一种壳聚糖/氧化石墨烯/纳米羟基磷灰石三维多孔复合支架材料的制备方法

摘要

本发明属于生物医学组织工程复合材料制备技术领域。本发明通过羧基化氧化石墨烯与掺有纳米羟基磷灰石的壳聚糖进行共价交联反应来改善三维多孔支架的力学性能和生物活性。该支架材料具有高度连通的三维多孔结构、优良的力学性能和生物活性，能作为细胞培养支架用于骨组织损伤修复。

说明书

技术领域

本发明属于生物医学组织工程复合材料制备技术领域，具体涉及一种壳聚糖/氧化石墨烯/纳米羟基磷灰石三维多孔复合支架材料的制备方法。

背景技术

由于创伤、感染、肿瘤、骨髓炎以及各种先天性疾病等原因所造成的骨缺损是目前国内外临床医学中最常见、最棘手的困难之一，而骨组织工程在修复骨组织病变或缺损方面具有独特的优势。其基本思路是将种子细胞种植在具有一定生物活性并在人体内可逐渐降解吸收的支架材料上，经体外培养形成细胞生物材料复合物，然后将复合物植入人体的骨组织缺损部位，在细胞不断增殖并分泌基质的同时，支架材料逐渐降解被人体吸收，最终形成新的具有与原功能和形态相似的骨组织。在骨组织工程三要素：种子细胞、生长因子、支架材料中，支架材料起着至关重要的作用，它不仅将种子细胞和生长因子运送到骨缺损部位，而且还给新骨组织提供支撑作用。理想的骨支架材料应具备以下几点：(1)具有良好的生物相容性、生物可降解吸收性以及能承载并释放有利于细胞和组织生长的药物及生物活性物质；(2)具有三维连通的多孔结构，有利于细胞的生长及代谢产物和营养物质的交换；(3)具有足够的力学性能，与机体组织具有良好的生物机械适应性。目前，模仿天然骨的成分，骨修复支架材料通常是由无机相和有机相组成的。

在生物相容性好的有机材料中，壳聚糖(CS)作为天然的高分子材料，具有良好的生物相容性和生物活性，其多糖骨架结构以及其独特的化学性质，有利于细胞的粘附和增殖，因而被广泛用于组织工程领域。羟基磷灰石是人体骨骼组织的主要无机组成成分，具有优良的生物活性和骨传导性能，纳米羟基磷灰石(nHA)具有更好的理化性能，可提供对细胞在细胞质基质中粘附、生长和分化的生物刺激信号。然而，提高壳聚糖/纳米羟基磷灰石复合支架材料的生物力学性能，满足临床应用中应力集中部位骨缺损修复的要求，仍是一个巨大的挑战。

石墨烯具有优异的力学性能、大的比表面积和良好的生物相容性，因而在生物医学领域拥有巨大的应用潜力。氧化石墨烯(GO)是石墨烯的衍生物，其表面含有大量的含氧官能团，能与壳聚糖进行共价交联反应生成界面相互作用更强的共价键，因而可改善支架的机械性能。研究还表明，氧化石墨烯能促进骨髓间充质干细胞的生长和分化。然而，氧化石墨烯表面含有多种不同的含氧官能团，如羰基、羟基、环氧基和羧基等，严重影响了氧化石墨烯与壳聚糖等高分子材料的交联稳定性，导致支架材料的力学性能下降。

本发明提出利用羧基化改性的氧化石墨烯与混有纳米羟基磷灰石的壳聚糖溶液进行共价交联反应，制备壳聚糖/氧化石墨烯/纳米羟基磷灰石(CS/cGO/nHA)三维多孔复合生物支架，通过提高氧化石墨烯表面羧基官能团的含量，提高复合支架的力学性能和生物活性，进而实现复合多孔支架材料在骨组织工程中的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种壳聚糖/氧化石墨烯/纳米羟基磷灰石三维多孔复合支架材料的制备方法，该支架材料具有高度连通的三维多孔结构、优良的力学性能和生物活性，可作为细胞培养支架用于骨组织损伤修复。

