用于判定急性移植物抗宿主病风险的方法

摘要

本发明涉及用于判定候选人类移植供体是否具有在人类移植受体中诱导急性移植物抗宿主病(aGVHD)风险的方法，其继而允许选择对受体无风险的供体。本发明还涉及，在进行本发明用于判定风险的方法之后，移植物移植术之后用于调节施用至人类移植受体的免疫抑制治疗的方法。方法包括扩增候选供体的iNKT细胞(恒定型NKT细胞)，并判定CD4(-)iNKT细胞亚群扩增的存在与否。具体地，判定CD3+CD4-TCRV[α]24V[β]11细胞。公开了试剂盒。

说明书

技术领域

本发明涉及用于预测急性移植物抗宿主病风险的方法和相应产品(如试剂 盒)，以及用于选择移植供体和用于调节与这种风险预测相关联的治疗的相应方 法。

背景技术

恶性血液病的一线疗法一般包括化学疗法和/或使用单克隆抗体的化学免疫疗 法。然而，一些患者经历复发或疾病进展，有时为标准治疗所难以治疗。

包括同种异体干细胞移植(SCT)的免疫疗法代表对这些难以治愈或者不太可 能使用标准化学治疗治愈的患者的替代治疗方法。造血干细胞移植(HSCT)是这 样一种疗法，其涉及从供体或脐带血取得造血干细胞，并将其静脉输注至经调节 以接受移植的受体中。然而，因为严重的移植后并发症包括移植物抗宿主病 (GVHD)，移植后的总体生存率仍然仅在40％至60％之间。GVHD是由转移或 移植的免疫活性细胞(例如，成熟T细胞)针对宿主组织的免疫反应引起的疾病 的总称，并且在某些情况下能诱发严重器官毒性导致死亡。

因此，人类白细胞抗原(HLA)匹配是减少移植物排斥和GVHD风险所必不 可少的。然而，非HLA基因也影响到移植结果，甚至在接受来自HLA相同匹配 同胞供体(MSD)的移植的患者中GVHD也可能是致命的。此外，MSD仅可用 于大约三分之一患者，因此，替代性供体是必要的。更广泛的使用HLA匹配不相 关供体(MUD)而不是脐带血或不匹配的相关供体，但在接受来自MUD的移植 的患者中，也必须考虑GVHD的风险。

因此，仍然需要一种方法用于预测在接受移植的患者中发展为GVHD的风险 (或反之，用于判定候选供体是否具有在受体中诱导GVHD的风险的方法)。

最近，两个回顾性研究，通过分析同种异体HSCT(Rubio等人，Blood2012) 或供体移植物(Chaidos等人，2012年)的受体外周血干细胞(PBSC)中效应物 和调节性淋巴细胞的频率分布，证明了恒定型(invariant)NKT(iNKT)细胞在 预测急性移植物抗宿主病(aGVHD)中的临床相关性。在受体中iNKT细胞的损 伤重构或在移植物中低CD4-iNKT细胞剂量被证明表示独立的参数，其能够显著 预测HSCT后aGVHD的发生。

然而，医生并不满足于基于在血液或iNKT细胞的移植物样本中直接判定发展 aGVHD的风险的预测方法，因为难以确定在低和高iNKT细胞之间的阈值，例如 导致对中间结果误判的风险。

发明内容

在第一方面，本发明涉及用于判定候选人类移植供体是否具有在人类移植受 体中诱导急性移植物抗宿主病(aGVHD)风险的方法，包括以下步骤：i)对获自 候选人类移植供体的生物样本的恒定型NKT(iNKT)细胞群体进行扩增；ii)检 测在步骤i)中获得的群体中CD4-iNKT细胞亚群扩增的存在与否；以及iii)当没 有从iNKT细胞群体中扩增出亚群CD4-iNKT细胞时，推断出候选人类移植供体 具有在人类移植受体中诱导aGVHD的增加的风险。

在第二方面，本发明涉及用于选择人类移植供体以在人类移植受体中减少诱 导aGVHD风险的方法，包括以下步骤(i)进行根据本发明的用于判定风险的方 法，以及(ii)根据所述风险判定选择所述供体。

