基于恒温级联核酸扩增的汞离子检测试剂盒及其检测方法

摘要

基于恒温级联核酸扩增的汞离子检测试剂盒及其检测方法，含有胸腺嘧啶的DNA识别元件特异性的结合汞离子后折叠并形成分子内茎环结构；DNA的3’端可以被聚合酶识别，以自身为模板起始链置换扩增反应，产生大量的单链DNA产物；该单链DNA可以打开含有酶切位点的分子信标茎环结构，产生荧光信号；同时，单链DNA产物还可以作为引物，以所杂交结合的分子信标为模板触发二次链置换扩增反应，而被释放后的SDA产物可与新的分子信标形成杂交双链，以产生级联放大的荧光信号，该测量方法灵敏度高，在无需增加体系复杂度的条件下，巧妙的实现了链置换扩增反应的级联放大，扩增效率高，反应速度快，可在30min内实现汞离子的定量，检测限低至2nM。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及汞离子的定量检测，特别涉及基于恒 温级联核酸扩增的汞离子检测试剂盒及其检测方法。

技术背景

重金属离子在环境中具有相当高的稳定性，且难以被微生物降解。它 们一旦进入环境，很难被自然修复，而且能够在生态系统中不断富集和传 递，即使微量摄入也会产生很大毒性，是生态平衡和人类健康的重大威胁。 作为重金属离子污染的典型代表，汞离子在生物组织内积累导致DNA损 伤，影响配体-受体的相互作用，破坏免疫系统，引发一系列的疾病，如脑 损伤，肾衰竭，各种认知和运动紊乱等。因此，环境中汞离子的定量检测 具有重要的研究价值和现实意义。

传统的检测汞离子检测的方法有原子吸收/发射光谱、色谱层析法、电 感耦合等离子体质谱、冷蒸汽原子荧光光谱、高效液相色谱法、阳极溶出 伏安法等，但这些方法大多依赖于大型设备，实验成本高，需要专业人员 操作，且样品的预处理过程繁琐，这些都制约了这些方法在实际检测中的 广泛应用。

近年来，基于功能化核酸进行检测的方法得到广泛的发展。核酸以其 高稳定性，生物相容性，易标记和修饰，成本低，应用广等优点在生物检 测和生化分析中发挥越来越重要的作用。AkiraOno等于2004年首次发现 并提出汞离子可与胸腺嘧啶碱基上第三个氮原子发生质子取代反应形成 稳定的T-Hg²⁺-T结构。该结构甚至可以取代核酸序列中原有的A-T碱基配 对结构，使核酸的二级结构发生重组。这种特殊的配位结构的发现在很大 程度上提高汞离子检测的灵敏度和特异性，对重金属检测作出突破性贡 献。目前已发展了多种基于该结构的核酸检测汞离子的方法，包括比色、 电化学、电化学发光、荧光光谱等检测方法。然而比色法虽然结果肉眼可 见但是灵敏度不够高，并且纳米金的合成与准备过程也较为繁琐。而电 化学法的灵敏度高但是操作复杂，时间较长，需要配备价格较为昂贵的电 化学相关仪器，同时，相关的荧光法由于没有进行放大虽然更加快速和简 便，但是比较难以获得令人满意的灵敏度和检测范围。

基于链置换扩增(Stranddisplacementamplification，SDA)技术利用 具有链置换活性的DNA聚合酶(KlenowFragment)与核酸切口酶 (Nt.BbvCI)识别并切割特定双链中单链的性质，能够在恒温条件下迅速 扩增出多条寡核苷酸单链。相比于传统扩增技术如PCR，SDA不仅具有 较高的扩增效率，而且不需要精确地热循环设备，已被越来越多地用于 DNA，microRNA，以及其它生物活性分子和金属离子检测信号的放大， 但是单纯的链置换扩增技术扩增效率及灵敏度有限。

发明内容

为了克服上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种基于 恒温级联核酸扩增的汞离子检测试剂盒及其检测方法，以克服现有技术灵 敏度不足、设计复杂、耗时长等缺点。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种基于恒温级联核酸扩增的汞离子检测试剂盒，包括含有胸腺嘧啶 可特异性结合汞离子的DNA识别元件、扩增底物、工具酶、带有茎环结 构的分子信标探针和扩增反应缓冲液；

