一种肝微粒体中6α-羟基紫杉醇浓度的UPLC/MS/MS检测方法

摘要

本发明公开了一种肝微粒体中6α-羟基紫杉醇浓度的UPLC/MS/MS检测方法，包括以下步骤：(1)建立肝微粒体温孵体系，加入内标物系列浓度的6α-羟基紫杉醇对照品，制备标准曲线样品；(2)将标准曲线样品注入UPLC/MS/MS液质联用仪进行检测；根据检测结果得到6α-羟基紫杉醇的标准曲线；(3)按照步骤(1)相同的方法制备待测样品，将待测样品注入UPLC/MS/MS液质联用仪，按照步骤(2)相同的条件进行检测，根据标准曲线得到待测样品中的6α-羟基紫杉醇浓度。本发明检测方法分析时间短、灵敏度高、进样量小，符合方法学验证要求，适用于肝微粒体温孵样本中6α-羟基紫杉醇浓度的测定，具有广泛的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及药物的检测方法，具体涉及肝微粒体中6α-羟基紫杉醇浓度的 UPLC/MS/MS检测方法。

背景技术

CYP450酶是参与药物代谢的主要酶系，包括CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、 CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4等与药物代谢密切相关的同工酶。研究表明，大部分药 物-药物相互作用的发生与CYP450酶活性的诱导和抑制相关，其中主要由酶抑制引起。 利用体外方法进行药物代谢研究，可有效缩短新药研发周期，直接观察酶对底物的选择性 代谢和底物对酶的诱导和抑制，确定药物代谢途径，预测体内潜在的药物相互作用。目前， 常用的体外方法为探针药物法，该方法通过建立肝微粒体温孵体系，从而建立了药物代谢 研究模型。

6α-羟基紫杉醇是CYP2C8探针底物紫杉醇的代谢产物。因此，目前亟需一种肝微粒 体中6α-羟基紫杉醇浓度的检测方法。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种肝微粒体中6α-羟基紫杉醇浓度的UPLC/MS/MS 检测方法，包括以下步骤：

(1)建立肝微粒体温孵体系，加入内标物和系列浓度的6α-羟基紫杉醇对照品，制 备标准曲线样品；

(2)将标准曲线样品注入UPLC/MS/MS液质联用仪进行检测；

色谱条件如下：

色谱柱：C18色谱柱；

流动相：流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸乙腈溶液；

梯度洗脱条件为：

运行时间为3分钟；

质谱条件如下：

离子源：电喷雾离子源；

检测方式：正离子多反应监测；

根据检测结果得到6α-羟基紫杉醇的标准曲线；

(3)按照步骤(1)相同的方法，将底物紫杉醇与肝微粒体温孵体系共温孵，制备得 到含有内标物的待测样品，将待测样品注入UPLC/MS/MS液质联用仪，按照步骤(2)相 同的条件进行检测，根据标准曲线得到待测样品中的6α-羟基紫杉醇浓度。

其中，温孵的时间为20min。

优选地，所述内标物为邻甲苯海拉明。

优选地，所述色谱条件中，流动相的流速为0.3mL/min。

优选地，所述色谱条件中，柱温为40℃。

优选地，所述色谱条件中，色谱柱为ACQUITYUPLC-BEHC18色谱柱，规格为1.7μm, 2.1×50mm。

优选地，所述色谱条件中，进样量为1μL。

优选地，所述正离子多反应监测中，6α-羟基紫杉醇的母离子-子离子对为m/z870.41→ m/z286.05，锥孔电压为9V，碰撞电压为16V；邻甲苯海拉明的母离子-子离子对为m/z 270.10→m/z181.08，锥孔电压为15V，碰撞电压为12V。

优选地，所述质谱条件中，毛细管电压为3000V，离子源温度为150℃，去溶剂化 温度为350℃，去溶剂化气体流速为650L/h。

优选地，所述质谱条件中，锥孔气体流速为150L/h，雾化气压力为6.0bar。

优选地，所述步骤(1)的标准曲线样品制备方法为：将6α-羟基紫杉醇加入肝微粒 体温孵体系，所述肝微粒体温孵体系包含肝微粒体、葡萄糖-6-磷酸、葡萄糖-6-磷酸脱氢 酶、MgCl₂、PBS和NADP，再加入含内标的甲醇溶液，混匀，离心，取上清液，即得标 准曲线样品。

其中，标准曲线样品的制备可以按照下述方法进行：分别将系列浓度的对照标准品6α- 羟基紫杉醇加入肝微粒体温孵体系(包含肝微粒体、葡萄糖-6-磷酸、葡萄糖-6-磷酸脱氢 酶、MgCl₂、PBS和NADP)，再加入含内标的甲醇溶液，充分混匀3min，于4℃，13000rpm 离心10min，取上清液即得。肝微粒可以采用人、大鼠、小鼠、犬、恒河猴、食蟹猴的肝 微粒。

