一种土壤富里酸亚组分分级提取方法

摘要

本发明公开了一种土壤富里酸亚组分分级提取方法，所述提取方法包括如下步骤，步骤a：土壤样品预处理、步骤b：土壤有机质的分级萃取、步骤c：分级富里酸亚组分粗品制备、步骤d：分级富里酸亚组分粗品浓缩、步骤e：富里酸亚组分样品的纯化。通过上述方式，本发明能够通过利用不同的溶液连续萃取技术从土壤中分级提取出富里酸亚组分溶液，并利用大孔径树脂对分级提取的富里酸亚组分溶液进行富集，最终得到分级的富里酸亚组分固体样品。

说明书

技术领域

本发明涉及土壤分离提取技术领域，具体涉及一种土壤富里酸亚组分的分级提取方法。

背景技术

富里酸是由生物质降解形成的大分子有机混合物，它广泛分布于水、土、气等环境介质中。富里酸的结构非常复杂，分子量从几百到几十万不等，元素组成和化学结构随时空和来源而变化。富里酸在环境地球化学及全球生态系统中具有重要作用，世界各国对于海洋、河水、废水等各种来源富里酸的地球化学特征开展了广泛的研究。目前对富里酸的整体结构特征和地球化学循环已经取得了一定的进展，但是由于土壤中富里酸浓度极低(一般<5%)，加之富里酸有机质组成和化学结构的复杂性，要对富里酸化学组分和环境行为进行深入研究，必须对富里酸进行进一步富集和分离。目前常用的分离方法有树脂吸附法、色谱分离法、反渗透法等。其中XAD—8树脂分离技术是国际腐殖酸协会(InternationalHumicSubstancesSociety:IHSS)推荐的标准技术，也是目前最常用的技术之一。

为了更近一步的研究富里酸的结构和组成，前人将富里酸进行分级分离，从而减小其异质性，取得一系列成果。目前富里酸亚组分的分级分离技术，一般基于IHSS推荐的XAD—8吸附技术为基础，即首先将富里酸吸附在XAD—8树脂上，然后用不同性质的淋洗液淋洗树脂柱，得到不同富里酸亚组分分级样品。例如Dai等首先将富里酸吸附在XAD—8树脂上，然后利用三种不同pH有机缓冲液、水及乙醇淋洗树脂，得到5种富里酸亚组分分级样品（Dai,J.,Ran,W.,Xing,B.,Gu,M.&Wang,L.CharacterizationoffulvicacidfractionsobtainedbysequentialextractionswithpHbuffers,water,andethanolfrompaddysoils.Geoderma135,284–295(2006).）；Li等利用四种不同比例甲醇和盐酸溶液淋洗树脂，得到4种富里酸亚组分分级样品（Li,A.,Hu,J.,Li,W.,Zhang,W.&Wang,X.Polaritybasedfractionationoffulvicacids.Chemosphere.77,1419–1426(2009).）；Bai等利用5种不同pH的焦磷酸钠缓冲溶液淋滤树脂，得到5种富里酸亚组分分级样品（BaiY.,WuF.,XingB.,MengW.,ShiG.,MaY.&GiesyJ.IsolationandCharacterizationofChineseStandardFulvicAcidSub-fractionsSeparatedfromForestSoilbyStepwiseElutionwithPyrophosphat.ScientificReports.5,8723|DOI:10.1038/srep08723(2015)）。上述方法都明显分为两个过程：（1）富里酸的提取过程：从土壤中提取富里酸；（2）富里酸亚组分分级过程：基于不同组成和结构富里酸亚组分与XAD—8的结合能力不同进行分离。。前人的富里酸亚组分分级过程与富里酸在土壤中存在状态无关，不能反映土壤中富里酸的赋存状态和理化性质；也不能实现富里酸亚组分的提取过程和分级过程的统一。最近研究表明，少量富里酸亚组分以自由态存在于土壤孔隙水中；大部分富里酸亚组分与土壤矿物(如矿物中的钙、铝、铁等)结合，形成结合态富里酸亚组分。结合态的富里酸亚组分主要包括钙结合态富里酸亚组分、铝结合态富里酸亚组分、铁结合态富里酸亚组分及强结合态富里酸亚组分，不同结合态的富里酸亚组分理化性质存在明显差异。

