降解酚类内分泌干扰物的复合微生物制剂及制备方法

摘要

本发明涉及一种降解酚类内分泌干扰物的复合微生物制剂及制备方法，涉及微生物工程和污废水处理工艺，包括克雷伯氏菌(Klebsiella？sp.)、生脂固氮螺菌(Azospirillum？lipoferum)、红串红球菌(Rhodococcus？erythropolis)和地衣芽孢杆菌(Bacillus？licheniformis)；所述克雷伯氏菌的菌数占总菌数的百分比30％～50％，所述生脂固氮螺菌的菌数占总菌数的百分比30％～50％，所述红串红球菌的菌数占总菌数的百分比10％～30％，所述地衣芽孢杆菌的菌数占总菌数的百分比10％～30％。本发明通过将复合微生物菌剂投加到厌氧池和好氧池中，强化污废水处理工艺。该复合微生物菌群能耐受高浓度酚类内分泌干扰物，以其作为生长所需有机物进行充分利用和降解，优化了污废水处理工艺，降低出水及污泥的二次污染，提高污泥填埋和农用的安全性。

说明书

技术领域

本发明涉及一种降解酚类内分泌干扰物的复合微生物制剂及制 备方法，涉及微生物工程和污废水处理工艺，属于环境保护领域。

背景技术

内分泌干扰物(EndocrineDisruptingChemicals，即EDCs)， 也称为环境激素(EnvironmentalHormone)，是一种外源性干扰内分 泌系统的化学物质，指环境中存在的能干扰人类或动物内分泌系统诸 环节并导致异常效应的物质，它们通过摄入、积累等各种途径，并不 直接作为有毒物质给生物体带来异常影响，而是类似雌激素对生物体 起作用，即使数量极少，也能让生物体的内分泌失衡，出现种种异常 现象。这类物质会导致动物体和人体生殖器障碍、行为异常、生殖能 力下降、幼体死亡、甚至灭绝。

环境中的酚类内分泌干扰物不是天然存在的，而是由于人为因素 造成的。例如壬基酚(NP)、辛基酚(OP)及十二烷基酚(DP)等烷 基酚(AP)，主要来源于多种非离子表面活性剂和烷基酚聚氧乙烯醚 (APEO)的工业生产及使用过程；双酚A(BPA)主要来源于聚碳酸 酯和环氧树脂的工业生产及使用过程。生活污水及相关工业废水的排 放伴随着大量酚类内分泌干扰物的释放，壬基酚(NP)、壬基酚聚氧 乙烯醚(NPEO)、辛基酚(OP)、辛基酚聚氧乙烯醚(OPEO)、十二烷 基酚(DP)、双酚A(BPA)等这6种化合物占污废水中酚类内分泌干 扰物总量的98％以上，同时大多数酚类内分泌干扰物具有很强的亲脂 憎水性和难降解性，极易吸附到固体沉积物和污泥颗粒物上。

目前污废水处理工艺中活性污泥法应用最为广泛，但其中的酚类 内分泌干扰物几乎没有得到降解，少部分以ug/L级残存在水体中， 大部分以吸附和沉降方式被转移到剩余污泥中。而污水处理厂产生的 剩余污泥的处置方式以填埋和农用为主，这就导致大量酚类内分泌干 扰物随污泥进入环境。土壤中和水体中的酚类内分泌干扰物可通过多 种途径在人和动物体内蓄积，易造成内分泌紊乱、性功能障碍等危害； 若其在动物体内含量过高，可直接导致动物的死亡，因此污废水中酚 类内分泌干扰物的降解受到广泛关注。

