一种利用微生物发酵木质纤维素原料产乙醇的方法

摘要

本发明提供一种利用微生物发酵木质纤维素原料产乙醇的方法，包括将所述木质纤维素原料酶解得到木质纤维素原料酶解液、将所述微生物扩大培养，得到扩大培养液、将所述扩大培养液接种至所述木质纤维素原料酶解液中，通过间歇式供氧调节发酵的步骤。本发明所述方法可大幅提高乙醇的产率。

说明书

技术领域

本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种利用微生物发酵木质纤维素原料产乙醇的方法。

背景技术

诸多如石油等不可再生的化石能源日益枯竭，使得可再生能源特别是生物燃料受到越来越多的关注，并带来巨大的商机和社会意义。

根据国际能源署(IEA)的相关定义，常规生物燃料包括糖基和淀粉基乙醇、油料作物基生物柴油、可直接利用的植物油以及通过厌氧消化制得的沼气；先进生物燃料技术包括指还处于研发、中试或示范阶段的转化技术，通常称为第二代技术或第三代技术。这一类别包括用动物脂肪和植物油炼制的加氢植物油(HVO)，以及用含木质纤维素生物质生产的生物燃料，比如乙醇、费托液和合成天然气。

乙醇是清洁的可再生液体燃料，许多国家已经开始使用添加了一定比例乙醇的汽油—汽油醇，以代替汽油的消耗。这种新型燃料既能缓解石油的消耗速率，又可以减少汽车尾气污染，具有极大的应用和发展潜力。我国从2001年起开始推广使用汽油醇，目前汽油醇占汽油类燃料总消耗量的约20％，并处于逐年增长的势头。

目前国内外生产乙醇所使用的主要原料是玉米等粮食作物。随着世界人口的不断增长，粮食日益短缺，因此从长远来看，粮食作物不是生产乙醇的理想原料。同时，每年有大量的农林业废弃木质纤维材料(如玉米秸秆等)用焚烧等的方式不当处理，不仅造成了原料的浪费，而且污染了环境。木质纤维素主要由纤维素、半纤维素、木质素组成，在农业废弃木质纤维材料中三者的含量大约是：纤维素占30～40％，半纤维素占20～30％，木质素占10～25％。其中葡萄糖是纤维素的主要组成单元，木糖是半纤维素的主要组成单元。在植物纤维材料水解液中木糖占30％左右，是继葡萄糖之后自然界最丰富的糖分，因而利用葡萄糖木糖共发酵生产乙醇原材料丰富，具有广阔的市场前景。

一般而言，用含木质纤维素的生物质进行生物燃料的生产属于先进生物燃料技术范畴。利用含木质纤维素原料生产乙醇通常采用生物化学转化的工艺，包括预处理、水解、发酵和回收等步骤。经过预处理，增加了酶和纤维素材料的可接近性，从而提高原材料的可利用性；水解(包括酶解)以后，半纤维素主要分解为C5糖，而纤维素主要分解为C6糖。由于半纤维素的无定型结构，其更容易被水解为C5糖。在预处理阶段和酶解阶段，会得部分发酵抑制物，例如甲酸、乙酸、糠醛等。

但是，相应面临的困境是，自然界中能高效产醇的微生物通常只能利用葡萄糖等六碳糖生产乙醇，不能利用木糖；而少数能利用木糖产醇的微生物，产醇能力低下，这限制了对自然界中木质纤维素的有效利用。通过代谢工程对酵母进行改造，并利用其代谢转化C5糖主要经过以下反应：木糖还原酶依赖NADPH将木糖还原为木糖醇，木糖醇再在木糖醇脱氢酶作用下转化为木酮糖；再经木酮糖激酶磷酸化形成5-磷酸木酮糖，然后进入磷酸戊糖途径(PPP)。PPP途径的中间产物6-磷酸葡萄糖及3-磷酸甘油醛通过酵解途径形成丙酮酸，丙酮酸或是经丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶脱羧还原为乙醇。

在基因工程技术的推动下，研究人员获得了一批可以利用木糖代谢生产乙醇的重组发酵微生物。然而，在实际的工业化生产中，尤其是大规模产业化阶段，上述的微生物扩大培养增殖速度较慢，难以实现大规模应用，而且由于微生物代谢含C5糖与C6糖的木质纤维素原料酶解液过程中对发酵供给的消耗差异性需求，一直导致实际生产中的转化率过低，也成为了限制这一技术发展的难点之一。

发明内容

因此，本发明的目的在于克服现有技术中微生物代谢含C5和C6糖的木质纤维素原料酶解液过程中对发酵供给的消耗差异性需求，导致的实际生产中转化率过低的缺陷，从而提供一种高效利用微生物发酵木质纤维素原料产乙醇的方法，从而提高乙醇的转化率。

为此，本发明提供一种利用微生物发酵木质纤维素原料产乙醇的方法，包括如下步骤：

1)、将所述木质纤维素原料酶解，得到木质纤维素原料酶解液；

2)、将所述微生物扩大培养，得到扩大培养液；

3)、将所述扩大培养液按5-20％接种至所述木质纤维素原料酶解液中，控制反应温度25-38℃、pH5.0-7.0进行发酵生产，控制所述发酵过程中进行间歇式供氧，通气量0.01-0.5mL/L，通气时间0.5h，间隔时间为5-6h，发酵得到发酵液；