在第三方面，本发明涉及在人类移植受体进行移植物移植术之后用于调节施 用至人类移植受体的免疫抑制治疗的方法，包括下列步骤(i)进行根据本发明的 用于判定风险的方法，以及(ii)调节免疫抑制治疗。

在另一方面，本发明还涉及用于实施根据本发明的上述方法的试剂盒。

具体实施方式

本发明人已经证明，在分析CD4-iNKT细胞亚群的扩增能力(expansion capacity)之前，将获自候选供体的PBSC移植物或血液样本的iNKT细胞群体扩 增12或15天的在先步骤，允许安全地判定所述候选供体是否具有在受体中诱导 急性GVHD的风险。事实上，在所述扩增之后，只有两个不同的可能：没有从iNKT 细胞群体中扩增出CD4-iNKT细胞亚群(扩增因子≤1)，因此供体具有在受体中诱 导急性GVHD的增加的风险，或者从iNKT细胞群体中显著地扩增出CD4-iNKT 细胞亚群(扩增因子>1)，因此供体几乎没有在受体中诱导急性GVHD的风险。

判定急性移植物抗宿主病(aGVHD)风险的方法：

因此，在第一方面，本发明涉及用于判定候选人类移植供体是否具有在人类 移植受体中诱导急性移植物抗宿主病(aGVHD)的风险的方法，包括以下步骤：i) 对获自候选人类移植供体的生物样本的恒定型NKT(iNKT)细胞群体进行扩增； ii)检测在步骤i)中获得的群体中亚群CD4-iNKT细胞扩增的存在与否；以及iii) 当没有从iNKT细胞的群体扩增出CD4-iNKT细胞亚群时，结论是候选人类移植 供体具有在人类移植受体中诱导aGVHD的增加的风险。

如本文所用，术语“风险(risk)”指将在特定时间段发生某事件的可能性，如 急性GVHD(aGVHD)的发作，并且可以指受试者“绝对”风险或“相对”风险。可 参照针对相关时间群(cohort)的实际观察后测量(post-measurement)来测量绝对 风险，或者参照针对相关时间段所遵循的统计学上历史上有效的群所得出的指数 值来测量绝对风险。相对风险是指受试者的绝对风险相较于低风险群的绝对风险 或平均群体风险相比的比率，这种比率随着临床风险因素评估方式的不同而不同。 通常使用优势比来进行no-转换(no-conversion)，优势比为对给定的测试结果而言 阳性事件相对阴性事件的比例(优势比根据式p/(1-p)，其中p为事件的概率 (probability)，(1-p)表示不发生事件的概率)。

在本发明内容中“风险判定”包括预测事件可能发生的概率、优势比或者可能 性。风险判定也可包括预测未来临床参数、传统实验室风险因子值或aGVHD的其 它指数等，如年龄、性别不匹配、HLA-测试等...；参考预先测量群体的绝对或相 对的项(term)。本发明的方法可以用来分类测量移植受体中诱导aGVHD的风险， 继而定义移植供体种类(category)的风险范围(spectrum)将移植供体定义为是 否具有诱导aGVHD的风险，从而用于选择安全的供体。

如本文所用，术语“移植供体”是指提供待移植的器官、组织或细胞的受试者。 如本文所用，术语“移植受体”是指将接受待移植的器官、组织或细胞的受试者。如 本文所用，术语“移植(transplant)”(或“移植物(graft)”)指的是，移植到受试者 中之后，游离(未附着的)细胞、组织或器官整合到组织中。造血干细胞移植(HSCT) 的上下文中，移植是多能造血干细胞，其通常是来自于G-CSF动员(mobilization) 之后的外周血、骨髓或脐带血。

如本文所用，术语“生物样本”是指分离自受试者(例如，移植供体)的任何样 本，优选含有外周血单核细胞(PBMC)的样本。这类样本的实例包括体液、组织、 细胞样本、器官、活组织检查等。最优选的样本是血液样本、脐带血样本或移植 样本(如外周血干细胞(PBSC)移植物样本或骨髓(BM)移植物样本)。