本发明专利基于富里酸亚组分在土壤中赋存形态的不同(包括：自由态富里酸亚组分、结合态富里酸亚组分、铝结合态富里酸亚组分、铁结合态富里酸亚组分及强结合态富里酸亚组分)，利用去离子水、盐酸、焦磷酸钠和氢氧化钠分别对富里酸亚组分进行多次分级提取，通过多次分离完成对土壤中的富里酸亚组分的充分提取，实现了富里酸亚组分分级过程与提取过程的统一。

发明内容

为充分实现对土壤中的富里酸亚组分的分离富集，本发明公开了一种土壤富里酸亚组分的分级提取方法，通过该方法，能成功分级提取土壤中的富里酸亚组分，并制备了一系列分级提取的富里酸亚组分样品，以供后续研究使用。

本发明公开的技术方案为：一种土壤富里酸亚组分分级提取方法，所述提取方法包括如下步骤：

步骤a：土壤样品预处理：称取天然土壤，剔除树根和石子等杂物，风干，碾磨过筛，得到预处理土壤样品；

步骤b：土壤有机质的分级萃取：

向步骤a中的预处理土壤样品中加入去离子水，使其固液比介于1:10～3:10之间，连续搅拌2～5h，静置20～28h后，离心分离，得到上清液1及土壤样品1；

向土壤样品1中加入去离子水，使其固液比介于1:10～3:10之间，连续搅拌2～5h，静置20～28h后，离心分离，得到上清液2及土壤样品2；

向土壤样品2中加入去离子水，使其固液比介于1:5～3:10之间，用盐酸和氢氧化钠调节溶液pH介于1.0～3.0之间，继续加入0.1～1.0mol/L的盐酸溶液，使其固液比介于1:10～3:10之间，然后将溶液连续搅拌2～5h，静置20～28h后，离心分离，得到上清液3及土壤样品3；

向土壤样品3中加入0.1～1.0mol/L的盐酸溶液，使其固液比介于1:10～3:10之间，然后将溶液连续搅拌2～5h，静置20～28h后，离心分离，得到上清液4及土壤样品4；

向土壤样品4中加入去离子水，使其固液比介于1:5～1:3之间，用盐酸和氢氧化钠调节其pH值介于6.0～8.0之间，在氮气保护下，向溶液中加入焦磷酸钠溶液，使其固液比介于1:10～3:10之间且焦磷酸钠浓度介于0.1～0.2mol/L之间，然后将溶液连续搅拌2～5h，静置20～28h后，离心分离，得到上清液5及土壤样品5；

在氮气保护下，向土壤样品5中加入焦磷酸钠溶液，使其固液比介于1:10～3:10之间且焦磷酸钠浓度介于0.1～0.2mol/L之间，然后将溶液连续搅拌2～5h，静置20～28h后，离心分离，得到上清液6及土壤样品6；

在氮气保护下，向土壤样品6中加入焦磷酸钠溶液，使其固液比介于1:10～3:10之间且焦磷酸钠浓度介于0.1～0.2mol/L之间，然后将溶液连续搅拌2～5h，静置20～28h后，离心分离，得到上清液7及土壤样品7；

向土壤样品7中加入去离子水，使其固液比介于1:5～3:10之间，用盐酸和氢氧化钠调节其pH介于6.0～8.0之间，在氮气保护下，向溶液中加入氢氧化钠溶液，使其固液比介于1:10～3:10之间且氢氧化钠浓度介于0.1～0.3mol/L之间，然后将溶液连续搅拌2～5h，静置20～28h后，离心分离，得到上清液8及土壤样品8；

在氮气保护下，向土壤样品8中加入氢氧化钠溶液，使其固液比介于1:10～3:10之间且氢氧化钠浓度介于0.1～0.3mol/L之间，然后将溶液连续搅拌2～5h，静置20～28h后，离心分离，得到上清液9及土壤样品9；

在氮气保护下，向土壤样品9中加入氢氧化钠溶液，使其固液比介于1:10～3:10之间且氢氧化钠浓度介于0.1～0.3mol/L之间，然后将溶液连续搅拌2～5h，静置20～28h后，离心分离，得到上清液10及土壤样品10；

步骤c：分级富里酸亚组分粗品制备：将步骤b中的上清液1～上清液10，共计10份上清液分别调节至pH值介于1.0～2.0之间，再分别搅拌2～5h，分别静置20～28h，离心分离，将10份上清液分别标记为粗提富里酸亚组分溶液1～粗提富里酸亚组分溶液10；

步骤d：分级富里酸亚组分粗品浓缩：将步骤c中的粗提富里酸亚组分溶液1～粗提富里酸亚组分溶液10，共计10份粗提富里酸亚组分溶液分别以10～20倍柱体积/h的流速通过XAD—8树脂柱；