针对降解酚类内分泌干扰物，现有的研究多采用光催化法，但光 催化效率低、人造紫外光能耗大，且光催化剂(TiO₂或BiOX)不易制 得，不具有经济性。

酚类内分泌干扰物生物处理方法鲜有报道，且实际应用效果不乐 观。例如中国发明专利，申请号201210539590.6《一种利用漆酶降 解辛基酚的方法》公开了一种利用漆酶降解辛基酚的方法，但存在酶 制剂价格昂贵、酶反应条件苛刻、酶反应底物单一等缺陷，应用性差。 中国发明专利，申请号200910019223.1《一株高效降解多种酚类化 合物的假单胞菌XQ23》公开了一株能降解酚类化合物的假单胞菌， 但由于单一菌株酶系单一，不能使酚类化合物完全降解，不能用于产 业推广。中国发明专利，专利号为201210057537.2《一种微生物菌 剂在含酚废水生物处理中的应用》，公开了一种微生物菌剂用于含酚 工业废水处理的应用方法，但其菌剂驯化时间久，并忽略了污泥二次 污染的安全性检测。

发明内容

为克服现有技术的不足之处，本发明针对多种酚类内分泌干扰物， 提供一种高效专一的降解微生物复合制剂，经复配形成共生协作体系， 强化污废水处理工艺，能有效去除包括NP、NPEO、OP、OPEO、DP、 BPA等酚类内分泌干扰物，本发明的另一目的是提供该微生物复合制 剂的制备方法及应用。

本发明所采用的技术方案是：降解酚类内分泌干扰物的复合微生 物制剂，包括克雷伯氏菌(Klebsiellasp.)、生脂固氮螺菌 (Azospirillumlipoferum)、红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)和地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)；以复 合微生物制剂所含总菌数计算，所述克雷伯氏菌的菌数占总菌数的百 分比为30％～50％，所述生脂固氮螺菌的菌数占总菌数的百分比为30％ ～50％，所述的红串红球菌的菌数占总菌数的百分比为10％～30％，所 述地衣芽孢杆菌的菌数占总菌数的百分比为10％～30％；所述克雷伯 氏菌是克雷伯氏菌ACCC11779、ACCC11692、ACCC11624中的一种；所 述生脂固氮螺菌是生脂固氮螺菌ACCC10481；所述红串红球菌是红串 红球菌ACCC40323、ACCC10214中的一种；所述地衣芽孢杆菌是地衣 芽孢杆菌ACCC02698、ACCC19372、CGMCC1.10314、CGMCC1.521中的 一种。

进一步的，所述的降解酚类内分泌干扰物的复合微生物制剂中， 微生物的总菌数大于等于4.5×10⁹cfu/mL。

研究表明，克雷伯氏菌(Klebsiellasp.)有丰富的酶系，代谢 功能多样，对长链烷基酚降解效果明显。此外，其还能降解如菊酯类、 糠醛类、酚类、醚类、硝基苯类化合物等多种有毒有机物。

生脂固氮螺菌(Azospirillumlipoferum)能产生漆酶，能催化 芳香胺和酚类等多种芳香化合物的氧化，对BPA有高效降解能力。

红串红球菌(Rhodococcuserythropolis)对多种有机溶剂有较 强的耐受性，产环羟化双加氧酶、脱硫酶、醇脱氢酶，能高效降解多 环芳烃，净化水体。

地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)抗逆性强，含有丰富 的纤维素酶、脂肪酶和淀粉酶能协同上述三种微生物有效降解污废水 中的有机物。

一种制备所述降解酚类内分泌干扰物的复合微生物制剂的方法， 其工艺流程是：种子液制备→混合发酵→保护剂的制备与添加→产品 质量检验与分装，详细实施步骤如下：

第一步：种子液制备

将克雷伯氏菌(Klebsiellasp.)ACCC11779、ACCC11692、ACCC 11624中的一种、生脂固氮螺菌(Azospirillumlipoferum)ACCC 10481、红串红球菌(Rhodococcuserythropolis)ACCC40323、ACCC 10214中的一种、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)ACCC02698、 ACCC19372、CGMCC1.10314、CGMCC1.521中的一种，经斜面活化后， 分别接种于含牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中，摇瓶培养，培养 条件为装液量35％～45％，温度30～37℃，摇床转速110～160rpm， 培养时间12～36h；

将上述培养好的摇瓶种子液分别接入种子罐进行发酵，接种量为 5％～10％，培养条件为：通气量1:1～1.5v/v/min，温度30～37℃， 搅拌速度110～160rpm，发酵时间12～36h，制得的发酵种子液活菌 数大于等于4.5×10⁹cfu/mL；

