一种杂交构树盐胁迫相关的转录因子及其编码基因与应用

摘要

本发明公开了一种杂交构树盐胁迫相关的转录因子及其编码基因与应用。本发明所提供的杂交构树盐胁迫相关的转录因子为如下a)或b)或c)的蛋白质：a)氨基酸序列是序列表中序列1所示的蛋白质；b)在序列表中序列1所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。实验证明，利用本发明提供的转录因子及其编码基因可以提高植物的抗逆性，对植物应对逆境胁迫的分子育种具有重要价值。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种杂交构树盐胁迫相关的转录因子及其编 码基因与应用。

背景技术

土壤盐碱化已成为影响农业生产的严重问题，利用基因工程手段改良作物的耐盐 碱能力，提高农作物和经济作物对逆境的适应能力是新品种培育亟需解决的关键问题 和重大问题。近年来，人们从生理、生化、代谢、生态、以及遗传、进化等角度对植 物响应盐碱等逆境胁迫的机制进行了大量研究，积累了丰富的资料，特别是随着分子 生物学的发展，人们能够在基因组成、表达调控及信号传导等分子水平上认识植物对 盐胁迫的耐逆性机理，为利用基因工程手段改良植物的抗胁迫性能开拓了新的途径。 由于植物抗逆性状的复杂性，采用传统的育种方法提高植物的抗逆性十分困难，随着 分子生物学的发展，基因工程手段开辟了植物抗逆育种的新途径，但高效抗逆基因的 分离成为限制植物抗逆基因工程的主要因素。

转录因子(transcriptionfactor)是指能够与真核基因启动子区域中顺式作用 元件发生特异性相互作用，协助RNA聚合酶II与之结合，调节RNA合成速率的蛋白。 它们控制真核生物正常发育和生理功能基因的协同表达。植物发育是十分复杂的过程。 DNA与蛋白质在这个过程中发挥着主要的作用，通过它们之间的相互作用来实现对基 因表达的调控。蛋白质实现了生物的多样性，因此发育调控的复杂性也必定与蛋白质 的结构和功能的多样性密不可分。转录调控是真核生物基因表达调控的重要机制。真 核生物的生长发育、逆境反应及信号转导都是由于基因调控而有序表达的结果，而基 因表达的此种时空特异性，主要是由于转录因子通过与基因启动子和增强子内的DNA 顺式元件相互作用来修饰改变靶基因存在的染色质结构，以及通过转录因子之间及其 转录产物之间的直接和间接作用来调节靶基因的转录和表达。因此，转录因子在植物 逆境信号传递过程中起着中心调节的作用，转录因子也逐渐成为植物抗逆机理研究的 核心内容。植物的抗逆性状是多基因控制的数量性状。植物的抗逆性(即植物对干旱、 高盐、低温及病虫害的耐受性)不是由一个基因控制的，其性状受许多基因和环境的 影响。转录因子可以调控多个与抗逆性状相关的基因的表达，通过增强一些关键调节 因子的作用来促进这些抗逆基因发挥相应的作用，使植物的抗逆性得到改善。在提高 植物应对逆境胁迫的分子育种中，与导入或改良个别功能基因来提高某种抗性的方法 相比，敲除或增强一个关键的转录因子的调控能力，是提高植物抗逆性的有效方法和 途径。

杂交构树(Broussonetiakazinoki×B.papyrifera)是中国科学院植物研究所利 用小构树(B.kazinoki)与构树(B.papyrifera)杂交后经多代选育出的新品种。杂交 构树是绿化、用材与饲料兼用的具有突出抗逆性的复合型多功能树种，是集造林、造 纸、治沙、饲料、生态保护于一体的速生树种。具有生长速度快、丰产性强、耐砍伐、 适应性强和开发利用机制达等特点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提高植物的抗逆性。

