缘改变，最终改变角膜组织的透明度导致失明。角膜病变导致的失明，目前唯一施行的治疗手段是异体角膜移植，由于捐献材料来源匮乏，大量角膜移植病例的病人因等待角膜移植而处于失明状态。根据2011年眼科流行病学调查报告显示：我国因角膜病变导致失明的病人约为十万分之七点一每年,即每年增长约十万例。目前我国每年可用于移植的异体角膜材料不足一万只，累计等待角膜修复治疗的病人数量在二百万例左右，如果计入因部分角膜病变或边缘角膜病变需要角膜材料或者眼表组织修复材料的病人这个数量将达到上千万。

目前，国内外都在进行大量的角膜替代产品研究，角膜替代产品材料主要集中在异体羊膜、海洋生物胶原蛋白与异种角膜材料方面，上述材料由于材料自身特性的限制都很难达到永久性或复明性的效果。

由此可见，国内外对角膜替代品以及眼表组织修复材料的需求量大，现有的产品不具有永久性或复明性的效果，亟待进一步开发新的生物组织工程学的角膜修复材料。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种脱细胞真皮基质角膜及眼表组织修复材料的制备方法，该制备方法其拓宽了制备角膜以及眼表组织修复材料的原料来源，降低了生产角膜或眼表组织修复材料的成本，制备的脱细胞真皮基质角膜可广泛应用于感染、外伤或组织病变导致角膜损伤的眼角膜再生性修复。

为解决上述技术问题本发明一种脱细胞真皮基质角膜及眼表组织修复材料的制备方法，其包括以下步骤：

步骤A：选取哺乳动物体或人体的真皮组织；

步骤B：通过对比所述真皮组织与角膜组织的结构，确定所述真皮组织结构中与所述角膜组织结构相近且相邻5层的真皮组织β层结构；

步骤C：去除所述真皮组织中除真皮组织β层结构以外的其他层，获得真皮组织β层初级原料；

步骤D：对所述真皮组织β层初级原料进行脱细胞处理，获得脱细胞真皮组织β层初级原料；

步骤E：将经步骤D处理的脱细胞真皮组织β层初级原料在无菌、恒温条件下，于平衡原液中混摇一定时间，复原所述脱细胞真皮组织β层初级原料中胶原蛋白、活性因子的生物性能；

步骤F:将经步骤E中处理后的脱细胞真皮组织β层初级原料，在平衡液中处理，通过改变蛋白质膜的通透性和补充平衡离子的方式，封闭真皮组织β层初级原料的电位点，得到脱细胞真皮基质角膜及眼表组织修复材料。

本发明的一个实施例中，所述步骤F中，通过组合离子或者单一离子来调平所述脱细胞后的真皮组织β层初级原料的电位差，达到封闭所述脱细胞后的真皮组织β层初级原料中蛋白质的电位点的目的。

本发明的一个实施例中，所述步骤C中，去除真皮组织结构中除真皮组织β层结构以外的其他层的过程中，保留神经生长因子和巢蛋白-内功素，以利于建立细胞的非血管营养模式。

本发明的一个实施例中，所述步骤D中，移除所述真皮组织β层初级原料中具有免疫原性的表皮细胞以及其他成体细胞，保留具有天然组织立体框架的胶原蛋白和弹力纤维，并维持真皮组织β层初级原料的脱细胞前结构。

本发明的一个实施例中，所述步骤C中，利用固定液对所述真皮组织β层初级原料进行固定。

本发明的一个实施例中，所述步骤E中，所述恒温条件中，温度选择范围为16~37摄氏度。

本发明的一个实施例中，所述步骤E中，于平衡液中混摇的时间为4~24小时。

本发明的一个实施例中，所制备的脱细胞真皮基质角膜或眼表组织修复材料直接用于人或动物的移植。

本发明脱细胞真皮基质角膜及眼表组织修复材料的制备方法具有以下有益效果：

本发明提供脱细胞真皮基质角膜及眼表组织修复材料的制备方法中，选取动物或者人体的真皮作为原料来源，拓展了原料的来源途径，降低了制备角膜替代材料的成本，且本发明的制备方法简单，制造成本低，该脱细胞真皮基质角膜和眼表组织修复材料可广泛应用于感染、外伤或组织病变导致角膜损伤的眼角膜再生性修复中。