4)、分离所述发酵液获得乙醇。

所述步骤3)中，控制发酵过程中空气通气量0.1mL/L-0.2mL/L。

所述木质纤维素原料选自玉米秸秆、玉米芯、硬木、软木、坚果壳、草、纸、大麦秆、小麦杆、树叶、棉籽絮、柳枝、燕麦壳中的一种或几种。

从结构上看，木质纤维素主要包括纤维素、半纤维素和木质素。优选的，所述木素纤维素原料包含至少30wt％，优选至少50wt％，更优选至少70wt％，甚至更优选至少90wt％的木质纤维素。应理解的是，含木质纤维素原料中还可以包含其它组分，如蛋白质材料、淀粉、糖，如可发酵的糖和/或不可发酵的糖。

所述酶选自纤维素酶、半纤维素酶，淀粉酶、蛋白酶、葡糖淀粉酶、脂肪酶。所述纤维素酶包括但不限于纤维二糖水解酶(纤维二糖水解酶I和纤维二糖水解酶II)以及内切葡聚糖和β-葡糖苷酶。

所述木质纤维素原料酶解液中还含有黄豆饼粉、玉米饼粉、玉米浆、鱼粉或酵母膏中的一种或几种作为氮源，含有磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二铵中的一种或几种作为无机盐，并选择性的含有尿素和/或抑制剂。

所述发酵培养基中含有的碳源，按重量份比例，葡萄糖为5-20％，木糖为3-8％；作为在所述发酵培养基中的一种优选含量，葡萄糖为6-12％，木糖为3-6％。

所述发酵培养基中还含有作为氮源的蛋白质、游离氨基酸中的一种或两种。其中蛋白质在发酵培养基中的含量为3-4g/L，主要用于提供所述微生物生长所需的氮源；所述游离氨基酸包括丙氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、苏氨酸、胱氨酸、亮氨酸和缬氨酸中的一种或几种。

所述发酵培养基中含有的无机盐选自磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二铵中的一种或几种，且所述无机盐在所述发酵培养基中的含量为0.5-4g/L，优选为1-2.5g/L。

所述发酵培养基中还含有维生素、微量元素中的一种或几种。所述维生素包括B族维生素，所述B族维生素至少包括生物素、叶酸；所述微量元素包括铜、钙、铁、锌、铅、银、铬、菸酸、吡哆酸、硫胺和泛酸钙中的一种或几种。

本发明所述的发酵培养基中还含有用来抑制杂菌生长的抑菌剂，当然，如果发酵培养过程中没有杂菌，也可以不添加上述抑菌剂，所述抑菌剂选自青霉素、氨苄青霉素、链霉素、氯霉素、土霉素、四环素中的一种或几种，优选为青霉素和/或链霉素，发酵培养基中抑菌剂的工作浓度为10-50单位/mL，优选为15-25单位/mL，更优选为20单位/mL。

当所述发酵培养基来源于所述木质纤维素原料酶解液时，按重量份比例，其葡萄糖的含量为1-25％，木糖的含量为1-10％；优选的，葡萄糖的含量为5-20％，木糖的含量为3-8％；更优选的，葡萄糖的含量为6-12％，木糖的含量为3-6％。

同时，本领域技术人员应当了解，虽然一定浓度的乙酸可能对所述微生物细胞产生抑制作用，但是木质纤维素原料酶解液中还是可以允许存在少量的乙酸，所述乙酸在所述发酵培养基中的含量优选为0.1-1％，更优选为0.1-0.8％。

所述扩大培养为将所述微生物接种至扩大培养基中，通过至少一级扩大培养步骤对所述微生物进行扩大培养，在所述扩大培养步骤中，通过调节扩大培养过程中的供氧浓度实现对所述微生物的扩大培养。

使用一级扩大培养步骤对所述微生物进行扩大培养，包括如下步骤：

将所述种子液按照5-20％的接种量接种至含有扩大培养基的一级扩培罐中，控制温度25-35℃、pH4-6.5、转速180-220rpm、通气量0.08-0.5L/L.min，扩大培养6-12h；随后调整转速40-100rpm、通气量0.18-0.5L/L.min，扩大培养至所述微生物浓度达到(0.1-0.5)×10⁹/mL。

使用二级扩大培养步骤对所述微生物进行扩大培养，包括如下步骤：

1)将所述种子液按照5-20％的接种量接种至含有所述扩大培养基的一级扩培罐中，控制温度25-35℃、pH4-6.5、转速180-220rpm、通气量0.08-0.5L/L.min，进行扩大培养至所述微生物浓度达到(0.1-0.5)×10⁹/mL；

2)将步骤1)中得到的扩培微生物按照5-20％的接种量接种至含有所述扩大培养基的二级扩培罐中，控制温度25-35℃、pH4-6.5、转速40-100rpm、通气量0.18-0.5L/L.min，进行扩大培养至所述微生物浓度达到(0.1-0.5)×10⁹/mL。

使用三级扩大培养步骤对所述微生物进行扩大培养，包括如下步骤：

1)将所述种子液按照5-20％的接种量接种至含有所述扩大培养基的一级扩培罐中，控制温度25-35℃、pH4-6.5、转速180-220rpm、通气量0.08-0.5L/L.min，进行扩大培养至所述微生物浓度达到(0.1-0.5)×10⁹/mL；

2)将步骤1)中得到的扩培微生物按照5-20％的接种量接种至含有所述扩大培养基的二级扩培罐中，控制温度25-35℃、pH4-6.5、转速40-60rpm、通气量0.18-0.5L/L.min，进行扩大培养至所述微生物浓度达到(0.1-0.5)×10⁹/mL；