吸附完成后，分别以10～20倍柱体积/h的流速用0.4～0.8倍柱体积的去离子水洗涤XAD—8树脂柱，然后以3～5倍柱体积/h的流速依次用0.5～3倍柱体积的0.1～1.0mol/L氢氧化钠溶液和1～3倍柱体积去离子水洗涤XAD—8树脂柱，流出液立即酸化至pH值介于1.0～3.0之间，最终得到与10份粗提富里酸亚组分相对应的10份酸化液；

步骤e：富里酸亚组分样品的纯化：将上述10份酸化液分别加入氢氟酸，使每份酸化液中的氢氟酸浓度为0.1～0.3mol/L时将溶液静置12～48h，然后分别标记为无硅溶液1～无硅溶液10，共计10份无硅溶液；

将上述10份无硅溶液分别以3～5倍柱体积/h流速通过XAD—8树脂柱；

吸附完成后，分别以10～20倍柱体积/h的流速用0.4～0.8倍柱体积去离子水洗涤XAD—8树脂柱，弃去流出液，然后以3～5倍柱体积/h的流速依次用0.5～3倍柱体积0.1～0.3mol/L氢氧化钠溶液和1～3倍柱体积去离子水洗涤XAD—8树脂柱，流出液通过氢离子饱和的氢型阳离子交换树脂，流出液分别标记为富里酸亚组分1～富里酸亚组分10；

将富里酸亚组分1～富里酸亚组分10分别冷冻干燥，最终得到10份固体富里酸亚组分分级样品。

优选的，所述分级提取方法还包括步骤f：富里酸亚组分分级样品纯度测定，取步骤e中的任一份富里酸亚组分分级样品，在700～750℃条件下灼烧5～6h，测定其灰分含量；若该富里酸亚组分分级样品的灰分含量大于1.0%，则将其在氮气保护下用0.01～0.1mol/L氢氧化钠和0.1～0.3mol/L氯化钾混合溶液溶解后，再用0.1～1.0mol/L盐酸调节其pH=1.0～3.0，将溶解液按照步骤e和f重复操作，直到其灰分小于1.0%。

更具体的，所述提取方法包括如下步骤：

步骤a：土壤样品预处理：称取天然土壤，剔除树根和石子等杂物，风干，碾磨过2.0mm筛，得到预处理土壤样品；

步骤b：土壤有机质的分级萃取：

向步骤a中的预处理土壤样品中加入去离子水，使其固液比达到1:10，连续搅拌4h，静置24h后，离心分离，得到上清液1及土壤样品1；

向土壤样品1中加入去离子水，使其固液比达到1:10，连续搅拌4h，静置24h后，离心分离，得到上清液2及土壤样品2；

向土壤样品2中加入去离子水，使其固液比达到1:5，用盐酸和氢氧化钠调节溶液pH值等于1.0，继续加入0.1mol/L的盐酸溶液，使其固液比为1:10，然后将溶液连续搅拌4h，静置24h后，离心分离，得到上清液3及土壤样品3；

向土壤样品3中加入0.1mol/L的盐酸溶液，使其固液比为1:10，然后将溶液连续搅拌4h，静置24h后，离心分离，得到上清液4及土壤样品4；

向土壤样品4中加入去离子水，使其固液比达到1:3，用盐酸和氢氧化钠调节其pH值介于6.0～8.0之间，在氮气保护下，向溶液中加入焦磷酸钠溶液，使其固液比为1:10且焦磷酸钠浓度为0.1mol/L，然后将溶液连续搅拌4h，静置24h后，离心分离，得到上清液5及土壤样品5；

在氮气保护下，向土壤样品5中加入焦磷酸钠溶液，使其固液比为1:10且焦磷酸钠浓度为0.1mol/L，然后将溶液连续搅拌4h，静置24h后，离心分离，得到上清液6及土壤样品6；

在氮气保护下，向土壤样品6中加入焦磷酸钠溶液，使其固液比为1:10且焦磷酸钠浓度为0.1mol/L，然后将溶液连续搅拌4h，静置24h后，离心分离，得到上清液7及土壤样品7；

向土壤样品7中加入去离子水，使其固液比达到1:5，用盐酸和氢氧化钠调节其pH值介于6.0～8.0之间，在氮气保护下，向溶液中加入氢氧化钠溶液，使其固液比为1:10且氢氧化钠浓度为0.1mol/L，然后将溶液连续搅拌4h，静置24h后，离心分离，得到上清液8及土壤样品8；