所述的含有胸腺嘧啶可特异性结合汞离子的DNA识别元件：DNA的 3’端最后一个碱基为胸腺嘧啶，其核苷酸序列(5’到3’)：

TGAGGCTAGAGCGAGCTGAGGCTGTAATGGAAAAAACCATTT；

所述的扩增底物：包括dNTPs混合物；

所述的工具酶：具有链置换扩增活性的DNA聚合酶和核酸切口酶， DNA聚合酶为KlenowFragment，核酸切口酶为Nt.BbvCI；

所述的带有茎环结构的分子信标探针：其两端分别标记有荧光基团和 猝灭基团，分子信标探针具有能够与SDA产物相互补的序列，其核苷酸 序列(5’到3’)： FAM-CCACGAGTGTGCTGAGGCTAGAGCGTGG-DABCYL；

所述的扩增反应缓冲液：200mMNaNO₃，20mMTris-HAc和30mM Mg(Ac)₂的混合物，pH7.9。

基于恒温级联核酸扩增的汞离子检测试剂盒的检测方法，包括以下步 骤：

(1)将含有胸腺嘧啶的可特异性结合汞离子的DNA识别元件与待测 溶液按体积比2:1混合，DNA识别元件结合待测溶液中的汞离子之后可通 过分子内折叠形成3’端互补，形成可被聚合酶识别的茎环结构；

(2)将结合了汞离子之后的DNA识别元件与扩增底物、DNA聚合 酶、核酸切口酶、分子信标探针以及扩增反应缓冲液混合反应，反应温度 为37℃，时间为30-45min，混合物中各个组分浓度分别为：DNA识别元 件10-100nM、扩增底物40-500μM、DNA聚合酶0.08-0.24U、核酸切 口酶1-4U、分子信标探针100nM，扩增反应缓冲液为200mMNaNO₃， 20mMTris-HAc和30mMMg(Ac)₂混合物，DNA识别元件的3’端以自身 为模板起始扩增，扩增产物中的第一个核酸切口酶识别位点被识别并在扩 增链的相应位点发生切割，即可产生大量SDA产物，扩增所获得的SDA 产物触发打开分子信标的茎环结构，其荧光恢复；同时SDA产物可作为 引物沿着分子信标继续触发聚合反应，聚合产物与分子信标形成的双链互 补结构中还含有核酸切口酶识别位点，在形成双链结构后该位点被识别， 触发二次SDA扩增，而二次SDA产物可与新的分子信标形成杂交双链， 以产生更多的荧光信号；

(3)利用荧光分光光度计检测荧光信号，对荧光信号分析得到待测 溶液中汞离子的含量。

所述可特异性结合汞离子的DNA识别元件和分子信标区域中分别含 有Nt.BbvCI识别双链中不被切割的单链序列5’-GCTGAGG-3’，可以在 SDA生成双链的过程中被Nt.BbvCI识别，在聚合产物位点处切割实现 SDA，使得产生大量SDA产物。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

1.本发明提供的恒温级联核酸扩增的汞离子检测方法及试剂盒，设计 简单，无需增加体系复杂性即可实现高效、快速的酶协同级联恒温扩增反 应，反应快速，只需要30min，可以提高灵敏度到2nM；

2.本发明提供的基于恒温级联核酸扩增的汞离子检测方法及试剂盒 与传统的原子吸收/发射光谱、色谱层析法、电感耦合等离子体质谱、冷蒸 汽原子荧光光谱、高效液相色谱法、阳极溶出伏安法等方法相比，无需依 赖大型设备，实验成本低，且样品的预处理简单、需求量很少，可以实现 微量操作，采用的恒温反应，无需使用昂贵的热循环仪，体系设计更为简 单，应用范围更广泛。

附图说明

图1是本发明的反应流程原理示意图。

图2是本发明与现有技术的检测效果对比示意图。

图3是不同浓度的汞离子溶液的定量检测结果示意图，其中图3A是 荧光光谱图，图3B是线性图。

图4是各种金属离子对本发明汞离子检测方法的干扰示意图。

具提体实施方式

实施例一

本实施例的检测试剂盒，包括以下组分：

(1)含有胸腺嘧啶可特异性结合汞离子的DNA识别元件：DNA的3’ 端最后一个碱基为胸腺嘧啶，其核苷酸序列(5’到3’)：

TGAGGCTAGAGCGAGCTGAGGCTGTAATGGAAAAAACCATTT

其结合汞离子之后通过分子内折叠形成3’端互补，形成可被聚合酶识别 的茎环结构；

(2)扩增底物：包括dNTPs混合物；

(3)工具酶：具有链置换扩增活性的DNA聚合酶和核酸切口酶， DNA聚合酶为KlenowFragment，核酸切口酶为Nt.BbvCI；用于触发SDA 产生SDA产物；