3)将步骤2)中得到的扩培微生物按照5-20％的接种量接种至含有所述扩大培养基的三级扩培罐中，控制温度25-35℃、pH4-6.5、转速40-60rpm、通气量0.01-0.2L/L.min，进行扩大培养至所述微生物浓度达到(0.1-0.5)×10⁹/mL。

使用四级扩大培养步骤对所述微生物进行扩大培养，包括如下步骤：

1)将所述种子液按照5-20％的接种量接种至含有所述扩大培养基的一级扩培罐中，控制温度25-35℃、pH4-6.5、转速180-220rpm、通气量0.08-0.5L/L.min，进行扩大培养至所述微生物浓度达到(0.1-0.5)×10⁹/mL；

2)将步骤1)中得到的扩培微生物按照5-20％的接种量接种至含有所述扩大培养基的二级扩培罐中，控制温度25-35℃、pH4-6.5、转速40-60rpm、通气量0.18-0.5L/L.min，进行扩大培养至所述微生物浓度达到(0.1-0.5)×10⁹/mL；

3)将步骤2)中得到的扩培微生物按照5-20％的接种量接种至含有所述扩大培养基的三级扩培罐中，控制温度25-35℃、pH4-6.5、转速40-60rpm、通气量0.01-0.2L/L.min，进行扩大培养至所述微生物浓度达到(0.1-0.5)×10⁹/mL；

4)将步骤3)中得到的扩培微生物按照5-20％的接种量接种至含有所述扩大培养基的四级扩培罐中，控制温度25-35℃、pH4-6.5、通气量0.0005-0.02L/L.min，进行扩大培养至所述微生物浓度达到(0.1-0.5)×10⁹/mL。

所述各级扩大培养过程中，一级扩培罐为50L扩培罐，二级扩培罐为500L扩培罐，三级扩培罐为5立方扩培罐，四级扩培罐为50立方扩培罐。

所述各级扩大培养的过程中，所述扩大培养基彼此独立的含有玉米糖化醪、糖蜜、葡萄糖、甜高粱茎秆汁或木质纤维素原料酶解液中的一种或几种做为碳源，含有黄豆饼粉、玉米饼粉、玉米浆、鱼粉、酵母膏中的一种或几种做为氮源；并且选择性的含有尿素、无机盐、氨基酸、微量元素和/或抑制剂。

所述扩大培养能够为后续发酵产生乙醇步骤提供足够多的微生物数量，其中扩大培养基是微生物获得生存的营养来源，对微生物生长繁殖、酶的活性与产量都有直接的影响。

所述扩大培养液基择性的包括蛋白胨、玉米糖化醪、糖蜜、葡萄糖、甜高粱茎秆汁或木质纤维素原料酶解液。

作为一种优选，所述扩大培养基为蛋白胨、玉米糖化醪、糖蜜、葡萄糖、甜高粱茎秆汁或木质纤维素原料酶解液中的一种或几种，并且所述扩大培养基中葡萄糖的含量按重量百分比含量为2-10％，优选含量为4-6％。

作为另一种优选，所述扩大培养基中含有4％重量百分比葡萄糖的培养基，或者含重量百分比为4％葡萄糖的玉米糖化醪或糖蜜。

作为另外一种优选方案，所述扩大培养基还可以是按重量百分比稀释浓度为10-75％的木质纤维素原料酶解液，其中所述木质纤维原料酶解液未被稀释时按重量百分比含有葡萄糖1-25％、木糖1-10％；优选的，葡萄糖含量为5-20％，木糖含量优选为3-8％；更优选的，葡萄糖含量为6-12％，木糖含量为3-6％。优选的，所述木质纤维素原料酶解液作为所述扩大培养基时，其按重量百分比稀释浓度为20-30％。

作为又一种优选，为提供所述微生物扩大培养时所需的氮源、微量元素、维生素等物质，所述扩大培养基还含有5-10g/L的黄豆饼粉、玉米饼粉、干物质含量为40-60wt％的玉米浆、鱼粉和/或酵母膏的混合物，优选为8-10g/L；从而为所述微生物提供包括丙氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、苏氨酸、胱氨酸、亮氨酸和/或缬氨酸的游离氨基酸在内的多种氨基酸，包括铜、钙、铁、锌、铅、银、铬、菸酸、吡哆酸、硫胺和/或泛酸钙在内的多种微量元素以及包括B族维生素在内的各种维生素。

作为进一步的优选，所述扩大培养基中还含有尿素和/或无机盐，所述尿素在所述扩大培养基中的含量为2-5g/L，优选为3-4g/L；所述无机盐选自磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二铵中的一种或几种，优选为磷酸二氢钾和/或磷酸氢二铵，在所述扩大培养基中的含量为0.5-4g/L，优选1-3g/L。更优选的，所述扩大培养基中含有1.5g/L的磷酸二氢钾和1.5g/L的磷酸氢二铵。

通常情况下，所述扩大培养过程中如果没有杂菌进入不需要添加抑菌剂，如果有杂菌进入时，作为更进一步的优选，可在所述扩大培养基中添加抑菌剂，所述抑菌剂选自青霉素、氨苄青霉素、链霉素、氯霉素、土霉素、四环素中的一种或几种，优选为青霉素或/链霉素，在所述扩大培养基液中所述抑菌剂的工作浓度为10-50单位/mL，优选为15-25单位/mL，更优选为20单位/mL。