在氮气保护下，向土壤样品8中加入氢氧化钠溶液，使其固液比为1:10且氢氧化钠浓度为0.1mol/L，然后将溶液连续搅拌4h，静置24h后，离心分离，得到上清液9及土壤样品9；

在氮气保护下，向土壤样品9中加入氢氧化钠溶液，使其固液比为1:10且氢氧化钠浓度为0.1mol/L，然后将溶液连续搅拌4h，静置24h后，离心分离，得到上清液10及土壤样品10；

步骤c：分级富里酸亚组分粗品制备：将步骤b中的上清液1～上清液10，共计10份上清液分别调节至pH值等于1.0，再分别搅拌4h，分别静置24h，离心分离，将10份上清液分别标记为粗提富里酸亚组分溶液1～粗提富里酸亚组分溶液10；

步骤d：分级富里酸亚组分粗品浓缩：将步骤c中的粗提富里酸亚组分溶液1～粗提富里酸亚组分溶液10，共计10份粗提富里酸亚组分溶液分别以15倍柱体积/h的流速通过XAD—8树脂柱；

吸附完成后，分别以3倍柱体积/h的流速用0.65倍柱体积的去离子水洗涤XAD—8树脂柱，然后以3倍柱体积/h的流速依次用1倍柱体积0.1mol/L氢氧化钠溶液和2倍柱体积去离子水洗涤XAD—8树脂柱，流出液立即酸化至pH值等于1.0，得到10份酸化液；

步骤e：富里酸亚组分样品的纯化：将上述10份酸化液分别加入氢氟酸，使每份酸化液中的氢氟酸浓度为0.3mol/L时将其静置24h，然后分别将其标记为无硅溶液1～无硅溶液10，共计10份无硅溶液；

将上述10份无硅溶液分别以5倍柱体积/h流速通过XAD—8树脂柱；

吸附完成后，分别以15倍柱体积/h的流速用0.65倍柱体积去离子水洗涤XAD—8树脂柱，弃去流出液，然后然后以3倍柱体积/h的流速依次用1倍柱体积0.1mol/L氢氧化钠溶液和2倍柱体积去离子水洗涤XAD—8树脂柱，流出液通过氢离子饱和的氢型阳离子交换树脂，流出液分别标记为富里酸亚组分1～富里酸亚组分10，共计10份富里酸亚组分样品；

将富里酸亚组分1～富里酸亚组分10分别冷冻干燥，最终得到10份固体富里酸亚组分分级样品。

本发明中步骤b中所述的上清液1和上清液2，属于利用去离子水直接提取土壤中的水溶性富里酸亚组分，而土壤中的水溶性富里酸亚组分含量极低，上清液1与上清液2中可能提取到一定量的水溶性富里酸亚组分，也可能提取不到足够量的富里酸亚组分。

本发明中步骤b中分级提取土壤中富里酸亚组分的操作是：首先，通过连续两次用水提取腐殖酸和富里酸亚组分，将水溶态和自由态的腐殖酸与富里酸亚组分溶出：即上清液1和上清液2的提取操作；其机理是通过向土壤中加入水，将腐殖酸和富里酸亚组分一起溶出。紧接着，再通过两次用盐酸提取富里酸亚组分，将酸可溶物结合的富里酸亚组分溶出：即步骤b中提取上清液3和上清液4的操作；其操作原理是通过向土壤中加入酸，将土壤中富里酸亚组分溶出。然后，再连续三次用焦磷酸钠提取腐殖酸和富里酸亚组分，将钙、镁、铝、铁等结合的腐殖酸与富里酸亚组分溶出：即步骤b中提取上清液5、上清液6、上清液7的操作。最后再连续三次用氢氧化钠提取腐殖酸和富里酸亚组分，将剩余的难溶的腐殖酸和富里酸亚组分从溶液中提取，即步骤b中上清液8、上清液9、上清液10的操作。

本发明步骤c的操作主要是在pH等于1.0条件下，除去腐殖酸杂质，得到富里酸亚组分。其原理如下：土壤中的有机物（也叫腐殖质）主要包括腐殖酸和富里酸，二者都是大分子有机酸性混合物，二者在碱性条件下都溶于水。但是腐殖酸在pH等于1.0时不溶解，富里酸及其亚组分在任何pH都溶解。因此本发明中利用腐殖酸和富里酸在pH等于1.0条件下的溶解性不同而实现腐殖酸和富里酸的分离。

