紫叶李叶片花青素含量的测定方法

摘要

本发明公开了一种紫叶李叶片花青素含量的测定方法，属于精准农业中作物生长信息无损监测技术领域。该方法采用高光谱辐射仪测定紫叶李叶片的反射光谱数据，室内测定叶片花青素含量，然后将紫叶李叶片反射光谱数据与花青素含量数据相融合，通过相关分析确定花青素的敏感波长，构建基于特征波长的花青素含量光谱监测模型，再采用光谱辐射仪测定待测紫叶李叶片在特征波长的反射光谱数据，将数据代入花青素含量光谱监测模型中，计算得到紫叶李叶片的花青素含量；该方法简单、高效、实用，准确度高，能实现叶片无损检测，适用于不同树龄、不同颜色样品的原位重复测量及大区域监测。

说明书

技术领域

本发明涉及一种紫叶李叶片花青素含量的测定方法，属于精准农业中作物生长信息无损监测技术领域。

背景技术

花青素是水溶性的黄酮类化合物，它是植物叶片色素中第三类主要色素，是一种具有多重生理功能的植物次生代谢物。通常，花青素的有效积累是由许多环境胁迫引起的，包括强光、中波紫外线照射、低温、干旱、损伤、细菌及真菌感染、氮和磷的缺乏、某些除草剂及污染物等，尤其在植物幼小和衰老叶片中含量丰富。花青素能够修复叶片的光环境，具有潜在地调节光合作用和限制光抑制与光漂白作用的能力，以及对光破坏的防御能力。花青素可以作为渗透调节物质，提高植物抗冰冻与抗干旱胁迫的能力。此外，花青素还具有抗氧化作用，有助于修复损伤后的叶片。

传统的花青素含量测定主要采用湿化学法，包括用溶剂提取叶片中花青素，分光光度计测定花青素在溶剂中的吸光度，将测定的吸光度值转换成花青素含量等步骤。该方法能够准确测定叶片中花青素的含量，但是存在劳动强度大，测量费时、费力，需要对叶片进行破坏，不能进行原位重复测量及大区域监测等问题。因此，亟需一种简单、准确、高效、实用的花青素含量测定方法。已有研究表明，植物色素能够选择性地吸收或反射特定波长的光，利用光谱吸收或反射检测技术替代破坏性的、费时费力的湿化学法，将有利于植物色素的快速、无损估测。目前，基于高光谱监测模型的紫叶李叶片花青素测定还未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种简单、准确、高效、实用的紫叶李叶片花青素含量测定方法。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：

紫叶李叶片花青素含量的测定方法，步骤如下：采用高光谱辐射仪测定紫叶李叶片在特征波长的反射光谱数据，将测得的反射光谱数据代入花青素含量光谱监测模型中，计算得到紫叶李叶片的花青素含量。

所述花青素含量光谱监测模型的建立包括以下步骤：

1)取样与数据采集

采集不同树龄的紫叶李叶片，将颜色均匀一致的多个叶片组成一个叶片样本，分别测定每一个样本中叶片的花青素含量和反射光谱数据；

2)数据预处理

对于一个叶片样本，先对反射光谱数据重采样至1nm，再分别计算花青素含量和重采样反射光谱数据的均值，并记为一组样本数据，将得到的多组样本数据按照花青素含量大小排序，形成一个数据集；

3)确定特征波长

对数据集中的花青素含量和反射光谱数据作相关分析，相关系数最大且双尾检验达到极显著水平(此时二者之间的相关性最大)；

4)建模与验模

利用花青素含量与特征波长的反射光谱数据拟合公式，得到花青素含量光谱监测模型，验模，即得。

步骤1)中测定花青素含量可采用本领域常规方法，优选0.1mol/L盐酸甲醇低温浸提分光光度法，步骤如下：将破碎的紫叶李叶片置于0.1mol/L盐酸酸化甲醇(每升甲醇中含有0.1molHCl)中浸提(如在45℃下浸提2次，每次浸提2h)，浸提完毕离心取上清液(或合并上清液)，分光光度计测定上清液(或上清液定容后溶液)在特定波长处的光密度值，计算得到紫叶李叶片中花青素含量(特定波长取530nm、620nm、650nm时，计算方法参见：熊庆娥,叶珍,杨世民,等.植物生理学实验教程[M].成都:四川科学技术出版社,2003:94-95)。