为解决上述问题，本发明首先提供了一种的转录因子。

本发明所提供的转录因子，名称为BpSOX10，来源于杂交构树(Broussonetia kazinoki×B.papyrifera)，为如下a)或b)或c)的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列表中序列1所示的蛋白质；

b)在序列表中序列1所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

c)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

其中序列表中的序列1可由259个氨基酸组成。

为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表序列1所示的蛋白质的氨基末 端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1、标签的序列

标签 残基 序列 Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH FLAG 8 DYKDDDDK Strep-tag II 8 WSHPQFEK c-myc 10 EQKLISEEDL

上述c)中的蛋白质BpSOX10，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/ 或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述c)中的蛋白质BpSOX10可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物 表达得到。

上述c)中的蛋白质BpSOX10的编码基因可通过将序列表序列2的第201-980位 所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对 的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

与所述BpSOX10相关的生物材料也属于本发明的保护范围。

本发明所提供的与所述BpSOX10相关的生物材料，可为下述A1)至A20)中的任 一种：

A1)编码所述BpSOX10的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A13)含有A1)所述核酸分子的转基因植物组织；

A14)含有A2)所述表达盒的转基因植物组织；

A15)含有A3)所述重组载体的转基因植物组织；

A16)含有A4)所述重组载体的转基因植物组织；

A17)含有A1)所述核酸分子的转基因植物器官；

A18)含有A2)所述表达盒的转基因植物器官；

A19)含有A3)所述重组载体的转基因植物器官；

A20)含有A4)所述重组载体的转基因植物器官。

上文中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸 分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

上述与所述BpSOX10相关的生物材料中，A1)所述核酸分子可为如下1)或2)或 3)所示的基因：

1)其编码序列是序列表中序列2的第201-980位脱氧核糖核苷酸所示的DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述BpSOX10的 DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述BpSOX10的DNA 分子。

其中，序列表中序列2由1256个核苷酸组成，其编码序列是序列表中序列2的第 201-980位核苷酸，编码序列表中序列1所示的蛋白质。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方 法，对本发明的编码BpSOX10的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与 本发明分离得到的BpSOX10的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码 BpSOX10且与植物抗逆性相关，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的 序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本 发明的编码序列表的序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或 更高，80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。 同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的 同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

所述表达盒包括启动子、编码所述BpSOX10的核酸分子和终止子。所述启动子可 为CaMV35S启动子。

所述重组载体可为将所述BpSOX10的编码基因(即序列表序列2的第201-980位 所示的DNA分子)通过含有所述BpSOX10的编码基因的表达盒插入出发质粒得到的重 组质粒。所述重组载体具体可为先将序列表序列5所示的双链DNA分子插入载体 pCAMBIA1300的HindⅢ和XbaI识别位点之间，然后将所述BpSOX10的编码基因(即序 列表的序列2自5'末端第201位至第980位所示的双链DNA分子)插入XbaⅠ和Kpn Ⅰ酶切位点之间得到的重组载体。

所述重组微生物可通过将所述重组载体导入出发微生物得到。

所述出发微生物可为酵母、细菌、藻类或真菌。所述细菌可为革兰氏阳性细菌或 革兰氏阴性细菌。所述革兰氏阴性细菌可为根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)。所述根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)具体可为根癌农杆菌 GV3101。

所述转基因植物细胞系均不包括繁殖材料。所述转基因植物理解为不仅包含将 所述BpSOX10的编码基因转化受体植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。 对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转 移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈 伤组织、完整植株和细胞。

所述BpSOX10在调控植物抗逆性或制备调控植物抗逆性产品中的应用也属于本发 明的保护范围。

上述任一所述BpSOX10相关的生物材料在调控植物抗逆性或制备调控植物抗逆性 产品中的应用也属于本发明的保护范围。

所述BpSOX10作为转录因子的应用也属于本发明的保护范围。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育转基因植物的方法。

本发明所提供的一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入 编码所述BpSOX10的核酸分子，得到抗逆性高于所述受体植物的抗逆性转基因植物。