第二步：混合发酵

将上述制得的发酵种子液按照重量百分比配制混合种子液，配制 比例为：克雷伯氏菌种子液占混合种子液重量百分比为30％～50％， 生脂固氮螺菌种子液占混合种子液重量百分比为30％～50％，红串红 球菌10％～30％种子液占混合种子液重量百分比为，地衣芽孢杆菌种 子液占混合种子液重量百分比为10％～30％；

发酵罐中加入液体发酵基质，115℃灭菌30min，待发酵罐温度 降至40℃以下，将上述混合种子液按液体发酵基质重量百分比5％～ 10％加入；控制发酵罐中培养通气量为1︰1～1.5v/v/min，温度30 ～37℃，搅拌速度110～160rpm，培养时间为12～36h；制得的复合 菌剂活菌总数大于等于4.5×10⁹cfu/mL；

第三步：保护剂的制备与添加

保护剂配方：脱脂奶粉1.0～1.5％，地瓜淀粉2.0～2.5％，甘油 2.0～2.5％，蒸馏水100mL，百分比为质量体积比；脱脂奶粉用紫外 灯照射45min，其他成分混合后用115℃高压蒸汽灭菌30min，再在 无菌环境下混合；

保护剂添加：灭菌好的保护剂按上述复合菌剂的重量百分比2％～ 5％添加至复合菌剂中，搅拌均匀。

第四步：产品质量检验与分装

经检验产品中活菌数大于等于4.5×10⁹cfu/mL，合格产品用塑料 桶分装。

所述混合发酵培养基以质量体积百分比计算，其配方为：玉米淀 粉5％～10％，豆粕粉15％～20％，酵母膏0.1％～0.2％，磷酸氢二钾 0.2％～0.4％，磷酸二氢钠0.3％～0.6％，硫酸镁0.005％～0.01％， 水100mL。

本发明所述的降解酚类内分泌干扰物的复合微生物制剂，其应用 方法如下：

将本发明所述复合微生物制剂分别投入厌氧池和好氧池中，首次 投加量为处理装置有效容积的0.2％～0.5％，即时输入含酚类内分泌 干扰物的生活污水或工业废水；所述厌氧池的水力停留时间2～12h， PH5.0～9.0，水温18～40℃；所述好氧池的水力停留时间5～50h， PH5.0～9.0，水温18～40℃，气水比10～20:1，出口处的溶解氧2mg/L； 控制系统固体停留时间为6～72h；好氧处理后的废水经所述沉淀池 沉淀后连续排出，由所述厌氧池和沉淀池收集的剩余污泥经浓缩后排 出。

发明原理：

本发明涉及一种降解生活污水及相关工业废水中酚类内分泌干 扰物的复合微生物制剂，其含有克雷伯氏菌(Klebsiellasp.)、生 脂固氮螺菌(Azospirillumlipoferum)、红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)和地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)。所述 的微生物制剂具有能断裂长链烷基、氧化多环芳烃的丰富酶系，能使 壬基酚(NP)、壬基酚聚氧乙烯醚(NPEO)、辛基酚(OP)、辛基酚聚 氧乙烯醚(OPEO)、十二烷基酚(DP)及双酚A(BPA)降解成有机酸 和醇类，并最终完全降解成水和二氧化碳。所述的降解酚类内分泌干 扰物的复合微生物菌群之间具有协同作用，能高效降解污废水中的多 种酚类内分泌干扰物，优化污废水处理工艺，保障污泥填埋及农用的 安全性。

有益效果：本发明通过将复合微生物菌剂投加到厌氧池和好氧池 中，强化污废水处理工艺。该复合微生物菌群能耐受高浓度酚类内分 泌干扰物，以其作为生长所需有机物进行充分利用和降解，优化了污 废水处理工艺，降低出水及污泥的二次污染，提高污泥填埋和农用的 安全性，本发明的制备及应用方法具有效果明显、易操作、成本低的 特点，适于产业化推广应用。