本发明的目的可通过以下技术方案来实现：一种壳聚糖/氧化石墨烯/纳米羟基磷灰石三维多孔复合支架材料的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)按羧基化氧化石墨烯、水(超纯水)的配比为1.5-30mg：10mg，称取羧基化氧化石墨烯加入水(超纯水)中，超声分散配制成羧基化氧化石墨烯水溶液；按羧基化氧化石墨烯：交联剂EDC：交联剂NHS的配比为1.5-30mg：19.7-59.1mg：23.0-69.0mg，取交联剂EDC和交联剂NHS加入到分散均匀的羧基化氧化石墨烯溶液中，室温下磁力搅拌1h,活化羧基，得到羧基活化的羧基化氧化石墨烯；

(2)按羟基磷灰石、稀醋酸溶液的配比为15-60mg：10mL，将羟基磷灰石加入到稀醋酸溶液中，经超声分散后得到纳米羟基磷灰石的悬浊液；

(3)按羟基磷灰石、壳聚糖粉的配比为15mg-60mg：300mg，称取适量壳聚糖粉末加入到上述羟基磷灰石的悬浊液中，搅拌后得到含有壳聚糖和纳米羟基磷灰石的混合液(混合均匀的壳聚糖/羟基磷灰石混合溶液)；

(4)按羟基磷灰石、羧基化氧化石墨烯15-60mg：1.5-30mg，将羧基活化的羧基化氧化石墨烯边搅拌边滴加到含有壳聚糖和纳米羟基磷灰石的混合液中(羧基化氧化石墨烯的质量比为0.5-2.5％)，混合均匀后于60℃条件下交联30min，经冷冻干燥后得到壳聚糖/氧化石墨烯/纳米羟基磷灰石三维多孔复合支架材料。

所述步骤(1)中羧基化氧化石墨烯是氧化石墨烯通过氯乙酸法改性后所得的羧基化氧化石墨烯。

所述步骤(1)中所述交联剂EDC和交联剂NHS的浓度分别为10-30mM和20-60mM；【交联剂为：1乙基3(3二甲基氨丙基)碳化二亚胺(EDC)和N羟基琥珀酰亚胺(NHS)交联剂】。

所述步骤(2)中的羟基磷灰石的粒径为40-60nm,稀醋酸的体积分数为2％。

所述步骤(4)中壳聚糖/氧化石墨烯/纳米羟基磷灰石三维多孔复合支架材料中壳聚糖、氧化石墨烯、纳米羟基磷灰石的质量比为300：(1.5-30)：(15-60)。

所述步骤(4)的含有壳聚糖和纳米羟基磷灰石的混合液中羧基化氧化石墨烯的质量百分比为0.5-2.5％wt.％

本发明通过羧基化氧化石墨烯与掺有纳米羟基磷灰石的壳聚糖进行共价交联反应来改善三维多孔支架的力学性能和生物活性。有利于细胞的粘附增殖，促进组织的迅速形成；而且机械性能得到改善，满足组织修复部位所需的力学要求。

与现有的技术，本发明的有益效果是：

(1)本发明采用冷冻干燥法制备的壳聚糖/氧化石墨烯/纳米羟基磷灰石三维多孔复合支架材料，具有高的孔隙率，且孔与孔之间相互连通，有利于细胞向内生长及代谢产物与营养物质的交换。同时，制备方法操作简单，通过改变壳聚糖、纳米羟基磷灰石、氧化石墨烯的比例可调节复合支架材料的孔隙率、孔径以及机械强度等性能参数；可根据实际需要任意制备各种形状的支架材料。

(2)本发明利用壳聚糖、纳米羟基磷灰石、羧基化氧化石墨烯为原料制备的复合支架材料，不仅具有良好的力学性能，能满足骨组织损伤修复的力学性能要求；而且各组分之间能相同协同，使支架材料具有更好的生物活性。