在扩大培养将所述微生物之前还包括将所述微生物在种子培养基中培养12-24h至所述微生物浓度达到(0.1-0.5)×10⁹/ml的步骤。

采用种子培养基对所述微生物进行培养，目的是快速扩增所述微生物，以尽快达到扩大培养所述微生物所需的菌体浓度，所述种子培养基可以采用现有技术中已有的种子培养基，如YEPD等。

所述YEPD是指培养基成分为酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L，经分装灭菌后混合制备得到。

所述微生物选自酿酒酵母Saccharomycescerevisiae、嗜鞣管囊酵母Pachysolentannophilus、树干毕赤酵母Pichiastipitis、休哈塔假丝酵母Candidashehatae、酒香酵母Brettanomycesnaardenensis、纤细假丝酵母Candidatenuis、热带假丝酵母Candidatropicalis、赛沟毕赤酵母Pichiasegobiensis、多动拟杆菌Bacteroidespolypragmatus、菊欧文氏杆菌Erwiniachrysanthem、植物克雷伯杆菌Klebsiellaplanticola、嗜热厌氧乙醇菌Thermoanaerobacterethanolicus、球状螺旋体Spirochaetacoccoidessp.、植物发酵梭菌Clostridiumphytofermentassp.、尖孢镰刀菌Fusariumoxysporum、粗糙脉孢菌Neurosporacrassa、燕麦镰刀菌Fusariumavenaceum、运动发酵单胞菌Zymomonasmobilis、大肠杆菌Escherichiacoli以及重组酿酒酵母S.cerevisiae、重组运动发酵单胞菌Zymomonasmobilis、重组大肠杆菌Escherichiacoli，以及本领域技术人员所熟知的可以进行C5和C6共同发酵产乙醇的其他已知菌株。

本发明所述方法所选用的上述微生物是从自然界分离得到，或者经过遗传工程改造后得到，包括细菌、真菌和酵母酿酒。

其中，所述重组酿酒酵母S.cerevisiae是通过真菌的木糖转运酶在酿酒酵母中进行表达，选择木糖异构酶(XI)途径或木糖还原-木糖醇氧化途径(XR-XDH)进行木酮糖转化，并将磷酸戊糖下游代谢路径进行修饰以强化木糖代谢转化乙醇的能力，可利用的酿酒酵母菌记载在专利WO9742307A、WO9513362A、US20110027847、CN1966694A、CN101205525A所公开的菌株。

所述重组运动发酵单胞菌Zymomonasmobilis的改造可将E.coli的xylA(木糖异构酶基因)、xylB(木酮糖激酶基因)、talB(转酮醇酶基因)、tktA(转醛醇酶基因)导入到Z.mobilis中，例如专利US5843760、US5514583、WO200851348A、WO200958927A、WO200944868A或WO200958938A。

所述重组大肠杆菌Escherichiacoli，是指将含有PET操纵子(携带运动发酵单胞菌丙酮酸脱氢酶和乙醇脱氢酶基因)的质粒转化到E.coli菌株可以使重组E.coli的已糖和戊糖代谢形成的中心代谢物—丙酮酸转向乙醇生产，例如专利CN101875912A中所报道的菌株。

优选的，所述微生物选自酿酒酵母Saccharomycescerevisiae、运动发酵单胞菌Zymomonasmobilis和/或大肠杆菌E.coli。

进一步优选的，所述微生物为酿酒酵母Saccharomycescerevisiae、运动发酵单胞菌Zymomonasmobilis。

从发酵液中分离乙醇可以采用本领域已知的常规方法，例如采用蒸馏，可采用本领域中所描述的常规蒸馏设备，例如具有双流塔板和横流塔板的蒸馏塔。因发酵含酒精产物的悬浮固体含量较高，一般来说，双流筛塔板或横流阀塔板是优选的。在各种优选的实施方案中，包括横流阀塔板的塔是优选的，因为通过横流阀塔板往往提供更高的极限负荷比和更高的效率。

本发明的一种利用微生物发酵木质纤维素原料产乙醇的方法具有以下优点：

1.本发明的利用微生物发酵木质纤维素原料产乙醇的方法，通过将木质纤维素原料酶解后获得木质纤维素原料酶解液，然后将扩大培养后的微生物接种至上述木质纤维素原料酶解液中，在发酵过程中采取间歇式供氧的发酵策略，使得微生物能够充分综合利用酶解液中的葡萄糖和木糖，产乙醇的效率大大提高。

2.本发明的利用微生物发酵木质纤维素原料产乙醇的方法，所使用的木质纤维素原料选自玉米秸秆、玉米芯、硬木、软木、坚果壳、草、纸、大麦秆、小麦杆、树叶、棉籽絮、柳枝、燕麦壳中的一种或几种，因而不仅可以大量利用现实中难以合理处置的有机废弃物，有利于改善环境，减轻处理上述有机废弃物的压力，而且还能生产出较高含量的乙醇，作为清洁的燃料使用，从而减轻化石燃料的利用，减缓了化石燃料消耗的速度，并保护了环境；上述原材料来源充足，可避免使用粮食发酵产乙醇，节约了粮食，降低了乙醇的生产成本。