附图说明

下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。

图1为本发明复合微生物制剂用于降解十二烷基酚(DP)的过程 中不同碳链长度的烷基酚(AnP)含量变化图。

图2为本发明的污废水处理工艺流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合 附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描 述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“纵向”、“横向”、 “上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水 平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为 基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明，而不是 指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构 造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

本发明所述的降解酚类内分泌干扰物的复合微生物制剂，包括克 雷伯氏菌(Klebsiellasp.)、生脂固氮螺菌(Azospirillum lipoferum)、红串红球菌(Rhodococcuserythropolis)和地衣芽孢 杆菌(Bacilluslicheniformis)；所述克雷伯氏菌的菌数占总菌数 的百分比30％～50％，所述菌生脂固氮螺菌的菌数占总菌数的百分比 30％～50％，所述红串红球菌的菌数占总菌数的百分比10％～30％，所 述地衣芽孢杆菌的菌数占总菌数的百分比10％～30％；所述克雷伯氏 菌是克雷伯氏菌ACCC11779、ACCC11692、ACCC11624中的一种；所述 生脂固氮螺菌是生脂固氮螺菌ACCC10481；所述红串红球菌是红串红 球菌ACCC40323、ACCC10214中的一种；所述地衣芽孢杆菌是地衣芽 孢杆菌ACCC02698、ACCC19372、CGMCC1.10314、CGMCC1.521中的一 种。

进一步的，所述的降解酚类内分泌干扰物的复合微生物制剂中， 微生物的总菌数大于等于4.5×10⁹cfu/mL。

本发明所述的降解酚类内分泌干扰物的微生物制剂制备工艺流 程：种子液制备→混合发酵→保护剂的制备与添加→产品质量检验与 分装。其步骤为：

第一步：种子液制备

将克雷伯氏菌(Klebsiellasp.)ACCC11779、ACCC11692、ACCC 11624中的一种、生脂固氮螺菌(Azospirillumlipoferum)ACCC 10481、红串红球菌(Rhodococcuserythropolis)ACCC40323、ACCC 10214中的一种和地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)ACCC 02698、ACCC19372、CGMCC1.10314、CGMCC1.521中的一种(均是 公开保藏过的菌株)，经斜面活化后，分别接种于含牛肉膏蛋白胨液 体培养基的三角瓶中，摇瓶培养。培养条件为装液量35％～45％，温 度30～37℃，摇床转速110～160rpm，培养时间12～36h。

将上述培养好的摇瓶种子液分别接入种子罐进行发酵，接种量为 5％～10％，培养条件为：通气量1:1～1.5v/v/min，温度30～37℃， 搅拌速度110～160rpm，发酵时间12～36h。制得的发酵种子液活菌 数大于等于4.5×10⁹cfu/mL。

第二步：混合发酵

将上述制得的发酵种子液按照重量百分比配制混合种子液，配制 比例为：克雷伯氏菌种子液占混合种子液重量百分比为30％～50％， 生脂固氮螺菌种子液占混合种子液重量百分比为30％～50％，红串红 球菌10％～30％种子液占混合种子液重量百分比为，地衣芽孢杆菌种 子液占混合种子液重量百分比为10％～30％；

发酵罐中加入液体发酵基质，115℃灭菌30min，待发酵罐温度 降至40℃以下，将上述混合种子液按液体发酵基质重量百分比5％～ 10％(加入；控制发酵罐中培养通气量为1︰1～1.5v/v/min，温度30 ～37℃，搅拌速度110～160rpm，培养时间为12～36h。制得的复合 菌剂活菌总数大于等于4.5×10⁹cfu/mL。

液体发酵基质配方为：玉米淀粉5％～10％，豆粕粉15％～20％， 酵母膏0.1％～0.2％，磷酸氢二钾0.2％～0.4％，磷酸二氢钠0.3％～ 0.6％，硫酸镁0.005％～0.01％，水100mL，百分比为质量体积比。