附图说明

图1是本发明实施例1的壳聚糖/氧化石墨烯(0.5wt.％)/纳米羟基磷灰石(5wt.％)三维多孔支架扫描电镜照片。

图2是本发明实施例2的壳聚糖/氧化石墨烯(0.5wt.％)/纳米羟基磷灰石(10wt.％)三维多孔支架扫描电镜照片。

图3是本发明实施例4的壳聚糖/氧化石墨烯(1.0wt.％)/纳米羟基磷灰石(15wt.％)三维多孔支架扫描电镜照片。

图4是本发明实施例4的壳聚糖/氧化石墨烯(2.5wt.％)/纳米羟基磷灰石(20wt.％)三维多孔支架扫描电镜照片。

图5是本发明实施例4的纳米羟基磷灰石扫描电镜照片。

图6是本发明实施例4的氧化石墨烯(a)和羧基化氧化石墨烯(b)C1s的XPS图谱。

图7是本发明实施例4的不同壳聚糖/氧化石墨烯/纳米羟基磷灰石复合支架的机械性能图；(a)拉伸强度，(b)抗压强度。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步说明：

实施例1

一种壳聚糖/氧化石墨烯/纳米羟基磷灰石三维多孔复合支架材料的制备方法，其具体步骤如下：

(1)称取1.5mg的羧基化氧化石墨烯于10mg的超纯水中超声分散形成均匀的分散液(浓度为15wt.％)；将浓度为10-30mM、19.7-59.1mg交联剂EDC和浓度为20-60mM、23.0-69.0mg交联剂NHS加入到上述分散液中搅拌1h，活化羧基化氧化石墨烯上的羧基；得到羧基活化的羧基化氧化石墨烯；

(2)取15mg纳米羟基磷灰石(粒径为40-60nm，或称羟基磷灰石)于10mL体积分数为2％的稀醋酸溶液中，超声分散后得到羟基磷灰石的悬浊液；

(3)在上述羟基磷灰石的悬浊液中加入300mg的壳聚糖粉末，激烈搅拌后得到混合均匀的壳聚糖/纳米羟基磷灰石混合溶液(复合物)【即得到含有壳聚糖和纳米羟基磷灰石混合液，以下实施例相同】，将所得壳聚糖/纳米羟基磷灰石混合液置于4℃冰箱中2h去除气泡；得到含有壳聚糖和纳米羟基磷灰石混合液；

(4)将步骤(1)中羧基活化的羧基化氧化石墨烯滴加到含有壳聚糖和纳米羟基磷灰石混合液中，使羧基化氧化石墨烯的质量百分比为0.5wt.％【即壳聚糖粉末300mg、羟基磷灰石15mg、羧基化氧化石墨烯1.5mg】，激烈搅拌均匀后，于60℃水浴条件下交联30min，经冷冻干燥后得到壳聚糖/氧化石墨烯/纳米羟基磷灰石三维多孔复合支架材料。

对本实施例中制得的壳聚糖/氧化石墨烯/纳米羟基磷灰石三维多孔复合支架材料进行形貌表征。图1为本实施例制备的多孔复合支架的扫描电镜图，如图1所示，制备的复合支架具有高度多孔性，且孔与孔相互连通(具有高度连通的三维多孔结构)，纳米羟基磷灰石均匀分布在复合支架中。

实施例2

一种壳聚糖/氧化石墨烯/纳米羟基磷灰石三维多孔复合支架材料的制备方法，其具体步骤如下：

(1)称取1.5mg的羧基化氧化石墨烯于10mg的超纯水中超声分散形成均匀的分散液(浓度为15wt.％)；将浓度为10-30mM、19.7-59.1mg交联剂EDC和浓度为20-60mM、23.0-69.0mg交联剂NHS加入到上述分散液中搅拌1h，活化羧基化氧化石墨烯上的羧基；得到羧基活化的羧基化氧化石墨烯；

(2)取30mg纳米羟基磷灰石(粒径为40-60nm)于10mL体积分数为2％的稀醋酸溶液中，超声分散后得到纳米羟基磷灰石的悬浊液；

(3)在上述纳米羟基磷灰石的悬浊液中加入300mg的壳聚糖粉末，激烈搅拌后得到混合均匀的壳聚糖/纳米羟基磷灰石混合溶液，将所得壳聚糖/纳米羟基磷灰石混合液置于4℃冰箱中2小时去除气泡；

(4)将步骤(1)中羧基活化的羧基化氧化石墨烯滴加到含有壳聚糖和纳米羟基磷灰石混合液中，使羧基化氧化石墨烯的质量百分比为0.5wt.％【即壳聚糖粉末300mg、羟基磷灰石30mg、羧基化氧化石墨烯1.5mg】，激烈搅拌均匀后，于60℃水浴条件下交联30min，经冷冻干燥后得到壳聚糖/氧化石墨烯/纳米羟基磷灰石三维多孔复合支架材料。