下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明

图1为本发明的脱细胞真皮基质角膜材料植入实验兔随着时间变化生长情况的显微镜照片图；

图2为本发明制备的脱细胞真皮基质角膜材料植入动物体后12小时的组织学切片照片图；

图3为本发明制备的脱细胞真皮基质角膜材料植入动物体后72小时的组织学切片照片图；

图4为本发明制备的脱细胞真皮基质角膜材料植入动物体后7天时的组织学切片照片图；

图5为本发明制备的脱细胞真皮基质角膜材料植入动物角膜部位6周时照片图；

图6为本发明制备的脱细胞真皮基质角膜材料植入动物角膜部位24周时照片图。

具体实施方式

本发明脱细胞真皮基质角膜及眼表组织修复材料的制备方法，其包括以下步骤：

步骤A：选取哺乳动物体或人的真皮组织。

哺乳动物体包括猪、牛、等，较佳的，选取人体上的真皮组织，哺乳动物不同部位的真皮的功能存在差异，且不同部位真皮所含基质蛋白及各种因子的类型、数量不同。根据不同部位真皮的组成结构，功能以及各种因子含量的不同，有针对性的选择相应部位的真皮。

步骤B：通过对比分析所述真皮组织与角膜组织的结构，确定选取真皮组织结构中与所述角膜组织结构相近且相邻5层的真皮组织β层结构。

角膜组织结构基本可以分为5层，分别为上皮层（epittheliallayer）、前弹力层（Bowman'smembrane）、基质层（Stroma）、后弹力层（Descemet'smembrane）和内皮层（Endotheliumlayer）。角膜组织各层的主要成分为功能细胞和Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ型胶原蛋白，胶原蛋白分层有序地排列，其中，Ⅵ型胶原蛋白以网状结构存在，对角膜基质的有序排列也起着重要作用。直径统一且排列规则的Ⅰ型胶原蛋白是维持角膜透明的重要因素。

本发明通过电子显微镜对角膜结构与大量的真皮层结构进行比对、对胶原蛋白类型定性比对，胶原蛋白的排列方向顺序进行比对，在250层真皮组织结构中确定了与角膜组织结构极为相近且相邻的5层结构，本发明将该相邻的5层结构命名为真皮组织β层结构。

步骤C：去除真皮组织结构中除真皮组织β层结构以外的其他层，获得真皮组织β层初级原料。

在对健康真皮进行处理过程中，对真皮组织β层初级原料通过固定液进行固定，对构成框架结构的胶原蛋白和附着的生长因子等进行保护，在去除真皮组织结构中除真皮组织β层结构以外的其他层的过程中，保留神经生长因子（NGFnervegrowthfactor）和巢蛋白-内功素（N-Enidogen-entactin），制备的脱细胞真皮基质角膜及眼表组织修复材料植入动物体后，可加速神经纤维的生长，快速恢复被破坏的角膜边缘组织结构，有利于建立细胞的非血管营养模式。

步骤D：对所述真皮组织结构中的真皮组织β层初级原料进行脱细胞处理。

对真皮组织β层初级原料进行脱细胞处理，采用组织工程学和生物化学方法分离、破坏、移除真皮组织中的表皮细胞和其他成体细胞等具有免疫原性的物质，保留具有天然组织立体框架的胶原蛋白和弹力纤维等物质，并维持真皮组织β层初级原料的脱细胞前结构。