上述培育转基因植物的方法中，所述编码所述BpSOX10的核酸分子可为如下1) 或2)或3)所示的DNA分子：

1)其编码序列是序列表中序列2的第201-980位脱氧核糖核苷酸所示的DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述BpSOX10的 DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述BpSOX10的DNA 分子。

上文中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸 分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，序列表中序列2由1256个核苷酸组成，其编码序列是序列表中序列2的第 201-980位核苷酸，编码序列表中序列1所示的蛋白质。

上述任一所述抗逆性具体可为抗盐性。

上述任一所述植物可为双子叶植物或单子叶植物。所述双子叶植物具体可为十字 花科植物；所述十字花科植物可为拟南芥。

实验证明，本发明提供一种杂交构树盐胁迫相关的转录因子及其编码基因能提高 植物的抗盐性：盐处理前，哥伦比亚生态型拟南芥、转空载体植株、纯合转基因L4 株系和纯合转基因L15株系的生长状态良好；200mMNaCl处理后哥伦比亚生态型拟南 芥的白化率为96％±0.5％，转空载植株的白化率为95％±0.1％，L4株系和L15株系的 的叶子基本都保持绿色状态，可见，与哥伦比亚生态型拟南芥相比，L4株系和L15株 系的抗盐性显著增加。结果表明，可以利用本发明的转录因子及其编码基因提高植物 的抗逆性。

附图说明

图1为杂交构树幼苗总RNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果。

图2为3’RACEPCR扩增产物和5’RACEPCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果。 其中，泳道M为TRANS2000DNA分子量标准，泳道1为3’RACEPCR扩增产物，泳道2为 5’RACEPCR扩增产物。

图3为PCR扩增BpSOX10全长cDNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果。其中，泳道M为 TRANS2000DNA分子量标准，泳道1为PCR扩增产物。

图4为BpSOX10基因在不同胁迫条件下的相对表达量。

图5为BpSOX10基因的亚细胞定位结果。

其中，A—D为重组表达载体pCAMBIA1302-BpSOX10转化烟草表皮细胞瞬时表达的 结果，E—H为载体pCAMBIA1302转化烟草表皮细胞瞬时表达的结果；A和E为转化的 烟草表皮细胞在蓝光通道下(观察DAPI，确认细胞核的位置)的形态，B和F为转化 的烟草表皮细胞在荧光通道下(GFP荧光蛋白的观察)的形态，C和G为明视场下的形 态，D和H为三个视场的叠加。

图6为BpSOX10基因的转录激活活性分析。

其中，A为转基因酵母在平板上的位置；B为转基因酵母在不含His和Trp的SD 培养基上的生长状况；C为转基因酵母的β-半乳糖苷酶活性检测。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了 阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

TRANS2000DNA分子量标准为北京全式金生物技术有限公司产品。

不含His和Trp的SD培养基为北京泛基诺科技有限公司产品，产品编号为 YGM003A-17。

载体PMD-18T为Takara公司产品，产品目录号为D103A。

含有GAL4结合域的酵母表达载体pBridge购自美国Clontech公司，货号630404。

含有His3和LacZ报道子的酵母AH109株系购自美国Clontech公司，商品目录号 为K1612-1。

载体pCAMBIA1302和农杆菌EHA105均为北京鼎国昌盛生物科技有限责任公司产 品，产品目录号分别为MCV034-N和MCC028。

烟草品种NicotianatabacumcvXanth记载在如下文献中：HoiPX,QuyTD,Nghia PT,TutejaN:TransferofgeneencodingforDNAunwindinghelicase(pdh45)into tobaccoplants(NicotianatabacumL.cvXanthi)byusingAgrobacteriumand AnalysisoftheTransformedplants.TAPCHISINHHOC2015,25(3):83-92.。在 下文中烟草品种NicotianatabacumcvXanth简称为烟草。

杂交构树(Broussonetiakazinoki×B.papyrifera)是中国科学院植物研究所利 用小构树(B.kazinoki)与构树(B.papyrifera)杂交后经多代培育的品种，可以从北 京乔纳森科技发展有限公司购买。

重组载体pBridge-JcERF记载在如下文献中：M.Tang,J.Sun,Y.Liu,F.Chen, S.Shen,IsolationandfunctionalcharacterizationoftheJcERFgene,a putativeAP2/EREBPdomain-containingtranscriptionfactor,inthewoodyoil plantJatrophacurcas,PlantMol.Biol.63(2007)419–428.