4.本发明的利用微生物发酵木质纤维素原料产乙醇的方法，上述木质纤维素原料酶解液中还可以含有黄豆饼粉、玉米饼粉、玉米浆、鱼粉或酵母膏中的一种或几种作为氮源，含有磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二铵中的一种或几种作为无机盐，并选择性的含有尿素和/或抑制剂等，可以在发酵过程中提供上述微生物所需的各种营养物质，配合上述间歇式供氧的发酵策略促进微生物的快速增殖，提高发酵的质量和速度。

5.本发明的利用微生物发酵木质纤维素原料产乙醇的方法，通过至少一级的扩大培养步骤对所述微生物进行培养，并在所述扩大培养步骤中，调节供氧浓度，从而使得所述微生物快速增值，且发酵活力增强。

6.本发明的利用微生物发酵木质纤维素原料产乙醇的方法，所使用的微生物是从自然界分离得到，或者经过遗传工程改造后得到，包括细菌、真菌和酵母酿酒等，上述微生物在本发明的不同发酵阶段采用不同环境条件的生产方法下，可以高效利用木质纤维素原料酶解液发酵产生乙醇。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的一种利用微生物发酵木质纤维素原料产乙醇的方法做更加具体的描述。

实施例1

本实施例提供一种共发酵C5和C6生产乙醇微生物的扩大培养方法，以重组酿酒酵母S.cerevisiae424A(LNH-ST)为例进行扩大培养实验，所述重组酿酒酵母S.cerevisiae424A(LNH-ST)(如CellulosicethanolproductionfromAFEX-treatedcornstoverusingSaccharomycescerevisiae424A(LNH-ST),M.W.Lau,B.E.Dale,ProcNatlAcadSciUSA,106(2009),pp.1368-1373；Two-stepSSCFtoconvertAFEX-treatedswitchgrasstoethanolusingcommercialenzymesandSaccharomycescerevisiae424A(LNH-ST),M.Jin,M.W.Lau,V.Balan,B.E.Dale,BioresourTechnol,101(2010),pp.8171–8178等报道)，为市售获得，所述扩大培养方法采用一级扩大培养步骤，具体包括：

A、种子液培养步骤

配制YEPD培养基，将保存的上述菌体接种至YEPD培养基中，控制温度25℃、pH6.0、转速200rpm、通气量0.2L/L.min，培养12h，至上述菌种浓度为(0.1-0.5)×10⁹/ml；

所述YEPD培养基具体含酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L，并调节pH6.5。

B、扩大培养步骤

将培养后的种子液按照5％(v/v)的接种量接入容积为50L的含有一级扩大培养基的一级扩培罐中，控制温度35℃、pH4、转速180rpm通入空气，通气量0.5L/L.min，培养12h；随后调整转速为40rpm，通气量为0.18L/L.min，扩大培养12h，至菌种浓度达到(0.1-0.5)×10⁹/ml；

所述一级扩大培养基包含用水稀释至30wt％的木质纤维素原料酶解液、玉米浆(干物质含量40％)15g/L、KH₂PO₄1.5g/L、(NH₄)₂HPO₄2.5g/L，使用去离子水或软化水配置溶液，分装灭菌，冷却后混合，并加入2g/L尿素。

实施例2

本实施例提供一种共发酵C5和C6生产乙醇微生物的扩大培养方法，以热带假丝酵母Candidatropicalis为例进行扩大培养实验，所述热带假丝酵母Candidatropicalis为市售所得，所述扩大培养方法采用二级扩大培养步骤，具体包括：

A、种子液培养步骤

配制YEPD培养基，将保存的上述菌体接种至YEPD培养基中，控制温度25℃、pH6.0、转速200rpm、通气量0.2L/L.min，培养至上述菌种浓度为(0.1-0.5)×10⁹/ml；

所述YEPD培养基具体含酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L，并调节pH6.0。

B、扩大培养步骤

1)将培养后的种子液按照20％(v/v)的接种量接入容积为50L的含有一级扩大培养基的一级扩培罐中，控制温度25℃、pH6.5、转速220rpm通入空气，通气量0.08L/L.min，培养16h，至菌种浓度达到(0.1-0.5)×10⁹/ml；

2)按照20％(v/v)的接种量将所述一级扩培步骤得到的一级扩培液接种至容积为500L的含有二级扩大培养基的二级扩培罐中，控制温度25℃、pH6.5、转速100rpm通入空气，通气量0.18L/L.min，培养12h，至菌种浓度达到(0.1-0.5)×10⁹/ml；

所述一级扩大培养基和二级扩大培养基相同，均为含质量百分比为4％的葡萄糖扩大培养基，并含有玉米浆(干物质含量40％)15g/L、KH₂PO₄1.5g/L、(NH₄)₂HPO₄1.5g/L；去离子水或软化水配置溶液，分装灭菌，冷却后混合，并加入3g/L尿素。

实施例3

本实施例提供一种共发酵C5和C6生产乙醇微生物的扩大培养方法，以重组酿酒酵母S.cerevisiae424A(LNH-ST)为例进行扩大培养实验(同实施例1)，所述扩大培养方法采用三级扩大培养步骤，具体包括：

A、种子液培养步骤

配制YEPD培养基，将保存的上述菌体接种至YEPD培养基中，控制温度30℃、pH6.0、通气量0.2L/L.min、转速200rpm，培养14h，至上述菌种浓度为(0.2-0.3)×10⁹/ml；