具体的，本发明利用专利号为CN1130971C中脱细胞技术中的基础制备液，在其中加入特定酶和化学试剂制备成脱细胞及细胞外基质固定制剂，固定剂与真皮组织β层初级原料混置后进行恒温混摇操作，对真皮组织β层初级原料进行脱细胞处理，得到脱细胞处理后的真皮组织β层初级原料。

步骤E：将步骤D中得到的真皮组织β层初级原料在无菌、恒温条件下，该恒温条件的温度范围为16~37摄氏度，置于平衡还原液中进行混摇操作4~24小时，复原脱细胞处理后的真皮组织β层初级原料的胶原蛋白、活性因子的生物性能。

步骤E中，较佳的，在温度为25摄氏度，在平衡液中混摇操作20小时。

作为可变换的实施方式，本步骤中，在32摄氏度恒温条件下，在平衡液中，混摇操作24小时。

作为可变换的实施方式，本步骤中，在16摄氏度条件下，在平衡液中进行混摇操作4小时。

步骤F：将步骤E中处理得到的真皮组织β层初级原料在平衡液中处理，以通过改变蛋白质膜通透性和补充平衡离子的方式，封闭真皮组织β层初级原料的电位点，使得真皮组织β层初级原料中蛋白所有电位点都为0，去除真皮组织β层初级原料中胶原蛋白电信号对细胞转化的影响，得到可应用于人体角膜修复的脱细胞真皮基质角膜，使得脱细胞真皮基质角膜材料植入人体后，宿主细胞进入初级原料框架间隙后，其分化方向不受脱细胞真皮基质角膜材料本身的干扰。

本发明通过组合离子调平电位差，达到封闭真皮组织β层初级原料蛋白质电位点的目的，较佳的，本发明采用单一离子调平电位差，从而封闭初级原料中蛋白质的电位点，进过进一步处理，最终得到本发明的脱细胞真皮基质角膜材料。

角膜组织的修复的前体细胞主要来源于角膜边缘干细胞，角膜边缘干细胞通过水平向心移动和垂直向上移动的相互结合的方式进入角膜及眼表修复材料间隙。经过TAC（transitamplif-yingcells短暂扩充细胞）、PMC（post-mitoticcells有丝分裂后细胞）最终转化为TDC（terminallydifferentiatedcells终末细胞）。角膜边缘细胞在向功能性细胞转化的过程中，受到临近细胞、局部电位、纤维连接蛋白（FN）含量及转化生长因子-β（Transforminggrowthfactor-betaTGF-β）等多因素的影响，本发明通过上述制造步骤创造适当条件保护真皮组织β层结构中的相关因子和电生理环境实现了角膜边缘干细胞的精准修复。

此外，本发明经过上述脱细胞和胶原蛋白相关因子保护技术可制备出非角膜组织的脱细胞真皮基质角膜材料及眼表组织修复材料，通过选用不同部位的真皮材料，相应得到脱细胞真皮基质角膜材料或眼表组织修复材料。

本发明制备的脱细胞真皮基质角膜或眼表组织修复材料，用于哺乳动物组织受到损伤（包括病理性损伤和认为主动破坏损伤）时，利用组织工程学专利技术诱导宿主前体细胞进入框架，修复材料植入人体角膜部位后，人体组织液和血液中自身的干细胞和前体细胞进入材料框架间隙内黏附留滞、在眼周组织电刺激和因子共同作用下，干细胞和前体细胞增殖分裂并向角膜细胞转化，分泌新的细胞外基质，加强修复、塑性角膜组织，在损伤局部的细胞发生变化、趋化因子、碱性成纤维细胞生长因子（FibroblastgrowthfactorFGF）、Ⅰ型胶原蛋白启动子等都有诱导细胞向损伤部位移动、分化和增值的功能。角膜上皮细胞的营养由于角膜边缘组织的特殊结构阻止血管向角膜蔓延生长，因此角膜上皮细胞主要依靠角膜神经提供代谢营养和支持作用，在电生理信号刺激下转化为角膜细胞，并逐渐建立利用房水提供细胞营养的非血管营养模式。