如本文所用的术语“血液样本”指包括全血、血浆和血清的样本。

如本文所用，术语“NKT细胞”(自然杀伤T细胞)是指淋巴细胞的亚群，更 具体来说CD1d限制的T细胞的唯一子集，其提供先天和适应性免疫应答之间的 连接。事实上，共表达T细胞受体和NK细胞标记物的NKT细胞对于各种免疫疾 病(包括自身免疫性疾病、感染性疾病和癌症)的若干方面是必不可少的。传统 的T细胞识别由主要组织相容性复合体(MHC)MHC1类或MHC2类呈递的小 肽抗原，与其不同的是NKT细胞识别CD1d(MHC1类样分子)所呈递的糖脂抗 原。

如本文所用，术语“iNKT”(恒定型NKT细胞)指的是NKT细胞的主要子集， 也被称为1型NKT细胞，其表达恒定型天然T细胞受体(TCR)，所述TCR在小 鼠中由V[α]14-J[α]18链组成(在人中由Ⅴ[α]24-J[α]18组成)。通过配体例如α-半 乳糖神经酰胺刺激TCR，iNKT细胞迅速产生很多细胞因子，包括IL-4、IFN-[γ]、 IL-12和GM-CSF。还应当指出的是，iNKT细胞包括两个主要子集(或亚群)，即 CD4+和CD4-细胞，其在人类中具有不同细胞因子分泌谱(profile)。这种对配体 快速和强效应答使得iNKT细胞能够增强或调节在先天性和获得性免疫中各种免 疫细胞的活性。

在一个实施方案中，aGVHD是Ⅱ-Ⅳ级的aGVHD。

在一个实施方案中，候选人类移植供体是HLA相同匹配的同胞供体(MSD)。 在另一个实施方案中，候选人类移植供体是HLA匹配的无关供体(MUD)。在又 一个实施方案中，候选人类移植供体是无关的不匹配供体。移植物也可以来自单 倍同一性(haploidentical)的供体或来自4/6至6/6HLA(A、B、DR)兼容脐带 血。

在一个实施方案中，CD4-iNKT细胞的亚群是CD3+CD4-TCRVα24Vβ11细 胞的群体。

可以通过不同的方法使用本领域技术人员已知的非特异性或抗原特异性刺激 来进行扩增iNKT细胞群体的步骤(i)。通常地，通过使用糖脂抗原(例如，α-半 乳糖神经酰胺(α-GalCer))来培养iNKT细胞群体可以获得所述扩增。

如本文所用，术语“扩增(expanding)”指活化和扩大给定细胞群体(如免疫 细胞，例如T细胞)的过程。优选地，通过在T细胞和/或抗原特异性刺激剂，或 者如抗原、细胞、抗体、凝集素等存在时培养含T细胞的细胞群体来扩增T细胞。 扩增还需要在细胞因子存在下培养T细胞。

通过技术人员可用的各种检测具体免疫细胞群体的方法可以进行检测CD4- iNKT细胞亚群扩增的存在与否的步骤(ii)，所述方法包括免疫选择技术，如使用 流式细胞方法的高通量细胞分选，采用抗体标记磁珠、可生物降解的珠、非生物 降解珠的亲和方法，以及这些方法的组合。

如本文所用，术语“流式细胞方法”是指通过将细胞悬浮在流体流中并使细胞通 过电子检测装置来计数感兴趣细胞的技术。流式细胞方法允许对高达每秒数千颗 粒(paticle)进行物理和/或化学参数如荧光参数的同时多参数分析。现代的流式 细胞仪通常具有多个激光器和荧光检测器。流式细胞技术的常见变化是，基于颗 粒的性质对颗粒进行物理分选(sorting)，以便使用“荧光活化细胞分选”纯化或检 测感兴趣的群体。如本文所使用的，“荧光活化细胞分选”(FACS)是指这样一种 流式细胞方法，它将来自生物样本的异质细胞混合物分选至两个或更多个容器中， 其基于特定的光散射和每个细胞的荧光特征一次分选一种细胞，从而为来自个体 细胞的荧光信号提供快速、客观和定量的记录，以及提供对特别感兴趣细胞的物 理分离。因此，FACS可用在本文所述的方法中用于分离和检测CD4-iNKT细胞 亚群。