第三步：保护剂的制备与添加

保护剂配方：脱脂奶粉1.0～1.5％，地瓜淀粉2.0～2.5％，甘油 2.0～2.5％，蒸馏水100mL，百分比为质量体积比；脱脂奶粉用紫外 灯照射45min，其他成分混合后用115℃高压蒸汽灭菌30min，再在 无菌环境下混合。

保护剂添加：灭菌好的保护剂按上述复合菌剂的重量百分比2％～ 5％添加至复合菌剂中，搅拌均匀。

第四步：产品质量检验与分装

经检验产品中活菌数大于等于4.5×10⁹cfu/mL，合格产品用塑料 桶分装。

本发明所述降解酚类内分泌干扰物的复合微生物制剂的应用，根 据图2构建的一套中试污水处理系统模型为例，步骤如下：

将本发明所述复合微生物制剂分别投入厌氧池和好氧池中，首次 投加量为处理装置有效容积的0.2％～0.5％。即时输入含酚类内分泌 干扰物的生活污水或工业废水。控制厌氧池参数：水力停留时间(HRT) 2～12h，PH5.0～9.0，水温18～40℃；控制好氧池参数：水力停留 时间(HRT)5～50h，PH5.0～9.0，水温18～40℃，气水比10～20:1， 出口处的溶解氧2mg/L；控制系统固体停留时间(OSRT)为6～72h。 好氧处理后的废水经沉淀池沉淀后连续排出。由厌氧池和沉淀池收集 的剩余污泥经浓缩后排出。

本发明涉及的NP、NPEOs、OP、OPEOs、DP、BPA的检测方法采用 固相萃取―气象色谱(SPE―GC)连用方法。

本发明中，所述的克雷伯氏菌、生脂固氮螺菌、红串红球菌和地 衣芽孢杆菌都是现有的常规菌种，比如可以从中国普通微生物菌种保 藏管理中心(CGMCC)或在http://www.cgmcc.net查询到；以及中国农 业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)购买得到,或在 http://www.accc.org.cn查询到。

实施例1：降解酚类内分泌干扰物复合微生物制剂制备

本发明所述的降解酚类内分泌干扰物的微生物制剂制备方法，详 细实施步骤为：

第一步：种子液制备

将克雷伯氏菌(Klebsiellasp.)ACCC11779、ACCC11692、ACCC 11624中的一种、生脂固氮螺菌(Azospirillumlipoferum)ACCC 10481、红串红球菌(Rhodococcuserythropolis)ACCC40323、ACCC 10214中的一种和地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)ACCC 02698、ACCC19372、CGMCC1.10314、CGMCC1.521中的一种(均是 公开保藏过的菌株)，经斜面活化后，分别接种于含牛肉膏蛋白胨液 体培养基的三角瓶中培养制备摇瓶种子液。摇瓶培养条件为：装液量 40％，温度33℃，摇床转速为140rpm，培养时间12h；

将上述培养好的摇瓶种子液分别接入种子罐进行发酵，接种量为 8％，培养条件为：通气量1:1.5v/v/min，温度34℃，搅拌速度130rpm， 发酵时间24h。制得的发酵种子液活菌数大于等于4.5×10⁹cfu/mL。

第二步：混合发酵

将上述制得的发酵种子液按照重量百分比配制混合种子液，配制 比例为：克雷伯氏菌种子液占混合种子液重量百分比为35％，生脂固 氮螺菌种子液占混合种子液重量百分比为35％，红串红球菌15％种子 液占混合种子液重量百分比为，地衣芽孢杆菌种子液占混合种子液重 量百分比为15％；

发酵罐中加入液体发酵基质，115℃灭菌30min，待发酵罐温度 降至40℃以下，将上述混合种子液按液体发酵基质重量百分比8％加 入；发酵罐中培养通气量为1:1.5v/v/min，温度34℃，搅拌速度 130rpm，培养时间为24h。制得的复合菌剂活菌总数大于等于 4.5×10⁹cfu/mL。

所述的液体发酵基质配方为：玉米淀粉10％，豆粕粉15％，酵母 膏0.2％，磷酸氢二钾0.3％，磷酸二氢钠0.5％，硫酸镁0.006％， 水100mL，百分比为质量体积比。