对本实施例中制得的壳聚糖/氧化石墨烯/纳米羟基磷灰石三维多孔复合支架材料进行形貌表征。附图2为本实施例制备的多孔复合支架的扫描电镜图，如图2所示，制备的复合支架具有高度多孔性，且孔与孔相互连通，纳米羟基磷灰石均匀分布在复合支架中。

实施例3

一种壳聚糖/氧化石墨烯/纳米羟基磷灰石三维多孔复合支架材料的制备方法，其具体步骤如下：

(1)称取3mg的羧基化氧化石墨烯于10mg的超纯水中超声分散形成均匀的分散液(浓度为30wt.％)；将浓度为10-30mM、19.7-59.1mg交联剂EDC和浓度为20-60mM、23.0-69.0mg交联剂NHS加入到上述分散液中搅拌1h，活化羧基化氧化石墨烯上的羧基；得到羧基活化的羧基化氧化石墨烯；

(2)取45mg纳米羟基磷灰石(粒径为40-60nm)于10mL体积分数为2％的稀醋酸溶液中，超声分散后得到羟基磷灰石的悬浊液；

(3)在上述羟基磷灰石的悬浊液中加入300mg的壳聚糖粉末，激烈搅拌后得到混合均匀的壳聚糖/纳米羟基磷灰石混合溶液，将所得壳聚糖/纳米羟基磷灰石混合液置于4℃冰箱中2小时去除气泡；

(4)将步骤(1)中羧基活化的羧基化氧化石墨烯滴加到含有壳聚糖和纳米羟基磷灰石混合液中，使羧基化氧化石墨烯的质量百分比为1.0wt.％【即壳聚糖粉末300mg、羟基磷灰石45mg、羧基化氧化石墨烯3mg】，激烈搅拌均匀后，于60℃水浴条件下交联30min，经冷冻干燥后得到壳聚糖/氧化石墨烯/纳米羟基磷灰石三维多孔复合支架材料。

对本实施例中制得的壳聚糖/氧化石墨烯/纳米羟基磷灰石三维多孔复合支架材料进行形貌表征。附图3为本实施例制备的多孔复合支架的扫描电镜图，如图3所示，制备的复合支架具有高度多孔性，且孔与孔相互连通，纳米羟基磷灰石均匀分布在复合支架中。

实施例4

一种壳聚糖/氧化石墨烯/纳米羟基磷灰石三维多孔复合支架材料的制备方法，其具体步骤如下：

(1)称取7.5mg的羧基化氧化石墨烯于10mg的超纯水中超声分散形成均匀的分散液(浓度为75wt.％)；将浓度为10-30mM、19.7-59.1mg交联剂EDC和浓度为20-60mM、23.0-69.0mg交联剂NHS加入到上述分散液中搅拌1h，活化羧基化氧化石墨烯上的羧基；得到羧基活化的羧基化氧化石墨烯；

(2)取60mg纳米羟基磷灰石(粒径为40-60nm)于10mL体积分数为2％的稀醋酸溶液中，超声分散后得到羟基磷灰石的悬浊液；

(3)在上述羟基磷灰石的悬浊液中加入300mg的壳聚糖粉末，激烈搅拌后得到混合均匀的壳聚糖/纳米羟基磷灰石混合溶液，将所得壳聚糖/纳米羟基磷灰石混合液置于4℃冰箱中2小时去除气泡；

(4)将步骤(1)中羧基活化的羧基化氧化石墨烯滴加到含有壳聚糖和纳米羟基磷灰石混合液中，使羧基化氧化石墨烯的质量百分比为2.5wt.％【即壳聚糖粉末300mg、羟基磷灰石60mg、羧基化氧化石墨烯7.5mg】，激烈搅拌均匀后，于60℃水浴条件下交联30min，经冷冻干燥后得到壳聚糖/氧化石墨烯/纳米羟基磷灰石三维多孔复合支架材料。