可替代地，可以使用基于分选方法的珠如磁珠进行免疫细胞群体(例如，iNKT 细胞)的分离和检测。

使用这种方法，相对于特定细胞表面标记物，可以对细胞进行正或负地分离 和检测。

如本文所定义，“正选择”指，导致分离和检测表达特定细胞表面标记物的细胞 的技术，而“负选择”是指导致分离和检测不表达特定细胞表面标记物的细胞的技 术。在一些实施方案中，可以由技术人员使用本领域已知的标准技术，如商业珠 偶联试剂盒用抗体来包被珠。在一些实施方案中，进行负选择步骤以除去表达一 种或更多谱系标记物的细胞，接着通过荧光活化细胞分选来正选择和检测iNKT细 胞的子集(即CD4-iNKT细胞)。

在这样的方法中，可以使用特异性结合细胞表面标记物或抗原的抗体或其它 试剂，如四聚体来分离和检测免疫细胞群体。

如本文所使用的，“特异性结合细胞表面标记物的试剂”是可特异性地与所述细 胞表面标记物反应或结合到所述细胞表面标记物的试剂，但很少或不与其它细胞 表面或细胞内标记物或抗原进行可检测到的反应。例如，特异性结合CD4的试剂 不会结合CD8。因此，特异性结合细胞表面标记物的试剂识别所述标记物的独特 结构特征。在一些实施方案中，特异性结合细胞表面标记物的试剂结合到细胞表 面标记物，但不会导致起始该细胞表面标记物介导的下游信号事件，例如非活化 性抗体。特异性结合细胞表面标记物的试剂包括，但不限于抗体或其抗原结合片 段、天然或重组的配体、小分子、核酸序列和核酸类似物、适体(aptamer)和其 它蛋白质或肽。

在一些实施方案中，优选的试剂是特异性结合细胞表面标记物的抗体，以及 可以包括多克隆和单克隆抗体、及其抗原结合的衍生物或其片段。公知的抗原结 合片段包括，例如，单结构域抗体(dAb；其基本上由单一VL或VH抗体结构域 所组成)，Fv片段包括单链Fv片段(scFv)、Fab片段、和F(ab')2片段。用于 构建这种抗体分子的方法是本领域公知的。因此，如本文所用，术语“抗体”指的是 完整的免疫球蛋白，或指具有Fc(可结晶片段)区或Fc区的FcRn结合片段的单 克隆或多克隆抗原结合片段。可以通过重组DNA技术或通过酶促或化学切割完整 抗体来制备抗原结合片段。尤其地，“抗原结合片段”包括Fab、Fab'、F(ab')2、 Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFV)、单结构域抗体、嵌合抗 体、双抗体和含有至少部分免疫球蛋白的多肽，其中所述部分免疫球蛋白足以赋 予多肽特异性抗原结合。术语Fab、Fc、pFC'、F(ab')2和Fv采用标准免疫学含 义(Roitt,I.(1991)EssentialImmunology,第七版,(BlackwellScientificPublications, Oxford)]。这样的抗体或抗原结合片段可以购自供应商，如R&DSystem、BD Biosciences、e-Biosciences、Proimmune和Miltenyi，或者可以通过本领域技术人 员公知的方法针对这些细胞表面标记物来生产。