第三步：保护剂的制备与添加

保护剂配方：脱脂奶粉1.2％，地瓜淀粉2.4％，甘油2.4％，蒸馏 水100mL，百分比为质量体积比；脱脂奶粉用紫外灯照射45min，其 他成分混合后用115℃高压蒸汽灭菌30min，再在无菌环境下混合。

保护剂添加：灭菌好的保护剂按上述复合菌剂的重量百分比4％ 添加至复合菌剂中，搅拌均匀。

第四步：产品质量检验与分装

经检验产品中活菌数大于等于4.5×10⁹cfu/mL，合格产品用塑料 桶分装。

实施例2降解酚类内分泌干扰物复合微生物制剂制备

详细步骤为：

第一步：种子液制备

将克雷伯氏菌(Klebsiellasp.)ACCC11779、ACCC11692、ACCC 11624中的一种、生脂固氮螺菌(Azospirillumlipoferum)ACCC 10481、红串红球菌(Rhodococcuserythropolis)ACCC40323、ACCC 10214中的一种和地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)ACCC 02698、ACCC19372、CGMCC1.10314、CGMCC1.521中的一种(均是 公开保藏过的菌株)，经斜面活化后，分别接种于含牛肉膏蛋白胨液 体培养基的三角瓶中，摇瓶培养。摇瓶培养条件为：装液量38％，温 度35℃，摇床转速为120rpm，培养时间18h；

将上述培养好的摇瓶种子液分别接入种子罐进行发酵，接种量为 10％，培养条件为：通气量1:1.2v/v/min，温度36℃，搅拌速度150rpm， 发酵时间30h。制得的发酵种子液活菌数大于等于4.5×10⁹cfu/mL。

第二步：混合发酵

将上述制得的发酵种子液按照重量百分比配制混合种子液，配制 比例为：克雷伯氏菌种子液占混合种子液重量百分比为40％，生脂固 氮螺菌种子液占混合种子液重量百分比为30％，红串红球菌20％种子 液占混合种子液重量百分比为，地衣芽孢杆菌种子液占混合种子液重 量百分比为10％。

发酵罐中加入液体发酵基质，115℃灭菌30min，待发酵罐温度 降至40℃以下，将上述混合种子液按液体发酵基质重量百分比6％加 入；发酵罐中培养通气量为1:1.2v/v/min，温度36℃，搅拌速度 140rpm，培养时间为30h。制得的复合菌剂活菌总数大于等于 4.5×10⁹cfu/mL。

所述的液体发酵基质配方为：玉米淀粉5％，豆粕粉13％，酵母膏 0.15％，磷酸氢二钾0.4％，磷酸二氢钠0.3％，硫酸镁0.008％， 水100mL，百分比为质量体积比。

第三步：保护剂的制备与添加

保护剂配方：脱脂奶粉1.0％，地瓜淀粉2.5％，甘油2.2％，蒸馏 水100mL，百分比为质量体积比；脱脂奶粉用紫外灯照射45min，其 他成分混合后用115℃高压蒸汽灭菌30min，再在无菌环境下混合。

保护剂添加：灭菌好的保护剂按上述复合菌剂的重量百分比3％ 添加至复合菌剂中，搅拌均匀。

第四步：产品质量检验与分装

经检验产品中活菌数大于等于4.5×10⁹cfu/mL，合格产品用塑料 桶分装。

实施例3降解酚类内分泌干扰物复合微生物制剂制备

本发明所述的降解酚类内分泌干扰物的微生物制剂制备工艺流 程：种子液制备→混合发酵→保护剂的制备与添加→产品质量检验与 分装。其中详细实施步骤为：

第一步：种子液制备

将克雷伯氏菌(Klebsiellasp.)ACCC11779、ACCC11692、ACCC 11624中的一种、生脂固氮螺菌(Azospirillumlipoferum)ACCC 10481、红串红球菌(Rhodococcuserythropolis)ACCC40323、ACCC 10214中的一种和地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)ACCC 02698、ACCC19372、CGMCC1.10314、CGMCC1.521中的一种(均是 公开保藏过的菌株)，经斜面活化后，分别接种于含牛肉膏蛋白胨液 体培养基的三角瓶中，摇瓶培养。摇瓶培养条件为：装液量42％，温 度36℃，摇床转速为130rpm，培养时间12h；