(4)带有茎环结构的分子信标探针：其两端分别标记有荧光基团和 猝灭基团，分子信标探针具有能够与SDA产物相互补的序列，其核苷酸 序列(5’到3’)：

FAM-CCACGAGTGTGCTGAGGCTAGAGCGTGG-DABCYL；

(5)扩增反应缓冲液：200mMNaNO₃，20mMTris-HAc和30mM Mg(Ac)₂的混合物，pH7.9。

本实施例的检测方法，参照图1，包括以下步骤：

1)将含有胸腺嘧啶可特异性结合汞离子的DNA识别元件与待测溶液 混合按体积比2:1混合，DNA识别元件结合待测溶液中的汞离子之后可通 过分子内折叠形成3’端互补，形成可被聚合酶识别的茎环结构；

2)将结合了汞离子之后的DNA识别元件与扩增底物、DNA聚合酶、 核酸切口酶、分子信标探针以及扩增反应缓冲液混合反应，反应温度为 37℃，时间为30-45min，混合物中各个组分浓度分别为：DNA识别元件 10nM、扩增底物100μM、DNA聚合酶0.16U、核酸切口酶3U、分子 信标探针100nM，扩增反应缓冲液为200mMNaNO₃，20mMTris-HAc 和30mMMg(Ac)₂混合物。

DNA识别元件的3’端以自身为模板起始扩增，扩增产物中的第一个 核酸切口酶识别位点被识别并在扩增链的相应位点发生切割，即可产生大 量SDA产物，扩增所获得的SDA产物触发打开分子信标的茎环结构，其 荧光恢复；同时SDA产物可作为引物沿着分子信标继续触发聚合反应， 聚合产物与分子信标形成的双链互补结构中还含有核酸切口酶识别位点， 在形成双链结构后该位点被识别，触发二次SDA扩增，而二次SDA产物 可与新的分子信标形成杂交双链，以产生更多的荧光信号；

3)利用荧光分光光度计检测荧光信号，对荧光信号分析得到待测溶 液中汞离子的含量。

从图1可以看出：含有胸腺嘧啶可特异性结合汞离子的DNA识别元 件结合汞离子之后可通过分子内折叠形成3’端互补，可被聚合酶识别的茎 环结构；在聚合酶的作用下，DNA识别元件的3’端以自身为模板起始扩 增，待扩增至一定长度后，扩增产物中的第一个核酸切口酶识别位点被识 别并在扩增链的相应位点发生切割，即可产生大量SDA产物；扩增所获 得的SDA产物触发打开分子信标的茎环结构，其荧光恢复；同时SDA产 物可作为引物沿着分子信标继续触发聚合反应，聚合产物与分子信标形成 的双链互补结构中还含有核酸切口酶识别位点，在形成双链结构后该位点 被识别，触发二次SDA扩增，而二次SDA产物可与新的分子信标形成杂 交双链，以产生更多的荧光信号，实现级联的SDA放大；待达到规定的 反应时间后，检测荧光信号，对荧光信号分析得到待测溶液中汞离子的含 量，在一定范围内，汞离子浓度越高，则荧光信号越强。

参照图2，在汞离子识别元件SEQ.ID.NO.1的基础上，设计不参与第 二步级联SDA的一步SDA汞离子识别元件SEQ.ID.NO.3，5’- AAATGAGGCTAGAGCGAGCTGAGGCTGTAATGGAAAAAACCATTT-3’ ，SDA的产物可以与分子信标杂交，但是SDA产物3’端无法与分子信标 形成稳定的双链结构，不能被聚合酶识别，从而阻断了第二步级联SDA 的信号放大过程，结果如图2所示，通过级联SDA方法的信号与背景比 为7.2倍，一步SDA的信号仅为背景的2.2倍，说明本方法确实发生了级 联的信号放大。

其他实施例

其余实施例反应条件与实施例一相同，不同在于选用不同浓度的汞离 子待测溶液，浓度分别为：2nM，5nM，10nM，15nM，20nM，30nM， 40nM，60nM。

参照图3，图3为基于恒温级联核酸扩增的汞离子检测方法的对于不同 浓度的汞离子溶液的荧光响应，随着汞离子浓度增加，打开的分子信标增 多，荧光信号强度逐渐增加，该方法最低可检测到汞离子的浓度为2nM， 线性检测范围为2nM-30nM。

参照图4，为基于恒温级联核酸扩增的汞离子检测方法的对于不同金属 离子溶液的荧光响应，考察了40nM汞离子与2uM其他不同金属离子溶 液的荧光响应，说明本方法具有很好的选择性，对汞离子灵敏度高，至于 其他金属离子对其不会产生干扰。