实施例1、杂交构树盐胁迫相关的转录因子编码基因的获得

一、杂交构树盐胁迫相关的转录因子编码基因BpSOX10的3’端序列的克隆

1、植物材料处理及总RNA的提取

对正常生长8周的杂交构树的幼苗进行200mMNaCl溶液处理，处理6小时后提取杂 交构树幼苗的总RNA，进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。

结果如图1所示，结果表明，提取的总RNA有两条明显的电泳条带，从上到下依次 为28SRNA和18SRNA，表明获得了纯度较高、较完整的总RNA。

2、杂交构树盐胁迫相关的转录因子编码基因BpSOX10的3’端序列的克隆

(1)根据已公开的植物序列寻找保守区域，根据保守区域序列设计引物，具体的 引物序列如下：F1：5′-TGCAGAAAAAGGAAGATCAAGAG-3′。

(2)以上述步骤1提取的杂交构树幼苗的总RNA为模板，用PrimeScript^TM1st StrandcDNASynthesizedKit试剂盒(Takara公司产品)并参照试剂盒说明书的要 求，反转合成其第一链cDNA。反应体系及反应条件如下：Oligo-dT(10pmol/μl)1μL， TotalRNA(≤1μg)2μL，dNTPMixture(10mmol/Leach)1.0μL，5×Buffer4.0μL， RNaseInhibitor(40U/μL)0.5μL，PrimeScriptRTase(200U/μL)0.5μl，RNase-free distilledwater11μL；65℃5min，42℃45min，70℃15min。将合成的第一链cDNA 贮存于-20℃备用。

(3)再以步骤(2)获得的第一链cDNA为模板，采用引物F1与引物 OligodT-adaptor5′-GATTTCTGTCCGACGACTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′进行PCR扩增，得 到3’RACEPCR扩增产物。PCR反应体系为：cDNA模板，F1引物与OligodT-adaptor 各1μL，10×Buffer2.5μL，dNTPMixture(10mmol/Leach)2μL，Taq酶0.25μL 和ddH₂O12.25μL。反应程序为：94℃预变性5min；94℃30s，55℃30s，72℃60 s，共36个循环；72℃延伸10min。

(4)反应结束后，对3’RACEPCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如 图2所示，其中，泳道1为3’RACEPCR扩增产物。结果表明经3’RACEPCR扩增获得了 长度约为950bp的目的片段。

(5)回收并纯化3’RACEPCR扩增产物，将其连接到载体PMD-18T上，连接产物转 化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆进行菌液PCR鉴定，提取阳性克隆的质粒 进行测序，并对测序结果进行BLAST分析。结果表明，该片段的长度为968bp，其脱氧 核糖核苷酸序列如序列表中序列3所示。

二、杂交构树盐胁迫相关的转录因子编码基因BpSOX10的5’端序列的克隆

(1)根据上述步骤一获得的BpSOX10基因3’端cDNA序列设计引物：R1：5′- CTCTACGGTTATCTCTTTGA-3′。

(2)以步骤一提取的杂交构树幼苗的总RNA为模板，采用Promega公司的5’RACE 试剂盒并参照试剂盒说明书，反转录合成其第一链cDNA。

反应体系及条件如下：1μLRNA，1μL5'-CDSprimerA，1μLSMARTIIAoligo， 1μLDTT(20mM)，1μLdNTPMix(10mM)，1μLMMLVReverseTranscriptase，2 μL5XFirst-StrandBuffer和2μLsterileH₂O；70℃2min，冰上2min，42℃1.5 h，72℃7min。