将上述培养好的摇瓶种子液分别接入种子罐进行发酵，接种量为 6％，培养条件为：通气量1:1.0v/v/min，温度35℃，搅拌速度140rpm， 发酵时间36h。制得的发酵种子液活菌数大于等于4.5×10⁹cfu/mL。

第二步：混合发酵

将上述制得的发酵种子液按照重量百分比配制混合种子液，配制 比例为：克雷伯氏菌种子液占混合种子液重量百分比为30％，生脂固 氮螺菌种子液占混合种子液重量百分比为40％，红串红球菌种子液占 混合种子液重量百分比为12％，地衣芽孢杆菌种子液占混合种子液重 量百分比为18％。

发酵罐中加入液体发酵基质，115℃灭菌30min，待发酵罐温度 降至40℃以下，将上述混合种子液按液体发酵基质重量百分比10％ 加入。发酵罐中培养通气量为1:1.5v/v/min，温度30℃，搅拌速度 160rpm，培养时间为24h。制得的复合菌剂活菌总数大于等于 4.5×10⁹cfu/mL。

所述的液体发酵基质配方为：玉米淀粉6％，豆粕粉20％，酵母膏 0.16％，磷酸氢二钾0.25％，磷酸二氢钠0.55％，硫酸镁0.009％， 水100mL，百分比为质量体积比。

第三步：保护剂的制备与添加

保护剂配方：脱脂奶粉1.5％，地瓜淀粉2.0％，甘油2.0％，蒸馏 水100mL，百分比为质量体积比；脱脂奶粉用紫外灯照射45min，其 他成分混合后用115℃高压蒸汽灭菌30min，再在无菌环境下混合。

保护剂添加：灭菌好的保护剂按上述复合菌剂的重量百分比2％ 添加至复合菌剂中，搅拌均匀。

第四步：产品质量检验与分装

经检验产品中活菌数大于等于4.5×10⁹cfu/mL，合格产品用塑料 桶分装。

效果实例1：复合微生物制剂用于降解十二烷基酚(DP)的研究

取100mL含DP(500mg/L)的基础培养基装入250mL三角瓶，121℃， 20min灭菌，按0.5％接种量接入本发明实施例1所述复合微生物制剂， 将三角瓶放入恒温摇床，摇床条件设为30℃，160rpm，每1d取样， 采用固相萃取―气象色谱(SPE―GC)连用方法对DP降解过程中碳链 长度分别为12、8、4、2的同系物(AnP)进行定性和定量检测。如 图1所示，在DP降解的过程中，不但其浓度(c)在发生变化，也会 产生碳链长度为8、4、2的同系物(AnP)，随着培养时间的延长，链 长分布峰值从12逐渐降到2，总浓度(c_Total)从初始值500.00mg/L 到第6天降低为61.40mg/L，降解率为87.72％。

效果实例2：复合微生物制剂用于合肥市某生活污水集中处理厂 污水中试试验

采集合肥市3月份某生活污水集中处理厂沉砂池出口处的生活 污水，根据图2构建一套中试污水处理系统模型，应用方法如下：

将本发明实施例1所述复合微生物制剂分别投入厌氧池和好氧 池中，首次投加量为处理装置有效容积的0.2％，对照组用取自该污 水处理厂的回流污泥等量替代，即时连续输入污水。控制厌氧池参数： 水力停留时间(HRT)3h，PH7.0，水温20℃；控制好氧池参数：水 力停留时间(HRT)6h，PH7.0，水温20℃，气水比15:1，出口处的 溶解氧2mg/L；系统固体停留时间(OSRT)控制为12h。好氧处理后 的污水经沉淀池沉淀后连续排出。由厌氧池和沉淀池收集的剩余污泥 经浓缩、脱水后排出。装置连续稳定运行5天，采集第2、3、4天的 出水和浓缩污泥，固相萃取―气象色谱(SPE―GC)连用法测定NP、 NPEOs、OP、OPEOs、DP、BPA的浓度水平。如表1所示，本发明所述 复合微生物制剂对酚类内分泌干扰物的降解效果显著，出水总酚类内 分泌干扰物的浓度为1.18μg/L，比对照组降低96.31％，浓缩污泥总 酚类内分泌干扰物的浓度为2.49mg/kg，比对照组降低91.10％。