本发明步骤d的操作主要是浓缩富里酸亚组分溶液，以便减少步骤e中氢氟酸等化学药品的用量。

本发明步骤e中加入氢氟酸的操作是：利用氢氟酸和硅酸盐及硅单质反应，产生四氟合硅气体，从而去除富里酸亚组分样品中的含硅杂质。去除硅酸盐之后的操作是利用XAD—8再将富里酸亚组分富集，然后去除盐分和水：用氢氧化钠洗涤XAD—8树脂，然后用氢型阳离子树脂交换掉Na⁺，从而去除盐分，冷冻干燥去除水分。

根据Tessier理论，土壤中金属离子主要可分为水溶态、交换态、碳酸盐结合态、铁锰氧化物结合态、有机结合态和残留态。本发明步骤b中所述的上清液3和上清液4的提取时向溶液中加入盐酸（土壤酸洗），其目的是：（1）利用盐酸与土壤中交换态钙、镁碳酸盐反应，去除部分钙镁离子，增加富里酸的暴露程度，为焦磷酸钠和氢氧化钠提取富里酸亚组分提供条件；（2）盐酸与土壤矿物中的铁、铝、锰反应，减少自由态和酸溶性铁、铝、锰离子浓度，降低铁、铝、锰对焦磷酸钠和氢氧化钠提取过程的影响；（3）利用盐酸提取酸溶性富里酸亚组分和部分钙、镁、铁、铝等结合态富里酸亚组分。

本发明步骤b中所述的上清液5、上清液6、上清液7的制备中，向溶液中加入焦磷酸钠，由于在此之前，土壤酸洗中过程中自由态和酸溶态金属离子已经去除，土壤中的富里酸亚组分进一步暴露，故焦磷酸钠主要与有机质结合态钙、镁、铁、铝等反应，涉及主要反应有：

2[R(COO)]₂Ca+Na₄P₂O₇→R(COONa)₄+Ca₂P₂O₇(沉淀)

4[R(COO)]₃Fe+3Na₄P₂O₇→3R(COONa)₄+Fe₄(P₂O₇)₃(沉淀)

4[R(COO)]₃Al+3Na₄P₂O₇→3R(COONa)₄+Al₄(P₂O₇)₃(沉淀)

由于土壤酸洗过程除去部分钙、镁、铁、铝，加入焦磷酸钠后产生的沉淀焦磷酸钙、焦磷酸铁、焦磷酸铝等不会将富里酸亚组分包裹起来，从而利于使用氢氧化钠对富里酸亚组分的提取。

本发明步骤b中所述的上清液8、上清液9、上清液10的制备中，所涉及到的反应有

R(COOH)+NaOH→HA(COONa)+H₂O

土壤酸洗过程除去部分钙、镁、铁、铝，加入焦磷酸钠后产生的沉淀氢氧化钙、氢氧化铁、氢氧化铝等不会将富里酸亚组分包裹起来，从而利于富里酸亚组分的提取。

本发明中所述的步骤中的离心分离中的离心力为100～3500g，离心分离时间是在5～10min。

本发明通过利用去离子水、盐酸、焦磷酸钠、氢氧化钠等提取液的配合使用，根据土壤中富里酸亚组分赋存形态的不同，逐步提取组成、结构和性质不同的富里酸亚组分分级样品，经过XAD—8树脂柱富集和纯化，最终得到10个富里酸亚组分分级固体样品，该10个富里酸亚组分分级样品符合国际腐殖酸协会对富里酸亚组分样品灰分的要求，可以用来进行富里酸亚组分组成、结构、性质的研究。

实施例2：本实施例中公开了一种土壤富里酸亚组分分级提取方法，所述提取方法包括如下步骤：

步骤a：土壤样品预处理：称取天然土壤，剔除树根和石子等杂物，风干，碾磨过筛，得到预处理土壤样品；

步骤b：土壤有机质的分级萃取：

向步骤a中的预处理土壤样品中加入去离子水，使其固液比在1:10～3:10之间，连续搅拌2～5h，静置20～28h后，离心分离，得到上清液1及土壤样品1；

向土壤样品1中加入去离子水，使其固液比在1:10～3:10之间，连续搅拌2～5h，静置20～28h后，离心分离，得到上清液2及土壤样品2；

向土壤样品2中加入去离子水，使其固液比在1:5～3:10之间，用盐酸和氢氧化钠调节溶液pH在1.0～3.0之间，继续加入0.1～1.0mol/L的盐酸溶液，使其固液比在1:10～3:10之间，然后将溶液连续搅拌2～5h，静置20～28h后，离心分离，得到上清液3及土壤样品3；