实施例1本发明制备的细胞真皮基质角膜修复材料与眼表组织修复材料生物相容性实验。

请配合参阅图1所示，本发明制备的脱细胞真皮基质角膜植入实验兔后，实验兔在实验期间均正常存活，无严重并发症。未发现严重的前房发炎。脱细胞真皮基质角膜植入之初有水肿现象，12周后消除。植入之后24周变为角膜透明。术后早期部分病眼发生轻微的新血管形成现象，12周后消失不见。

H&E染色显示，术后第1周实验兔角膜中的小圆细胞聚集到植入处两端附近，第12周和第24周未见。到第24周一些纺锤形细胞已长入植入处，角膜细胞的生长同时，可观察到植入边界某些部分已经模糊，模糊处脱细胞真皮基质材料（acellularADM）的胶原似已与主体角膜的胶原合为一体。天狼星红只对胶原成分染色，术后植入的脱细胞真皮基质材料ADM内胶原结构发生显著变化。植入前脱细胞真皮基质材料ADM的胶原纤维较粗、完整、交错排列，大部分呈红色或明黄色，而正常角膜的胶原纤维较细，呈黄绿色或红色，规则排列。术后1周ADM与角膜的交界清晰可见，颜色更绿、交界处有明显的黑色缝隙，在光学显微镜下则不可见。到术后第12周，所植入脱细胞真皮基质材料ADM的胶原纤维变稀疏、更多呈绿色，仍可观察到深色缝隙，但缝隙明显变小，边界开始模糊。到第24周交界更加模糊，已见不到深色缝隙，在偏振光显微镜下观察脱细胞真皮基质材料ADM颜色明显变得与周围角膜更加相似。

请配合参阅图2所示，本发明制备的脱细胞真皮基质角膜植入动物体后12小时的组织学切片，首先进入材料中的是炎性细胞和纤维细胞，材料中细胞数量和密度比较低。

请配合参阅图3所示，本发明制备脱细胞真皮基质角膜植入动物体后72小时的组织学切片，细胞密度和数量明显增加，在进入的细胞类型上除炎性细胞外已经不见了纤维细胞，但可以发现发育较为幼稚的前体细胞或干细胞。

请配合参阅图4所示，本发明制备的细胞真皮基质角膜植入动物体后7天时的组织学切片，可以看到材料中细胞密度已经接近正常组织，以间充质细胞或干细胞为主，并且可以看到细胞分裂增生的各期形态，在材料中已经可以找到有完整结构的血管组织。

以上早期的组织学实验说明本发明制备的脱细胞真皮基质角膜植入动物眼角膜部位后细胞可以进入材料间隙，并能在材料中增殖分裂及转化为功能细胞。

实施例2本发明制备的脱细胞真皮基质角膜植入动物体修复实验

请配合参阅图5所示，本发明制备的脱细胞真皮基质角膜植入动物角膜部位6周时，植入材料已经变得光滑，成半透明状态。

请配合参阅图6所示，本发明制备的脱细胞真皮基质角膜植入动物角膜部位10周时，植入材料已经基本透明，动物已经可以视物。

本发明制备的脱细胞真皮基质角膜或眼表组织修复材料，经过动物实验和组织学实验表明，脱细胞真皮基质角膜及眼周组织因为自身天然立体结构的特性在第24周时，其组织结构、胶原类型、局部强度和弹性已经完全与宿主角膜组织一致，本发明的脱细胞真皮基质角膜或眼表组织修复材料，完全可以达到替换现有角膜产品的目的，拓展了原料来源，其制备方法简单，降低了制造成本，本发明的脱细胞真皮基质角膜替代材料将主导角膜病变、角膜修复的临床治疗。

以上所述，为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，本领域技术人员利用上述揭示的技术内容做出些许简单修改、等同变化或修饰，均落在本发明的保护范围内。