所述YEPD培养基具体含酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L，并调节pH6.5。

B、扩大培养步骤

1)将培养后的种子液按照10％(v/v)的接种量接入容积为50L的含有一级扩大培养基的一级扩培罐中，控制温度30℃、pH5.0、转速200rpm通入空气，通气量0.5L/L.min，培养14h至菌种浓度达到(0.2-0.3)×10⁹/ml；

2)按照15％(v/v)的接种量将所述一级扩培步骤得到的一级扩培液接种至容积为500L的含有二级扩大培养基的二级扩培罐中，控制温度25℃、pH6.0、转速100rpm通入空气，通气量0.5L/L.min，培养16h至菌种浓度达到(0.1-0.5)×10⁹/ml；

3)按照5％(v/v)的接种量将所述二级扩培步骤得到的二级扩培液接种至容积为5立方米的含有三级扩大培养基的三级扩培罐中，控制温度33℃、pH6.2、转速60rpm通入空气，通气量0.01L/L.min，培养16h至菌种浓度达到(0.2-0.3)×10⁹/ml；

所述一级扩大培养基和二级扩大培养基相同，均为：含玉米糖化醪4wt％，灭菌后加入3g/L尿素；

所述三级扩大培养基为：用水稀释至30wt％木的质纤维素原料酶解液、玉米浆(干物质含量40％)15g/L、KH₂PO₄1.5g/L、(NH₄)₂HPO₄1.5g/L，去离子水或软化水配置溶液，分装灭菌，冷却后混合，并加入3g/L尿素。

实施例4

本实施例提供一种共发酵C5和C6生产乙醇微生物的扩大培养方法，以重组酿酒酵母S.cerevisiae424A(LNH-ST)为例进行发酵实验(同实施例1)，所述扩大培养方法采用四级扩大培养步骤，具体包括：

A、种子液培养步骤

配制YEPD培养基，将保存的上述菌体接种至YEPD培养基中，控制温度30℃、pH6.0、通气量0.2L/L.min、转速200rpm，培养20h，至上述菌种浓度为(0.2-0.3)×10⁹/ml；

所述YEPD培养基具体含酵母粉5g/L、蛋白胨15g/L、葡萄糖15g/L，并调节pH6.0。

B、扩大培养步骤

1)将培养后的种子液按照10％(v/v)的接种量接入容积为50L的含有一级扩大培养基的一级扩培罐中，控制温度33℃、pH4.8、转速200rpm通入空气，通气量0.4L/L.min，培养14h至菌种浓度达到(0.2-0.3)×10⁹/ml；

2)按照17％(v/v)的接种量将所述一级扩培步骤得到的一级扩培液接种至容积为500L的含有二级扩大培养基的二级扩培罐中，控制温度30℃、pH5、转速60rpm通入空气，通气量0.3L/L.min，培养14h至菌种浓度达到(0.2-0.3)×10⁹/ml；

3)按照18％(v/v)的接种量将所述二级扩培步骤得到的二级扩培液接种至容积为5立方米的含有三级扩大培养基的三级扩培罐中，控制温度35℃、pH6.5、转速60rpm通入空气，通气量0.18L/L.min，培养16h至菌种浓度达到(0.2-0.3)×10⁹/ml；

4)按照20％(v/v)的接种量将所述三级扩培步骤得到的三级扩培液接种至容积为30立方米的含有四级扩大培养基的四级扩培罐中，控制温度33℃、pH5.8、通气量0.01L/L.min，培养16h至菌种浓度达到(0.2-0.3)×10⁹/ml。

所述一级扩大培养基和二级扩大培养基均与实施例3中的一级扩大培养基和二级扩大培养基相同；

所述三级扩大培养基和四级扩大培养基均与实施例3中的三级扩大培养基相同。

在实施例1、3、4中，木质纤维素原料酶解液的原料选自玉米秸秆，其制备方法如下：

步骤(1)：将玉米秸秆破碎为粒度为10-100mm的颗粒，将原料投入螺旋喂料器，对其进行挤压脱水至干物20％-50％，形成致密的料塞，在保证纤维素原料不断进入处理容器的同时还能抵御容器内的蒸汽外泄；

步骤(2)：在步骤1中形成的料塞从螺旋喂料器处理后，向纤维素原料中混入其质量2％的稀释硫酸溶液，进入酸混合罐混合后得到酸性纤维素原料；

步骤(3)：步骤2中的酸性纤维素原料在蒸煮处理容器中，与0.6MPa(G)的低压蒸汽接触进行处理，处理时间在15-25min之间，然后按照一定频率间歇泄压排放的方式排出容器，此过程可以打开纤维素原料的结构，使半纤维素部分降解，部分纤维素裸露在表面；

步骤(4)：将生物质处理产物水洗，调节pH值为5.0，加热至50℃后，以每克产物的干重计，加入20-50滤纸酶活力单位的纤维素酶计算，挤入纤维素酶(诺维信有限公司提供)，并在50℃下保温混合搅拌72h，得到所述酶解液。

将实施例1-4中培养得到的扩大培养菌种液，均按10％接种量接至含发酵培养基的发酵罐中，控制发酵过程中温度30℃，pH6.0，转速200rpm通入空气，通气量0.2L/L.min，发酵16h，检测发酵产物。

所述发酵培养基为：葡萄糖8wt％、木糖4.5wt％、KH₂PO₄0.5g/L、(NH₄)₂HPO₄2g/L；去离子水或软化水配置溶液，分装灭菌，冷却后混合。

扩培级数起始糖浓度(g/L)终点乙醇浓度(g/L)总用时(扩培+发酵(h)实施例1177.00+43.4230.9628实施例2277.00+43.4241.3044实施例3377.00+43.4245.7862实施例4477.00+43.4250.3576