步骤1)中测定反射光谱数据可采用高光谱辐射仪，如美国SpectraVista公司生产的SVCHR-1024i便携式光谱仪，波段值350～2500nm，350～1000nm波段的光谱分辨率≤3.5nm，1000～1850nm波段的光谱分辨率≤9.5nm，1850～2500nm波段的光谱分辨率≤6.5nm。

步骤2)中多组样本数据优选350～1000nm波段的反射光谱数据，这是因为花青素主要对紫外、可见光波段响应，其他波段可不作考虑。

步骤3)中特征波长为560nm。

步骤4)中建模、验模分别采用数据集中2/3、1/3数据进行。

步骤4)中花青素含量与特征波长的反射光谱数据拟合可采用Excel、SPSS等软件。

步骤4)中采用复相关系数(R²)评价花青素含量光谱监测模型，满足R²＞0.8时模型构建合适。同时，采用独立样本检验验证模型的准确性和稳定性，评价指标选用复相关系数(R²)、均方根误差(RMSE)和预测残差偏差(RPD)，满足R²＞0.8、RMSE＜0.5μmol/g、RPD＞2时模型构建成功。

上述评价指标的计算公式如下：

式1：$>R^2{=\underset{1}{\overset{n}{\Sigma }}\left({\hat{y}}_i-\bar{y}\right)}^2/\underset{1}{\overset{n}{\Sigma }}{(y_i-\bar{y})}^2;$>

式2：$>RMSE=\sqrt{\underset{1}{\overset{n}{\Sigma }}{({\hat{y}}_i-y_i)}^2/n};$>

式3：$>RPD={\mathrm{SD}}_V/{\mathrm{RMSE}}_V\sqrt{n/(n-1)};$>

式中：为预测值；为观测值的均值；y_i为观测值；n为样本数，i为正整数，i＝1,2,…,n；SD_V为验证集的标准偏差；RMSE_V为验证集的均方根误差。

优选的，花青素含量光谱监测模型可采用下式Ⅰ所示模型。

式Ⅰ：y＝0.0189x^-1.678，R²＝0.823；

式中：y：叶片花青素含量，μmol/g；x：560nm波长处的反射光谱数据；

模型验证的评价指标为：复相关系数R²＝0.876，均方根误差RMSE＝0.370μmol/g，预测残差偏差RPD＝2.542。

本发明的有益效果：

本发明中紫叶李叶片花青素含量的测定方法简单、高效、实用，准确度高，能实现叶片无损检测，适用于不同树龄、不同颜色样品的原位重复测量及大区域监测。该方法采用高光谱辐射仪测定紫叶李叶片的反射光谱数据，室内测定叶片花青素含量，然后将紫叶李叶片反射光谱数据与花青素含量数据相融合，通过相关分析确定花青素的敏感波长，构建基于特征波长的花青素含量光谱监测模型(如式Ⅰ所示，该模型简单，具有良好的稳定性和适应性，准确性高)，再采用光谱辐射仪测定待测紫叶李叶片在特征波长的反射光谱数据，将数据代入花青素含量光谱监测模型中，计算得到紫叶李叶片的花青素含量，达到监测的目的。

附图说明

图1为实施例1中紫叶李叶片花青素含量光谱监测模型的构建流程示意图；

图2为花青素含量预测值与测量值的散点图及拟合曲线。

具体实施方式

下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。

实施例1

本实施例中紫叶李(Prunuscerasifera)叶片花青素含量的测定方法，包括以下步骤：

一、建立紫叶李叶片花青素含量光谱监测模型(流程示意图见图1)

1)取样与数据采集

采集不同树龄的紫叶李叶片，叶片基于可视化特征随机选择，颜色从绿、微红到完全红，且健康、无损伤，将颜色均匀一致的3个叶片组成一个叶片样本，分别测定每一个样本中同一个叶片的花青素含量和反射光谱数据；