在一些实施方案中，特异性结合到细胞表面标记物的试剂如抗体或抗原结合 片段，标记有标签以促进分离和检测免疫细胞或iNKT细胞群体。

如本文所用，术语“标记”或“标签”指能够产生指示靶标存在的可检测信号的组 合物，例如在生物样本中存在特定细胞表面标记物。合适的标记包括荧光分子、 放射性同位素、核苷酸发色团、酶、底物、化学发光部分、磁性颗粒、生物发光 部分等等。例如，标记可以是分离和检测免疫细胞或iNKT细胞群体的方法所需的 光谱学、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学方法可检测的任何组 合物。用于标记试剂的荧光标记或标签的非限制性实例，例如用于本发明方法的 抗体包括羟基香豆素、琥珀酰亚胺酯、氨基香豆素、琥珀酰亚胺酯、甲氧基香豆 素、琥珀酰亚胺酯、瀑布蓝、酰肼、太平洋蓝、马来酰亚胺、太平洋橙、荧光黄、 NBD、NBD-X、R-藻红蛋白(PE)、PE-Cy5缀合物(Cychrome、R670、Tri-Color、 QuantumRed)、PE-Cy7缀合物、红613、PE-德克萨斯红、PerCP、甲藻叶绿素蛋 白、TruRed(PerCP-Cy5.5缀合物)、FluorX、荧光素异硫氰酸酯(FITC)、BODIPY -FL、TRITC、X-罗丹明(XRITC)、丽丝胺(Lissamine)罗丹明B、德克萨斯红、 别藻蓝蛋白(Allophycocyanin)(APC)、APC-Cy7缀合物、AlexaFluor350、AlexaFluor 405、AlexaFluor430、AlexaFluor488、AlexaFluor500、AlexaFluor514、AlexaFluor 532、AlexaFluor546、AlexaFluor555、AlexaFluor568、AlexaFluor594、AlexaFluor 610、AlexaFluor633、AlexaFluor647、AlexaFluor660、AlexaFluor680、AlexaFluor 700、AlexaFluor750、AlexaFluor790、Cy2、Cy3、CY3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5 或Cy7。

在一个具体的实施方案中，CD3+CD4-TCRVα24Vβ11细胞的群体可以通过 使用以下进行检测：特异性结合CD4的标记试剂(例如，特异性结合CD4的标记 抗体)、特异性结合CD3的标记试剂(例如，特异性结合CD3的标记抗体)和特 异性结合iNKT细胞的CD1d限制的TCRVα24Vβ11的标记试剂(例如，糖脂预加 载的人CD1d四聚体，例如CD1d/PBS-57四聚体或购自ProImmune的那些)。

在一个实施方案中，扩增iNKT细胞的群体的步骤i)是通过以下进行：(a) 从所述候选人类移植供体所获得的生物样本中分离外周血单核细胞(PBMC)；和 (b)在既含有刺激iNKT细胞增殖的试剂又含有活化iNKT细胞的试剂的介质中 培养所述PBMC。

可以通过本领域技术人员公知的方法(通过密度离心，例如Ficoll-Paque^TM密 度梯度离心)进行步骤(a)从所述候选人类移植供体所获得的生物样本中分离外 周血单核细胞(PBMC)。

应在扩增iNKT细胞所需的必要时间中进行步骤(b)在既含有刺激iNKT细 胞增殖的试剂又含有活化iNKT细胞的试剂的介质中培养所述PBMC。

通常情况下，使用感兴趣的介质培养PBMC应进行至少10天，优选至少12 天，甚至更优选至少15天。

如本文所用，术语“介质”指的是用于维持细胞群体的介质，或用于培养细胞群 体的介质(例如，“培养介质”)，其含有维持细胞存活和支持增殖的营养物质。所 述介质可以以合适的组合包含下列中的任意：盐、缓冲液、氨基酸、葡萄糖或其 它糖、抗生素、血清或血清替代物，以及其它成分，如生长因子、细胞因子等。 本领域技术人员熟知通常用于特定细胞类型的介质。本发明的介质可以基于商业 上可获得的介质诸如来自Invitrogen的RPMI1640。

如本文所用，术语“刺激iNKT细胞增殖的试剂”是指可以增加iNKT细胞生长 的任何天然或合成的化合物。

有利的是，刺激iNKT细胞增殖的试剂选自IL-2、IL-7和IL-15。

在一个具体的实施方案，所述刺激iNKT细胞增殖的试剂是IL-2。优选地，IL-2 是重组人类白细胞介素-2(rhIL-2)。应该进一步指出的是，rhIL-2是用于药物用途 商业上可获得的。合适的商业形式包括，例如，重组人类IL-2组合物