向土壤样品3中加入0.1～1.0mol/L的盐酸溶液，使其固液比在1:10～3:10之间，然后将溶液连续搅拌2～5h，静置20～28h后，离心分离，得到上清液4及土壤样品4；

向土壤样品4中加入去离子水，使其固液比在1:5～1:3之间，用盐酸和氢氧化钠调节其pH值在6.0～8.0之间，在氮气保护下，向溶液中加入焦磷酸钠溶液，使其固液比在1:10～3:10之间且焦磷酸钠浓度在0.1～0.2mol/L之间，然后将溶液连续搅拌2～5h，静置20～28h后，离心分离，得到上清液5及土壤样品5；

在氮气保护下，向土壤样品5中加入焦磷酸钠溶液，使其固液比在1:10～3:10之间且焦磷酸钠浓度在0.1～0.2mol/L之间，然后将溶液连续搅拌2～5h，静置20～28h后，离心分离，得到上清液6及土壤样品6；

在氮气保护下，向土壤样品6中加入焦磷酸钠溶液，使其固液比在1:10～3:10之间且焦磷酸钠浓度在0.1～0.2mol/L之间，然后将溶液连续搅拌2～5h，静置20～28h后，离心分离，得到上清液7及土壤样品7；

向土壤样品7中加入去离子水，使其固液比在1:5～3:10之间，用盐酸和氢氧化钠调节其pH在6.0～8.0之间，在氮气保护下，向溶液中加入氢氧化钠溶液，使其固液比在1:10～3:10之间且氢氧化钠浓度在0.1～0.3mol/L之间，然后将溶液连续搅拌2～5h，静置20～28h后，离心分离，得到上清液8及土壤样品8；

在氮气保护下，向土壤样品8中加入氢氧化钠溶液，使其固液比在1:10～3:10之间且氢氧化钠浓度在0.1～0.3mol/L之间，然后将溶液连续搅拌2～5h，静置20～28h后，离心分离，得到上清液9及土壤样品9；

在氮气保护下，向土壤样品9中加入氢氧化钠溶液，使其固液比在1:10～3:10之间且氢氧化钠浓度在0.1～0.3mol/L之间，然后将溶液连续搅拌2～5h，静置20～28h后，离心分离，得到上清液10及土壤样品10；

步骤c：分级富里酸亚组分粗品制备：将步骤b中的上清液1～上清液10，共计10份上清液分别调节至pH值在1.0～2.0之间，再分别搅拌2～5h，分别静置20～28h，离心分离，将10份上清液分别标记为粗提富里酸亚组分溶液1～粗提富里酸亚组分溶液10；

步骤d：分级富里酸亚组分粗品浓缩：将步骤c中的粗提富里酸亚组分溶液1～粗提富里酸亚组分溶液10，共计10份粗提富里酸亚组分溶液分别以10～20倍柱体积/h的流速通过XAD—8树脂柱；

吸附完成后，分别以10～20倍柱体积/h的流速用0.4～0.8倍柱体积的去离子水洗涤XAD—8树脂柱，然后以3～5倍柱体积/h的流速依次用0.5～3倍柱体积的0.1～1.0mol/L氢氧化钠溶液和1～3倍柱体积去离子水洗涤XAD—8树脂柱，流出液立即酸化至pH值介于1.0～3.0之间，最终得到与10份粗提富里酸亚组分相对应的10份酸化液；

步骤e：富里酸亚组分样品的纯化：将上述10份酸化液分别加入氢氟酸，使每份酸化液中的氢氟酸浓度为0.1～0.3mol/L时将溶液静置12～48h，然后分别标记为无硅溶液1～无硅溶液10，共计10份无硅溶液；

将上述10份无硅溶液分别以3～5倍柱体积/h流速通过XAD—8树脂柱；

吸附完成后，分别以10～20倍柱体积/h的流速用0.4～0.8倍柱体积去离子水洗涤XAD—8树脂柱，弃去流出液，然后以3～5倍柱体积/h的流速依次用0.5～3倍柱体积0.1～0.3mol/L氢氧化钠溶液和1～3倍柱体积去离子水洗涤XAD—8树脂柱，流出液通过氢离子饱和的氢型阳离子交换树脂，流出液分别标记为富里酸亚组分1～富里酸亚组分10；