(3)以步骤(2)获得的第一链cDNA为模板，采用引物R1与引物UPM(Promega公 司产品：Long(0.4μM)：5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'， Short(2μM)：5'-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3')配对进行PCR扩增，得到5’RACEPCR 扩增产物。PCR反应体系为：1μL50XAdvantage2PolymeraseMix，34.5μLPCR-Grade Water，5μL10XAdvantage2PCRBuffer，1μLdNTPMix(10mM)，1μL50XAdvantage 2PolymeraseMix，5μLUPM，1μL引物R，2.5μLcDNA模板。反应条件为：94℃30 s；68℃30s，70℃60s，共40个循环；70℃延伸10min。

(4)反应结束后，对5’RACEPCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如 图2所示，其中，泳道2为5’RACEPCR扩增产物。结果表明经5’RACEPCR扩增获得了 长度约为650bp的目的片段。

(5)回收并纯化5’RACEPCR扩增产物，将其连接到PMD-18T载体上，连接产物转 化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆进行菌液PCR鉴定，提取阳性克隆的质粒 进行测序，对测序结果进行BLAST分析。结果表明，该片段的长度为668bp，其脱氧核 糖核苷酸序列如序列表中序列4所示。

三、杂交构树盐胁迫相关的转录因子编码基因BpSOX10全长cDNA序列的获得及PCR 检测

1、杂交构树盐胁迫相关的转录因子编码基因BpSOX10全长cDNA序列的获得

利用上述步骤一和步骤二获得的长度为968bp和668bp片段之间的重叠区，借助 Contig软件拼接得到的全长cDNA序列，其脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列2所示， 将序列2所示的基因命名为BpSOX10，自5’端第201-980为ORF，编码由259个氨基酸残 基组成的蛋白质，该蛋白命名为BpSOX10，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列1。

2、PCR检测

(1)根据BpSOX10基因全长cDNA序列设计如下引物：

F2：5′-AGTGTCAGTACTAAACACTTGCTTGCAATC-3′；

R2：5′-GGTTTTTCAATAGACCCAGTTCATCATA-3′。

(2)以上述步骤一提取的杂交构树幼苗的总RNA经反转录合成的第一链cDNA为模 板，采用F2和R2进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

(3)对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示。结果表明，经 PCR扩增获得了长度约为1200bp的片段。

(4)回收并纯化该产物，将其连接到PMD-18T载体上，连接产物转化大肠杆菌DH5α 感受态细胞，筛选阳性克隆进行菌液PCR鉴定，提取阳性克隆的质粒进行测序。

测序结果表明，该PCR扩增产物具有序列表中序列2所示的核苷酸序列。

实施例2、BpSOX10基因在不同非生物胁迫因子条件下的表达模式分析

对杂交构树进行低温、高盐、干旱和茉莉酸甲酯处理用于分析杂交构树BpSOX10 基因在非生物胁迫下的表达情况。将杂交构树的种子种在培养基中，生长至8周后，对 幼苗分别进行低温(4℃)、高盐(200mMNaCl溶液)、干旱(PEG₆₀₀₀，20％)和茉莉酸甲 酯(MeJA，10％)处理。在不同处理时段，分别收集幼苗，用于提取RNA。具体方法如 下所述：

低温处理：将杂交构树幼苗置于4℃培养箱中，分别在光照培养0h、1h、3h、6h 和12h小时后取样。

高盐处理：将杂交构树幼苗的根系置于200mMNaCl溶液中，分别在光照培养0h、 1h、3h、6h和12h小时后取样。

干旱处理：将杂交构树幼苗的根系置于20％PEG₆₀₀₀溶液中，分别在光照培养0h、1h、 3h、6h和12h小时后取样。

茉莉酸甲酯处理：将杂交构树幼苗的根系置于10％MeJA溶液中，分别在光照培养 0h、1h、3h、6h和12h小时后取样。

分别提取上述处理杂交构树幼苗的总RNA，然后用PrimeScript^TM1stStrandcDNA SynthesizedKit试剂盒(Takara公司产品)并参照试剂盒说明书的要求，反转合成其 第一链cDNA。然后采用定量PCR方法分析BpSOX10基因在不同非生物胁迫因子条件下的 表达模式。