实施例5

本实施例提供一种利用微生物发酵木质纤维素原料产乙醇的方法，以重组酿酒酵母S.cerevisiae424A(LNH-ST)为例进行发酵实验，所述重组酿酒酵母S.cerevisiae424A(LNH-ST)(如CellulosicethanolproductionfromAFEX-treatedcornstoverusingSaccharomycescerevisiae424A(LNH-ST),M.W.Lau，B.E.Dale，ProcNatlAcadSciUSA，106(2009)，pp.1368-1373；Two-stepSSCFtoconvertAFEX-treatedswitchgrasstoethanolusingcommercialenzymesandSaccharomycescerevisiae424A(LNH-ST)，M.Jin，M.W.Lau，V.Balan，B.E.Dale，BioresourTechnol，101(2010)，pp.8171–8178等报道)，为市售获得，所述利用微生物发酵木质纤维素原料产乙醇的方法具体包括：将木质纤维素原料酶解制得木质纤维素原料酶解液的步骤、种子培养的步骤、菌种扩大培养的步骤，以及发酵产乙醇的步骤，具体包括：

A、酶解木质纤维素原料制得木质纤维素原料酶解液的步骤

所述木质纤维素原料酶解液的原料选自玉米秸秆，其制备方法如下：

步骤1)：将玉米秸秆破碎为粒度为10-100mm的颗粒，将原料投入螺旋喂料器，对其进行挤压脱水至干物20％-50％，形成致密的料塞，在保证纤维素原料不断进入处理容器的同时还能抵御容器内的蒸汽外泄；

步骤2)：在步骤1)中形成的料塞从螺旋喂料器处理后，向纤维素原料中混入其质量2％的稀释硫酸溶液，进入酸混合罐混合后得到酸性纤维素原料；

步骤3)：步骤2)中的酸性纤维素原料在蒸煮处理容器中，与0.6MPa(G)的低压蒸汽接触进行处理，处理时间在15-25min之间，然后按照一定频率间歇泄压排放的方式排出容器，此过程可以打开纤维素原料的结构，使半纤维素部分降解，部分纤维素裸露在表面；

步骤4)：将生物质处理产物水洗，调节pH值为5.0，加热至50℃后，以每克产物的干重计，加入20-50滤纸酶活力单位的纤维素酶计算，挤入纤维素酶(诺维信有限公司提供)，并在50℃下保温混合搅拌72h，得到所述酶解液。

B、种子液培养步骤

配制YEPD培养基，将保存的上述菌体接种至YEPD培养基中，控制温度30℃、pH6.0、转速200rpm、通气量0.2L/L.min，培养20h，至上述菌种浓度为(0.2-0.3)×10⁹/ml；

所述YEPD培养基具体含酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L，并调节pH6.0。

C、扩大培养步骤

1)将培养后的种子液按照5％(v/v)的接种量接入容积为50L的含有一级扩大培养基的一级扩培罐中，控制温度30℃、pH6.0、转速200rpm通入空气，通气量0.1L/L.min，培养16h至菌种浓度达到(0.2-0.3)×10⁹/ml；

2)按照5％(v/v)的接种量将所述一级扩培步骤得到的一级扩培液接种至容积为500L的含有二级扩大培养基的二级扩培罐中，控制温度30℃、pH6.0、转速50rpm通入空气，通气量0.2L/L.min，培养16h至菌种浓度达到(0.1-0.5)×10⁹/ml；

所述一级扩大培养基和二级扩大培养基相同，均为含质量百分比为4％的葡萄糖扩大培养基，并含有玉米浆(干物质含量40％)15g/L、KH₂PO₄1.5g/L、(NH₄)₂HPO₄1.5g/L；去离子水或软化水配置溶液，分装灭菌，冷却后混合，并加入3g/L尿素。

D、发酵产乙醇步骤

取第二级扩大培养结束后的二级扩培液，按照10％(v/v)的接种量接种至含有上述木质纤维素原料酶解液作为发酵培养基的发酵罐中，控制温度28℃、pH6.0、通气量0.01mL/L,间歇通气，通气时间为0.5h，间隔时间为6h，发酵72h，获得发酵产物。

实施例6

本实施例提供一种利用微生物发酵木质纤维素原料产乙醇的方法，以重组酿酒酵母S.cerevisiae424A(LNH-ST)为例进行发酵实验(同实施例5)，所述发酵产乙醇的方法具体包括：将木质纤维素原料酶解制得木质纤维素原料酶解液的步骤、种子培养的步骤、菌种扩大培养的步骤，以及发酵产乙醇的步骤，具体包括：

A、酶解木质纤维素原料制得木质纤维素原料酶解液的步骤

同实施例5，区别在于，所使用的木质纤维素原料为玉米芯和草。

B、种子液培养步骤

配制YEPD培养基，将保存的上述菌体接种至YEPD培养基中，控制温度25℃、pH6.0、转速200rpm、通气量0.2L/L.min，培养12h，至上述菌种浓度为(0.1-0.5)×10⁹/ml；

所述YEPD培养基具体含酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L，并调节pH6.5。

C、扩大培养步骤

将培养后的种子液按照10％(v/v)的接种量接入容积为50L的含有一级扩大培养基的一级扩培罐中，控制温度30℃、pH6.0、转速200rpm通入空气，通气量0.05L/L.min，培养14h至菌种浓度达到(0.2-0.3)×10⁹/ml；