本发明专一地检测对肝微粒体中的6α-羟基紫杉醇浓度，色谱分析时间仅需3分钟， 进样量仅需1μL，分析时间短、灵敏度高、进样量小。同时，本发明检测方法专属性强、 基质效应小、线性和范围广、批内和批间准确度与精密度高、进样盘稳定性高、工作液稳 定性高，符合方法学验证要求，适用于肝微粒体温孵样本中6α-羟基紫杉醇浓度的测定， 具有广泛的应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离 本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。 但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实 现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

所用肝微粒体为人肝微粒体。

图1为母离子和锥孔电压的优选结果。

图2的质谱条件为：离子对：m/z870.41→m/z105.07，锥孔电压9V，碰撞电压46V。

图3的质谱条件为：离子对：m/z870.41→m/z122.09，锥孔电压9V，碰撞电压32V。

图4的质谱条件为：离子对：m/z870.41→m/z286.05，锥孔电压9V，碰撞电压16V， 也即本发明的质谱条件。

图5空白样本的色谱图。

图6LLOQ(定量下限)样本色谱图。

图7为待测样本色谱图。

图8为6α-羟基紫杉醇典型标准曲线。

具体实施方式

实施例1

所述试剂和仪器均来自市售的商品。

1、对照品及内标

6α-羟基紫杉醇(OH-TX)：分子量869.91，纯度95％，批号3-WXT-24-2(TCR)；

柠檬酸邻甲苯海拉明(IS,正离子内标)：纯度99％，批号048F0510V(sigma-aldrich)。

2、主要仪器

3、试验所用主要软件

UNIFI1.6.1：UPLC/MS/MS数据采集及浓度计算。

4、检测方法

(1)制备对照样品，加入内标物；

(2)将对照样品注入UPLC/MS/MS液质联用仪进行检测；检测条件如下：

色谱柱：ACQUITYUPLC-BEHC18,1.7μm,2.1×50mm(Waters公司)

流动相：A：0.1％甲酸水溶液

B：0.1％甲酸乙腈溶液

流速：0.3mL/min

柱温：40℃

进样盘温度：4℃

离子源：电喷雾离子化源(ESI)；

内标(IS)：10ng/mL邻甲苯海拉明甲醇溶液

梯度洗脱：

进样量：1μL

运行时间：3min

保留时间：t_R(OH-TX)≈1.70min；t_R(IS)≈1.57min

毛细管电压(Capillaryvoltage)：3.00kV

离子源温度(SourceTemperature)：150℃

去溶剂化温度(DesolvationTemperature)：350℃

去溶剂化气体流速(Desolvationgasflow)：650L/h

锥孔气体流速(Conegasflow)：150L/h

雾化气压力(Nebulizergaspressure)：6.0bar

检测方式：正离子多反应监测(MRM)

离子对：m/z870.41→m/z286.05(OH-TX)，m/z270.10→m/z181.08(IS)

锥孔电压(Conevoltage)：9V(OH-TX)和15V(IS)

碰撞电压(Collisionenergy)：16V(OH-TX)和12V(IS)

根据检测结果得到6α-羟基紫杉醇的标准曲线；

(3)按照步骤(1)相同的方法，将底物紫杉醇与肝微粒体温孵体系共温孵20min， 制备得到含有内标物的待测样品，将待测样品注入UPLC/MS/MS液质联用仪，按照步骤 (2)相同的条件进行检测，根据标准曲线得到待测样品中的6α-羟基紫杉醇浓度。

在确定本发明的检测方法各项工艺参数中，发明人对本发明方法的色谱条件和质谱条 件进行了筛选，结果如图1-4所示。

图1为母离子和锥孔电压的优选结果。

三种离子对的检测结果如下：

(1)图2的质谱条件为：

离子对：m/z870.41→m/z105.07，锥孔电压9V，碰撞电压46V。

结果显示强度为6456422。

(2)图3的质谱条件为：

离子对：m/z870.41→m/z122.09，锥孔电压9V，碰撞电压32V。

结果显示强度为4879034。

(3)图4的质谱条件为：

离子对：m/z870.41→m/z286.05，锥孔电压9V，碰撞电压16V，也即本发明的质谱 条件。

结果显示强度为4317210。

综合考虑上述图谱和强度的结果，本发明的检测方法最佳。

5、方法学考察

分别考察了本发明检测方法的专属性、基质效应、线性和范围、批内和批间准确度与 精密度、进样盘稳定性、工作液稳定性等。具体如下：

5.1专属性

分别取肝微粒，制备空白温孵体系样本，考察内源性物质对待测物和内标的影响。空 白样本中内源性物质的干扰不应超过待测物定量下限(LLOQ)的20％和内标响应的5％。

空白样本、6α-羟基紫杉醇及内标邻甲苯海拉明的典型色谱图如图5-7所示。

结果显示，肝微粒温孵体系中内源性物质对6α-羟基紫杉醇及内标邻甲苯海拉明无影 响。

5.2基质效应

制备空白肝微粒体温孵体系样本，分别加入低、中、高三个浓度的待测物对照品工作 液和内标，同时制备不含基质样品，考察其基质效应，不应超过85％～115％。

结果如表1所示。

表16α-羟基紫杉醇基质效应考察

结果显示，6α-羟基紫杉醇基质效应为92.8％～100.0％％，基质效应小，证明本发明方 法有效克服了基质效应。

5.3标准曲线

标准曲线：配制一定浓度梯度的待测物标准曲线样品，以待测物与内标峰面积的比值 为纵坐标(y)，浓度为横坐标(x)，经加权最小二乘法(W＝1/x²)回归计算线性方程。