具体步骤如下：

1、引物的设计

根据杂交构树BpSOX10的cDNA序列设计其特异性引物QF和QR：并以Bpactin基因作 为反应的内参，引物序列如下：

QF：5′-ATGGAAGTGCCATTGAGCTG-3′；

QR：5′-CTAACATCAAAGACATTCGCTATCAG-3′；

Bpactin-F：5′-CCGTGCTCAATGGGATACTTC-3′；

Bpactin-R：5′-CCCTCGTCTGTGACAATGGTAC-3′。

2、定量PCR

分别以上述处理杂交构树幼苗的cDNA为模板，采用上述步骤1设计的引物进行 Q-PCR扩增。反应体系为：SYBRGreenMix10μL，QF0.4μL，QR0.4μL，ddH₂O7.2μL 和cDNA模板2μL(将反转录产物稀释10倍后作为模板)，总体积为20μL。实时定 量PCR反应采用两步法完成，反应程序为：95℃60s；95℃15s，65℃45s；40个 循环。所得数据及Ct值的分析用Mx3000p软件进行。

结果如图4所示。结果表明，BpSOX10基因的转录水平明显受高盐胁迫的诱导，随 着胁迫时间的延长，BpSOX10基因的相对表达量迅速增加，到处理6小时达到最大值， 之后的表达量逐渐降低；在干旱胁迫和MeJA诱导下BpSOX10基因的表达量稍低，在12h 时达到最大值；在低温处理下，BpSOX10基因的表达量变化缓慢。

实施例3、BpSOX10转录因子的功能验证

一、BpSOX10的亚细胞定位

1、将载体pCAMBIA1302的NcoI识别序列和SpeI识别序列间的DNA小片段替换为核苷 酸序列是序列表的序列2自5'末端第201位至第980位所示的DNA分子，得到重组表达载 体，将其命名为pCAMBIA1302-BpSOX10。

2、将5μg上述重组表达载体pCAMBIA1302-BpSOX10转入到农杆菌EHA105中，得到 重组农杆菌。

3、将重组农杆菌转化烟草表皮细胞(图5中A-D)，同时以转入空载体pCAMBIA1302 的烟草表皮细胞作为对照(图5中E-H)。

4、完成步骤3的农杆菌培养24-48小时，然后于DAPI(10mM)中染色10～20min， 在激光共聚焦扫描显微镜(Bio-RadMRC1024)下观察并照相。

结果见图5。结果表明，转入空载体pCAMBIA1302的转基因细胞中表达的蛋白分布 在整个细胞内，如图5中F和图5中H；而转入重组表达载体pCAMBIA1302-BpSOX10的转基 因细胞中表达的蛋白则定位于细胞核内，如图5中B和图5中D。结果表明：BpSOX10定位 于细胞核内。

二、BpSOX10的转录激活活性分析

1、将含有GAL4结合域的酵母表达载体pBridge的BamHI识别序列和SalI识别序列间 的DNA小片段替换为核苷酸序列是序列表的序列2自5'末端第201位至第980位所示的 DNA分子，保持酵母表达载体pBridge的其他序列不变，得到重组表达载体，将其命名 为pBridge-BpSOX10。

2、将重组载体pBridge-BpSOX10导入到含有His3和LacZ报道子的酵母AH109株系 中，得到含有重组载体pBridge-BpSOX10的转基因酵母；