在按照10％的接种量，取所述扩培后的一级扩培液接种至500L的二级扩培罐中，控制温度30℃、pH6.0、转速40rpm通入空气，通气量0.3L/L.min，培养14h至菌种浓度达到(0.2-0.3)×10⁹/ml；

所述一级扩大培养基为用水稀释至30wt％的木质纤维素原料酶解液、玉米浆(干物质含量40％)15g/L、KH₂PO₄1.5g/L、(NH₄)₂HPO₄1.5g/L，去离子水或软化水配置溶液，分装灭菌，冷却后混合，并加入2g/L尿素。

D、发酵产乙醇步骤

取上述扩大培养结束后的扩培液，按照10％(v/v)的接种量接种至含有发酵培养基的发酵罐中，控制温度25℃、pH5、通气量0.5mL/L,间歇通气，通气时间为0.5h，间隔时间为6h，发酵72h；获得发酵产物；

所述发酵培养基为：用水稀释至30wt％的上述木质纤维素原料酶解液、玉米浆(干物质含量45wt％)7.5g/L、KH₂PO₄0.5g/L，(NH₄)₂HPO₄2g/L，发酵开始前调节pH为5.0。

实施例7

本实施例提供一种利用微生物发酵木质纤维素原料产乙醇的方法，以重组酿酒酵母S.cerevisiae424A(LNH-ST)为例进行发酵实验(同实施例5)，所述发酵产乙醇的方法具体包括：将木质纤维素原料酶解制得木质纤维素原料酶解液的步骤、种子培养的步骤、菌种扩大培养的步骤，以及发酵产乙醇的步骤，具体包括：

A、酶解木质纤维素原料制得木质纤维素原料酶解液的步骤

同实施例5，区别在于，所使用的木质纤维素原料为大麦秆和小麦秆。

B、种子液培养步骤

配制YEPD培养基，将保存的上述菌体接种至YEPD培养基中，控制温度30℃、pH6.0、转速200rpm、通气量0.2L/L.min，培养14h，至上述菌种浓度为(0.2-0.3)×10⁹/ml；

所述YEPD培养基具体含酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L，并调节pH6.0-6.5。

C、扩大培养步骤

一级培养：本实施例的一级扩大培养基采用4％葡萄糖扩大培养基：其中含葡萄糖4wt％，玉米浆(干物质含量40％)15g/L、KH2PO41.5g/L、(NH4)2HPO41.5g/L，去离子水或软化水配置溶液，分装灭菌，冷却后混合，加入5g/L尿素；培养的方法与参数与实施例6相同；

二级培养：与实施例6相同。

D、发酵产乙醇步骤

扩大培养结束后的扩培液，按照10％(v/v)的接种量接种至容积为30立方米的含有发酵培养基的发酵罐中，控制温度30℃、pH6.5、通气量0.1mL/L,间歇通气，通气时间为0.5h，间隔时间为5h，发酵72h，获得发酵产物；

发酵过程中采用微氧设备进行供氧。

所述发酵培养基为：用水稀释至30wt％的木质纤维素原料酶解液、玉米浆(干物质含量40wt％)7.5g/L、KH₂PO₄0.5g/L，(NH₄)₂HPO₄2g/L，发酵开始前调节pH为6.0。

实施例8

本实施例提供一种利用微生物发酵木质纤维素原料产乙醇的方法，以重组酿酒酵母S.cerevisiae424A(LNH-ST)为例进行发酵实验(同实施例5)，所述发酵产乙醇的方法具体包括：酶解木质纤维素原料制得木质纤维素原料酶解液的步骤、种子培养的步骤、菌种扩大培养的步骤，以及发酵产乙醇的步骤，具体包括：

A、酶解木质纤维素原料制得木质纤维素原料酶解液的步骤

同实施例5，区别在于，本实施例中所使用的木质纤维素原料为纸、树叶和燕麦壳。

B、种子液培养步骤

配制YEPD培养基，将保存的上述热带假丝酵母菌体接种至YEPD培养基中，控制温度30℃、pH6.0、转速200rpm、通气量0.2L/L.min，培养20h，至上述菌种浓度为(0.2-0.3)×10⁹/ml；

所述YEPD培养基具体含酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L，并调节pH6.0-6.5。

C、扩大培养步骤

同实施例6；

区别在于：本实施例的一级扩大培养基采用玉米糖化醪：含玉米糖化醪4wt％，灭菌后加入3g/L尿素。

D、发酵产乙醇步骤

取扩大培养结束后的扩培液，按照8％(v/v)的接种量接种至含有发酵培养基的5立方米的发酵罐中，控制温度37℃、pH4.8、通气量0.2mL/L,间歇通气，通气时间为0.5h，间隔时间为6h；

发酵过程中采用微氧设备进行供氧；所使用的发酵培养基与实施例7相同。

实施例9

本实施例所述菌种的种子液培养、扩大培养一级发酵培养的方法及参数以及种子液培养基、发酵液培养基和扩培液培养基的选择均与实施例7相同，其区别仅在于，在发酵培养的过程中，采用连续发酵培养的条件，控制发酵温度28℃，pH6.0，保持通气量0.5mL/L进行发酵72h，检测发酵产物。

检测上述实施例5-9的发酵产物含量，见下表。

显然，上述实施例仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。