如本文所用，术语“活化iNKT细胞的试剂”是指任何天然或合成的化合物，其 可结合CD1d并活化恒定型天然T细胞受体(TCR)，导致强烈产生Th1细胞因子 (例如，IFN-γ)和/或Th2细胞因子(如IL-4)，这些细胞因子随后又通过诱导树 突状细胞(DC)的成熟以及通过影响其它免疫细胞例如NK细胞、巨噬细胞和常 规T淋巴细胞的功能来扩增或调节先天/适应性免疫应答。

有利的是，活化iNKT细胞的试剂是糖脂抗原，尤其是鞘糖脂抗原，例如α- 半乳糖神经酰胺(α-GalCer)和类似物。

如本文所用，术语“α-半乳糖神经酰胺”(α-GalCer或(2S,3S,4R)-1-O-(α-D- 半乳糖)-N-hexacosanoyl-2-氨基-1,3,4-十八烷三醇(octadecanetriol)，也命名为 KRN7000)，是指一种海洋海绵衍生鞘糖脂，其是针对iNKT细胞的超级激动剂抗 原(在美国专利NO.5,936,076中所述)。

如本文所用，术语“α-GalCer类似物”是指任何天然或合成的化合物，其以不同 于α-GalCer的方式产生相同的细胞因子。因此，这类化合物包括α-GalCer衍生物 以及结构类似于α-GalCer的化合物，是本领域中技术人员所公知的。其它类似物， 例如在国际专利申请N°WO93/05055；WO94/09020；WO94/24142；WO94/02168和 WO98/44928中进行了描述。

在一个实施方案中，活化iNKT细胞的试剂是糖脂抗原，其选自α-半乳糖神 经酰胺(α-GalCer)、α-葡萄糖醛酸神经酰胺(glucuronosylceramide)、磷酸酰肌醇 四甘露糖苷(phosphatidylinositoltetramannoside)、异球三己糖基神经酰胺 (isoglobotrihexosylceramide)、神经节苷脂GD3、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷 脂酰肌醇、硫脂、β-半乳糖神经酰胺、脂磷酸聚糖(lipophosphoglycan)、糖肌醇 磷脂、α-半乳糖神经酰胺类似物包括β-异头半乳糖神经酰胺和α-异头半乳糖神经 酰胺，以及细菌脂质抗原。

在一个具体的实施方案中，活化iNKT细胞的试剂是α-GalCer。

通常，α-GalCer以范围1至500ng/mL的浓度，优选100ng/mL的浓度加入到 本发明的培养介质中。

通常情况下，IL-2以范围1至100ng/ml的浓度，优选50ng/ml的浓度加入到 本发明的培养介质中。

在优选的实施方案中，在第0天将α-GalCer加入到本发明的培养介质中，然 后在第1天将IL-2加入到培养介质中。

用于选择人类移植供体的方法：

本发明还提供了用于选择移植供体的方法。通过上述方法的方式获得的信息 可以用来在若干之前鉴定为兼容的供体中选择移植供体，以避免或尽量减少急性 GVHD的发展。

因此，在第二方面，本发明涉及为减少在人类移植受体中诱导急性GVHD的 风险而选择人类移植供体的方法，包括下列步骤：(i)进行根据权利要求1所述的 判定风险的方法，以及(ii)根据所述风险判定选择所述供体。

所述方法可以通过如下进行，例如，使用上述判定风险方法中的任意者，并 考虑所获得的结果，针对移植受体选择最佳的移植供体以减少急性GVHD的风险。 如果CD4-iNKT细胞亚群的扩增水平表明所述供体具有诱导GVHD的风险，可能 有必要鉴定另一兼容供体。

事实上，为限制在同种异体HSCT中移植干细胞排斥的风险或急性GVHD的 风险，所述供体优选应当与受体具有相同人类白细胞抗原(HLA)。通过从潜在供 体的血液中做额外HLA-测试来发现兼容的供体。HLA基因分两类(I型和II型)。 一般来说，I型基因的错配(即HLA-A、HLA-B或HLA-C)增加了移植物排斥的 风险。HLAII型基因的错配(即，HLA-DR或HLA-DQB1)增加了移植物抗宿主 病的风险。在HLA基因的三个或更多个位点上变异性的基础上进行匹配，优选在 这些位点上都有完美的匹配。即使在这些关键等位基因上都有良好的匹配，所述 受体将需要免疫抑制药物以减轻移植物抗宿主病。同种异体移植供体可以是相关 的(通常是密切HLA匹配的同胞或MSD)或不相关的(供体虽然不相关但发现 具有非常接近程度的HLA匹配或MUD)。不相关供体可以通过骨髓供体的注册中 找到，如国际骨髓供体计划。