将富里酸亚组分1～富里酸亚组分10分别冷冻干燥，最终得到10份固体富里酸亚组分分级样品。

实施例3：本实施例与实施例2的不同之处在于，本实施例中，所述分级提取方法还包括步骤f：富里酸亚组分分级样品纯度测定，取步骤e中的任一份富里酸亚组分分级样品，在700～750℃条件下灼烧5～6h，测定其灰分含量；若该富里酸亚组分分级样品的灰分含量大于1.0%，则将其在氮气保护下用0.01～0.1mol/L氢氧化钠和0.1～0.3mol/L氯化钾混合溶液溶解后，再用0.1～1.0mol/L盐酸调节其pH=1.0～3.0，将溶解液按照步骤e和f重复操作，直到其灰分小于1.0%。本发明的有益效果是：本发明公开的土壤富里酸亚组分的分级提取技术能够有效地将土壤中的富里酸亚组分逐步提取，并制备不同级别的富里酸亚组分分级样品；该方法操作简单、提取率高，且制备的富里酸亚组分分级样品能够满足定性和定量科学研究的要求，潜在经济效益巨大。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。

本发明实施例包括：

实施例1：利用本发明方法提取北京蟒山森林表层土壤中富里酸亚组分，并制备不同级别的富里酸亚组分分级样品，具体操作如下：

(1)试验试剂及样品：

土壤样品：北京蟒山森林表层土壤；

盐酸：分析纯；氢氧化钠：分析纯；焦磷酸钠：分析纯；XAD—8树脂：Sigma公司。

(2)提取步骤：

步骤a：土壤样品预处理：称取10Kg天然土壤，剔除树根和石子等杂物，风干，碾磨过2.0mm筛，得到预处理土壤样品；

步骤b：土壤有机质的分级萃取：

向步骤a中的预处理土壤样品中加入100L去离子水，使其固液比达到1:10，连续搅拌4h，静置24h后，离心分离，得到约100L上清液1及土壤样品1；

向土壤样品1中加入100L去离子水，使其固液比达到1:10，连续搅拌4h，然后静置24h后，离心分离，得到约100L上清液2及土壤样品2；

向土壤样品2中加入50L去离子水，使其固液比达到1:5，用1mol/L盐酸和1mol/L氢氧化钠调节溶液pH值=1.0，继续加入0.1mol/L的盐酸溶液，使其固液比为1:10，然后将溶液连续搅拌4h，静置24h后，离心分离，得到约100L上清液3及土壤样品3；

向土壤样品3中加入100L浓度为0.1mol/L的盐酸溶液，使其固液比达到1:10，然后将溶液连续搅拌4h，静置24h后，离心分离，得到约100L上清液4及土壤样品4；

向土壤样品4中加入30L去离子水，使其固液比达到1:3，用1mol/L盐酸和1mol/L氢氧化钠调节其pH等于7.0，在氮气保护下，向溶液中加入浓度为0.2mol/L焦磷酸钠溶液和去离子水，使其固液比为1:10且焦磷酸钠浓度为0.1mol/L，然后将溶液连续搅拌4h，静置24h后，离心分离，得到约100L上清液5及土壤样品5；

在氮气保护下，向土壤样品5中加入0.2mol/L焦磷酸钠溶液和去离子水，使其固液比为1:10且焦磷酸钠浓度为0.1mol/L，然后将溶液连续搅拌4h，静置24h后，离心分离，得到约100L上清液6及土壤样品6；

在氮气保护下，向土壤样品6中加入0.2mol/L焦磷酸钠溶液和去离子水，使其固液比为1:10且焦磷酸钠浓度为0.1mol/L，然后将溶液连续搅拌4h，静置24h后，离心分离，得到约100L上清液7及土壤样品7；

向土壤样品7中加入去离子水，使其固液比达到1:5，用1mol/L盐酸和1mol/L氢氧化钠调节其pH等于7.0，在氮气保护下，向溶液中加入0.3mol/L氢氧化钠溶液，使其固液比为1:10且氢氧化钠浓度为0.1mol/L，然后将溶液连续搅拌4h，静置24h后，离心分离，得到约100L上清液8及土壤样品8；

在氮气保护下，向土壤样品8中加入0.3mol/L氢氧化钠溶液和去离子水，使其固液比为1:10且氢氧化钠浓度为0.1mol/L，然后将溶液连续搅拌4h，静置24h后，离心分离，得到约100L上清液9及土壤样品9；

在氮气保护下，向土壤样品9中加入0.3mol/L氢氧化钠溶液和去离子水，使其固液比为1:10且氢氧化钠浓度为0.1mol/L，然后将溶液连续搅拌4h，静置24h后，离心分离，得到约100L上清液10及土壤样品10；