对本实施例中制得的壳聚糖/氧化石墨烯/纳米羟基磷灰石三维多孔复合支架材料进行形貌表征。附图4为本实施例制备的多孔复合支架的扫描电镜图，如图4所示，制备的复合支架具有高度多孔性，且孔与孔相互连通，纳米羟基磷灰石均匀分布在复合支架中。

图5是本专利实施过程中使用的纳米羟基磷灰石的扫描电镜照片，如图5所示，纳米羟基磷灰石为尺寸均匀的纳米粒子，平均尺寸约为40-60nm。图6是本实施过程中使用的羧基化氧化石墨烯，如图6所示，经过羧基化改性后，氧化石墨烯表面羧基官能团的含量显著提高，而其他含氧官能团(如环氧基、羟基和羰基等)含量显著降低。图7是利用本发明制备的各种壳聚糖/氧化石墨烯/纳米羟基磷灰石复合多孔支架的力学性能表征，如图7所示，通过添加氧化石墨烯，能显著提高复合支架的压缩强度和拉伸强度。

实施例5

一种壳聚糖/氧化石墨烯/纳米羟基磷灰石三维多孔复合支架材料的制备方法，其具体步骤如下：

(1)称取10mg的羧基化氧化石墨烯于10mg的超纯水中超声分散形成均匀的分散液；将浓度为10-30mM、19.7mg交联剂EDC和浓度为20-60mM、23.0mg交联剂NHS加入到上述分散液中搅拌1h，活化羧基化氧化石墨烯上的羧基；得到羧基活化的羧基化氧化石墨烯；

(2)取25mg纳米羟基磷灰石(粒径为40-60nm，或称羟基磷灰石)于10mL体积分数为2％的稀醋酸溶液中，超声分散后得到羟基磷灰石的悬浊液；

(3)在上述羟基磷灰石的悬浊液中加入300mg的壳聚糖粉末，激烈搅拌后得到混合均匀的壳聚糖/纳米羟基磷灰石混合溶液(复合物)，将所得壳聚糖/纳米羟基磷灰石混合液置于4℃冰箱中2h去除气泡；得到含有壳聚糖和纳米羟基磷灰石混合液；

(4)将步骤(1)中羧基活化的羧基化氧化石墨烯滴加到含有壳聚糖和纳米羟基磷灰石混合液中，激烈搅拌均匀后，于60℃水浴条件下交联30min，经冷冻干燥后得到壳聚糖/氧化石墨烯/纳米羟基磷灰石三维多孔复合支架材料。

该支架材料具有高度连通的三维多孔结构、优良的力学性能和生物活性，可作为细胞培养支架用于骨组织损伤修复。

实施例6

一种壳聚糖/氧化石墨烯/纳米羟基磷灰石三维多孔复合支架材料的制备方法，其具体步骤如下：

(1)称取30mg的羧基化氧化石墨烯于10mg的超纯水中超声分散形成均匀的分散液；将浓度为10-30mM、59.1mg交联剂EDC和浓度为20-60mM、69.0mg交联剂NHS加入到上述分散液中搅拌1h，活化羧基化氧化石墨烯上的羧基；得到羧基活化的羧基化氧化石墨烯；

(2)取60mg纳米羟基磷灰石(粒径为40-60nm，或称羟基磷灰石)于10mL体积分数为2％的稀醋酸溶液中，超声分散后得到羟基磷灰石的悬浊液；

(3)在上述羟基磷灰石的悬浊液中加入300mg的壳聚糖粉末，激烈搅拌后得到混合均匀的壳聚糖/纳米羟基磷灰石混合溶液(复合物)，将所得壳聚糖/纳米羟基磷灰石混合液置于4℃冰箱中2h去除气泡；得到含有壳聚糖和纳米羟基磷灰石混合液；

(4)将步骤(1)中羧基活化的羧基化氧化石墨烯滴加到含有壳聚糖和纳米羟基磷灰石混合液中，激烈搅拌均匀后，于60℃水浴条件下交联30min，经冷冻干燥后得到壳聚糖/氧化石墨烯/纳米羟基磷灰石三维多孔复合支架材料。

该支架材料具有高度连通的三维多孔结构、优良的力学性能和生物活性，可作为细胞培养支架用于骨组织损伤修复。