表1合肥市某生活污水集中处理厂污水复合微生物制剂中试试验结果对照 表

*LOD表示仪器检出限

效果实例3：复合微生物制剂用于某市经济技术开发区污废水集 中处理厂污废水处理。

采集某市经济技术开发区3月份污废水集中处理厂格栅池。该污 水处理厂汇集来自该经济技术开发区的居民生活污水及包括制药工 业、日化工业、润滑油工业等的工业废水。根据图2构建一套中试污 水处理系统模型，其应用方法如下：

将本发明实施例2所述复合微生物制剂分别投入厌氧池和好氧 池中，首次投加量为处理装置有效容积的0.4％，对照组用取自该污 水处理厂的回流污泥等量替代，及时连续输入污废水。控制厌氧池参 数：水力停留时间(HRT)5h，PH7.0，水温24℃；控制好氧池参数： 水力停留时间(HRT)12h，PH7.0，水温24℃，气水比18:1，出口处 的溶解氧2mg/L；系统固体停留时间(OSRT)控制为24h。好氧处理 后的污水经沉淀池沉淀后连续排出。由厌氧池和沉淀池收集的剩余污 泥经浓缩、脱水后排出。装置连续稳定运行7天，采集第2、4、6天 的出水和浓缩污泥，固相萃取―气象色谱(SPE―GC)连用法测定NP、 NPEOs、OP、OPEOs、DP、BPA的浓度水平。如表2所示，本发明所述 复合微生物制剂对酚类内分泌干扰物的降解效果显著，出水总酚类内 分泌干扰物的浓度为2.63μg/L，比对照组降低92.99％，浓缩污泥总 酚类内分泌干扰物的浓度为3.18mg/kg，比对照组降低92.65％。

表2某市经济技术开发区污废水集中处理厂污废水复合微生物制剂处理结果对照表

*LOD表示仪器检出限

效果实例4：复合微生物制剂用于某市第一污水处理厂污废水处 理

采集某市11月份第一污水处理厂格栅池，该污水处理厂汇集污 废水包括该市城市居民生活污水、一个纺织染织工厂和一个石油化工 厂，根据图2构建一套中试污水处理系统模型，其应用方法如下：

将本发明实施例3所述复合微生物制剂分别投入厌氧池和好氧 池中，首次投加量为处理装置有效容积的0.5％，对照组用取自该污 水处理厂的回流污泥等量替代，及时连续输入污废水。控制厌氧池参 数：水力停留时间(HRT)6h，PH7.5，水温28℃；控制好氧池参数： 水力停留时间(HRT)36h，PH7.5，水温28℃，气水比20:1，出口处 的溶解氧2mg/L；系统固体停留时间(OSRT)控制为48h。好氧处理 后的污水经沉淀池沉淀后连续排出。由厌氧池和沉淀池收集的剩余污 泥经浓缩、脱水后排出。装置连续稳定运行10天，采集第3、6、9 天的出水和浓缩污泥，固相萃取―气象色谱(SPE―GC)连用法测定 NP、NPEOs、OP、OPEOs、DP、BPA的浓度水平。如表3所示，本发明 所述复合微生物制剂对酚类内分泌干扰物的降解效果显著，出水总酚 类内分泌干扰物的浓度为20.88μg/L，比对照组降低89％，浓缩污泥 总酚类内分泌干扰物的浓度为22.83mg/kg，比对照组降低90％。

表3复合微生物制剂用于某市第一污水处理厂污废水处理结果对照表

*LOD表示仪器检出限

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术 人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这 些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权 利要求及其等同物限定。