将载体pBridge导入到含有His3和LacZ报道子的酵母AH109株系中，得到含有 pBridge的转基因酵母，作为阴性对照；

将重组载体pBridge-JcERF导入到含有His3和LacZ报道子的酵母AH109株系中，得到含 有pBridge-JcERF的转基因酵母，作为阳性对照。

3、将上述步骤2获得的含有重组载体pBridge-BpSOX10的转基因酵母、含有pBridge 的转基因酵母和含有pBridge-JcERF的转基因酵母分别在不含His和Trp的SD培养基 (SD/-His-Trp)上进行培养。

结果如图6所示。结果表明，含有pBridge的转基因酵母在不含His和Trp的SD培养 基上不能生长，而含有重组载体pBridge-BpSOX10的转基因酵母和含有pBridge-JcERF 的转基因酵母均能够在不含His和Trp的SD培养基上生长并显蓝色。说明BpSOX10具有转 录激活活性。

实施例4、转基因植物的获得

一、重组质粒的构建

以载体pCAMBIA1300(CAMBIA公司产品)为骨架载体，在HindⅢ和XbaI酶切位 点之间插入序列表的序列5所示的双链DNA分子(CaMV35S启动子)，XbaⅠ和KpnⅠ 酶切位点之间插入序列表的序列2自5'末端第201位至第980位所示的双链DNA分子， 得到重组质粒甲。

以载体pCAMBIA1300(CAMBIA公司产品)为骨架载体，在HindⅢ和XbaI酶切位 点之间插入序列表的序列5所示的双链DNA分子(CaMV35S启动子)，得到重组质粒 乙。

二、转基因植株的获得

1、将步骤一得到的重组质粒甲导入根癌农杆菌GV3101，得到重组农杆菌。

2、取步骤1得到的重组农杆菌，通过浸花法转染哥伦比亚生态型拟南芥，然后培 育植株并收获种子，即为T₁代种子。

3、将步骤2得到的种子播种于含300mg/L潮霉素的MS固体培养基，筛选抗性植 株(T₁代植株)。

4、提取T₁代植物的基因组DNA，进行PCR鉴定。

PCR鉴定的引物对如下：

QF：5′-ATGGAAGTGCCATTGAGCTG-3′；

QR：5′-CTAACATCAAAGACATTCGCTATCAG-3′。

如果PCR鉴定为阳性(PCR扩增得到约285bp的扩增产物)，该植株即为转基因植 株。每个植株的后代即为一个株系。

5、将步骤4中PCR鉴定为阳性的植株自交并收获种子(T₂代种子)。

6、将步骤5得到的种子培育为植株(T₂代植株)并单株收种子(T₃代种子)。

7、将T₃代种子播种到含300mg/L潮霉素的MS固体培养基，筛选抗性不分离的纯 合单株(即筛选其T₃代种子不发生抗性分离的T₂代植株，该植株为纯合的转基因植株)， 将其种子(T₃代种子)进行步骤三的各项检测和鉴定。

三、转空载体植株的获得

用重组质粒乙代替重组质粒甲进行步骤二，得到转空载体植株。

四、抗盐性

待测种子如下：L4株系(100粒T₃代种子)、L15株系(100粒T₃代种子)、转空 载体植株(100粒T₃代种子)和哥伦比亚生态型拟南芥(100粒种子)。L4株系和L15 株系为随机取的两个纯合的转基因株系。

将待测种子在22℃，12h光照下进行垂直培养，得到5天幼苗，将长势基本一致 各幼苗转移到含200mMNaCl的MS培养基上垂直培养进行盐胁迫处理，5天后统计植 株白化率(盐胁迫处理后有白化叶片的植株株数与盐胁迫处理前植株株数之比)。实验 重复三次，每次重复每个株系8株。

哥伦比亚生态型拟南芥的白化率为96％±0.5％，转空载植株的白化率为95％± 0.1％，L4株系和L15株系的的叶子基本都保持绿色状态。结果表明，与哥伦比亚生态 型拟南芥相比，L4株系和L15株系的抗盐性显著增加。