花青素含量的测定方法为：取紫叶李叶片用水洗净去杂、吸干，剪成2×5mm长条状碎片，准确称取0.15g，加入0.1mol/L盐酸酸化甲醇10mL，在45℃下浸提2次，浸提时间为2h，浸提后在5000r/min下离心分离，合并2次离心上清液，过滤，即得花青素提取液，将提取液定容至50mL，分光光度计测定定容后花青素提取液在530nm、620nm、650nm波长下的光密度值，计算得到紫叶李叶片中花青素含量；

反射光谱数据采用美国SpectraVista公司生产的SVCHR-1024i便携式光谱仪采集，波段值350～2500nm，350～1000nm波段的光谱分辨率≤3.5nm，1000～1850nm波段的光谱分辨率≤9.5nm，1850～2500nm波段的光谱分辨率≤6.5nm；

2)数据预处理

对于一个叶片样本，先对反射光谱数据重采样至1nm，再分别计算花青素含量和重采样反射光谱数据的均值，并记为一组样本数据，由于花青素主要对紫外、可见光波段响应，预处理仅选取350～1000nm波段的反射光谱数据，其他波段暂不作考虑，再将得到的多组样本数据按照花青素含量由小到大排序，形成一个数据集，如下表1所示；

表1紫叶李叶片花青素含量及光谱数据(部分)

3)确定特征波长

对数据集中的花青素含量和反射光谱数据作双变量相关分析(SPSS软件)，结果显示560nm波长处的相关系数最大(等于0.80037)，且双尾检验达到极显著水平(等于0.000)，因此选择560nm波长为特征波长；

4)建模与验模

在数据集中选取2/3的数据作为校正集(此处校正集即为建模数据)，1/3的数据作为验证集，在SPSS软件中，利用花青素含量与特征波长的反射光谱数据拟合公式，得到如下式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ所示的花青素含量光谱监测模型，由于式Ⅱ、式Ⅲ中R²＜0.8，后续采用独立样本检验验证模型准确性和稳定性时不对这两个模型进行验证；

式Ⅰ：y＝0.0189x^-1.678，R²＝0.823；

式中：y：叶片花青素含量，μmol/g；x：560nm波长处的反射光谱数据；

式Ⅱ：y＝350.1x²－96.67x+6.877，R²＝0.795；

式中：y：叶片花青素含量，μmol/g；x：560nm波长处的反射光谱数据；

式Ⅲ：y＝－32.70x+4.317，R²＝0.644；

式中：y：叶片花青素含量，μmol/g；x：560nm波长处的反射光谱数据；

以预测花青素含量为横坐标、实测花青素含量为纵坐标建立回归方程(见下式a)，花青素含量预测值与测量值的散点图及拟合曲线见图2；

式a：y＝1.018x+0.133，R²＝0.876；

式中回归方程的截距与斜率比较接近于0和1，说明该单波长模型的预测效果较好；

模型验证的评价指标为：复相关系数R²＝0.876，说明模型准确度达87.6％；均方根误差RMSE＝0.370μmol/g，说明模型预测误差较小；预测残差偏差RPD＝2.542；表明该模型稳定、准确，可用于紫叶李叶片花青素含量预测；

二、紫叶李叶片花青素含量测定

采用美国SpectraVista公司生产的SVCHR-1024i便携式光谱仪测定待测紫叶李叶片在560nm特征波长的反射光谱数据，将测得的反射光谱数据代入式Ⅰ所示的花青素含量光谱监测模型中，计算得到紫叶李叶片的花青素含量，见下表2。

表2监测得到的反射光谱与预测和实测的花青素含量(部分)

样本号560nm处反射光谱预测花青素含量μmol/g实测花青素含量μmol/g10.17280.35960.405520.09381.00250.997630.08611.15751.164340.07761.37811.477950.05752.27902.438660.04483.46433.375370.04084.05303.9595

本实施例中紫叶李叶片花青素含量光谱监测模型的稳定性、适应性良好，准确性高，适用于不同树龄、不同颜色样品的原位重复测量及大区域监测。