结果如表2和图8所示。

表26α-羟基紫杉醇标准曲线

结果显示，本发明检测方法在0.005～1μM范围内，线性关系良好。

5.4定量下限

平行配制5份定量下限样本(标准曲线最低浓度)，测定浓度的平均值偏差应在理论 浓度±20％以内。

结果如表3所示。

表36α-羟基紫杉醇定量下限

结果显示，本发明检测方法的定量下限为0.005μM，灵敏度高。

5.5批内及批间准确度和精密度

准确度与精密度：配制低、中、高三个浓度的质控样本。每个浓度平行配制5份，连 续测定3批，以当批标准曲线计算其浓度，批内和批间准确度偏差Dev％((测定浓度-理 论浓度)/理论浓度×100)不超过±15％，精密度RSD％小于15％。

结果如表4所示。

表46α-羟基紫杉醇批内及批间准确度和精密度

结果显示，批内和批间准确度(Dev％)在-8.25％～8.00％之间，精密度(RSD％)在 0.00％～6.85％之间。

5.6进样盘放置稳定性

进样盘稳定性：质控样本在进样盘内放置一定时间后重新进样检测。

结果如表5所示。

表56α-羟基紫杉醇4℃进样盘放置稳定性

结果显示，在4℃进样盘放置3天稳定。

5.7工作液稳定性

结果如表6所示。

表66α-羟基紫杉醇工作液稳定性

结果显示，工作液于2～8℃放置49天稳定。

实施例2本发明方法的应用

1、酶动力学试验

测定酶动力参数时，探针底物的浓度通常选择1/3Km～3Km之间，代谢速率应与 反应时间成线性，且被代谢的底物应小于10％。在能生成可定量的代谢物的情况下应采 用尽可能低的蛋白浓度以降低非特异性结合。结合文献报道的Km及预试验结果，选取肝 微粒体蛋白浓度为0.2mg/mL，探针底物紫杉醇浓度分别为1、1.5、2、5、8、10、20和 40μM。

温孵体系介质为0.1M磷酸缓冲液(PBS)，包含探针底物、肝微粒体(终浓度 0.2mg/mL)和NADP再生系统(终浓度为10mMG-6-P，1U/mLG-6-PDH，10mMMgCl2， 0.5mMNADP)，终体积200μL，有机溶剂含量不超过1％。先分别将不同浓度的探针底 物与肝微粒体、G-6-P、G-6-PDH、MgCl₂、PBS混匀后37℃预温孵5min，然后加入NADP (37℃预温孵)启动反应，反应20min后加入含内标的甲醇溶液(冰浴)200μL终止反 应，充分混匀3min，于4℃，13000rpm离心10min，取上清液以本发明的方法测定紫杉 醇的代谢物6α-羟基紫杉醇生成量，分别计算各底物浓度酶反应速率，通过非线性回归酶 动力学模型计算酶动力学参数Km、Vmax。

2、抑制效应试验

温孵体系介质为0.1MPBS，包含探针底物、抑制剂、肝微粒体(终浓度0.2mg/mL) 和NADP再生系统(终浓度为10mMG-6-P，1U/mLG-6-PDH，10mMMgCl₂，0.5mM NADP)，终体积200μL，有机溶剂含量不超过1％。选取的底物紫杉醇浓度分别为1、1.5、 2、5、8、10、20和40μM，特异性抑制剂槲皮素浓度0.5、1、5和10μM。先将不同浓 度探针底物和不同浓度抑制剂与肝微粒体、G-6-P、G-6-PDH、MgCl₂、PBS混匀后37℃ 预温孵5min，然后加入NADP(37℃预温孵)启动反应，20min后加入含内标的甲醇溶 液(冰浴)200μL终止反应，充分混匀3min，于4℃，13000rpm离心10min，取上清液 以本发明方法测定6α-羟基紫杉醇的生成量。计算各浓度水平酶反应速率，通过非线性回 归酶动力学抑制模型拟合，判断抑制类型并计算抑制常数Ki。

综上所述，本发明检测方法专属性强、基质效应小、线性和范围广、批内和批间准确 度与精密度高、进样盘稳定性高、工作液稳定性高、，符合方法学验证要求，适用于肝微 粒体温孵样本中6α-羟基紫杉醇浓度的测定，具有广泛的应用前景。