步骤c：分级富里酸亚组分粗品制备：将步骤b中的上清液1～上清液10，共计10份上清液，每份100L，分别调节至pH等于1.0，再分别搅拌4h，静置24h，离心分离，将10份上清液分别标记为粗提富里酸亚组分溶液1～粗提富里酸亚组分溶液10；

步骤d：分级富里酸亚组分粗品浓缩：将步骤c中的粗提富里酸亚组分溶液1～粗提富里酸亚组分溶液10，共计10份粗提富里酸亚组分溶液，每份100L，分别以15倍柱体积/h的流速通过XAD—8树脂柱，树脂柱中装载XAD—8树脂体积10L；

吸附完成后，分别以15倍柱体积/h的流速用0.65倍柱体积的去离子水洗涤树脂柱，然后以3倍柱体积/h的流速依次用1倍柱体积0.1mol/L氢氧化钠溶液和2倍柱体积去离子水洗涤树脂，流出液立即酸化至pH1.0，得到10份酸化液，每份体积为36.5L；

步骤e：富里酸亚组分样品的纯化：将上述10份酸化液分别加入10mol/L氢氟酸，使每份酸化液中的氢氟酸浓度为0.3mol/L时将其静置24h，然后分别将其标记为无硅溶液1～无硅溶液10，共计10份无硅溶液；

将上述10份无硅溶液分别以5倍柱体积/h流速通过XAD—8树脂柱，树脂柱中装载XAD—8树脂体积2L；

吸附完成后，分别以15倍柱体积/h的流速用0.65倍柱体积去离子水洗涤XAD—8树脂柱，流出液弃去，然后以3倍柱体积/h的流速依次用1倍柱体积0.1mol/L氢氧化钠溶液和2倍柱体积去离子水洗涤树脂，流出液通过氢离子饱和的氢型阳离子树脂，流出液分别标记为富里酸亚组分1～富里酸亚组分10，共计10份，每份6L；

将富里酸亚组分1～富里酸亚组分10分别冷冻干燥，最终得到10份固体富里酸亚组分分级样品。

从10Kg北京蟒山森林表层土壤中提取的10份富里酸亚组分分级组分，其固体量分别为0.157g、0.017g、1g、0.13g、37g、4g、0.5g、7.5g、0.8g、0.1g。富里酸亚组分灰分均小于1.0%。

结合富里酸自身特点，利用元素分析法和13C-NMR光谱分析法对实施例1所得的富里酸亚组分进行定量-半定量分析；利用FTIR、UV-Vis和三维荧光光谱对富里酸亚组分进行定性分析，结果如下：

元素分析结果显示，该方法提取的土壤富里酸亚组分中碳、氢、氧、硫元素含量及碳氢元素比、碳氧元素比，符合国际腐殖酸协会标准富里酸元素含量要求。FTIR光谱分析显示，该方法提取的土壤富里酸亚组分均包含羟基、烷基和羧基等官能团，这与国际腐殖酸协会标准富里酸红外光谱结论一致。UV-Vis光谱分析显示，该方法提取的土壤富里酸亚组分紫外吸光度均随着紫外波长增大而降低，紫外光谱符合指数递减规律，这与国际腐殖酸协会标准富里酸紫外光谱结论一致。¹³C-NMR光谱分析显示，该方法提取的土壤富里酸亚组分均包含饱和脂肪碳峰、烷氧基碳、芳香碳、羧基碳，这与国际腐殖酸协会标准富里酸一致。三维荧光光谱分析显示，该方法提取的土壤富里酸亚组分的三维荧光光谱峰均坐落于土壤类富里酸荧光峰范围，与国际腐殖酸协会标准富里酸一致。

进一步分析表明：该方法提取的不同富里酸亚组分中的氢碳元素比存在明显变化，富里酸亚组分1-10的氢碳元素比分别为0.74、0.77、0.85、0.89、0.97、1.04、1.08、1.17、1.19、1.23；

¹³C-NMR光谱分析结果显示，该方法提取的不同富里酸亚组分中的羧基碳比例存在明显变化，富里酸亚组分1-10的羧基碳比例为27.8、27.4、25.3、24.9、23.1、21.1、20.7、18.1、18.0、17.1；

该方法提取的不同富里酸亚组分中的芳香碳含量存在明显变化，富里酸亚组分1-10的芳香碳比例为29.3、27.6、28.9、30.1、22.7、21.9、20.1、20.8、19.9、22.5。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。