用于调节免疫抑制治疗的方法：

本发明进一步提供了用于开发个性化治疗方案的方法。通过上述方法的方式 获得的信息可用于开发用于移植受体的个性化治疗方案。

因此，在另一方面，本发明涉及在移植物移植后用于调节施用至人类移植受 体的免疫抑制治疗的方法，包括如下步骤：(i)进行根据本发明的用于判定风险的 方法，和(ii)调节免疫抑制治疗。

所述方法可以通过如下进行，例如使用任何上述判定风险的方法，并考虑所 获得的结果，设计用于移植受体的治疗方案。如果CD4-iNKT细胞亚群的扩增水 平表明所述受体具有不希望的临床结果的风险(例如，发展为aGVHD)，所述受 体是使用有效量的免疫抑制治疗进行治疗的候选者(例如，通过抗排斥试剂)。取 决于CD4-iNKT细胞亚群的扩增水平(即所分析的生物样本中亚群扩增的存在 与否)，受体可能需要比标准方案更积极(aggressive)或更不积极的治疗方案，或 者可以判定受体最适于标准方案。当如此处理时，可以治疗或预防与移植相关的 并发症，如aGVHD。相反，CD4-iNKT细胞亚群的扩增水平可以指示所述患者不 太可能经历不期望的临床结果。在此情况下，患者可以避免免疫抑制治疗(或需 要较不积极的方案)及其相关的副作用。

根据本发明可以使用移植当中用来控制排斥的任何免疫抑制试剂，或这种试 剂的组合，如泼尼松(prednisone)、甲基泼尼松龙、硫唑嘌呤、环磷酰胺、环孢菌 素、抗T细胞的单克隆抗体如OKT3、以及针对人类淋巴细胞的抗血清(抗淋巴细 胞球蛋白ALS)或针对胸腺细胞的抗血清(抗胸腺细胞球蛋白ATG)。根据本发明 可使用的骨髓消融试剂的实例是白消安、二甲基马利兰(myleran)和塞替派。

根据本发明的试剂盒：

本发明还涉及适于进行根据本发明方法的试剂盒。这样的试剂盒可以包含如 上所述的至少a)刺激iNKT细胞增殖的试剂，b)活化iNKT细胞的试剂，和c) 特异性结合CD4的标记试剂。

在一个实施方案中，所述试剂盒包括至少IL-2、α-GalCer和特异性结合CD4 的标记抗体。

在具体的实施方案中，所述试剂盒进一步包括d)特异性结合CD3的标记试 剂(例如，特异性结合CD3的标记抗体)以及e)特异性结合iNKT细胞的CD1d 限制的TCRVα24Vβ11的标记试剂(例如，预载的人类CD1d四聚体，例如 CD1d/PBS-57四聚体或购自ProImmune的那些)。

所述试剂盒还可以包括用于实施根据本发明方法的一种或更多生化试剂(例 如，缓冲液，如PBS和洗涤缓冲液)。

将通过以下附图和实施例进一步说明本发明。然而，这些实施例和附图不应 被以任何方式解释为限制本发明的范围。

附图说明

图1：(A)总iNKT细胞的代表性FACS谱，所述iNKT细胞用抗CD3和载 有PBS57的CD1d四聚体染色(左)，或者作为阴性对照的空CD1d四聚体染色(右)； 以及(B)门控性(gated)iNKT细胞的CD4表达谱。

图2：表示来自供体移植物的CD4-iNKT细胞群体扩增的结果。(A)存在亚 群CD4-iNKT并在培养中从iNKT群体中扩增出，或者(B)亚群CD4-iNKT不 存在和/或在培养中没有从iNKT群体中扩增出。

图3：ROC分析预测II-IV级aGVHD的风险。(A)：移植物CD4-iNKT/T比 率的预测值，(B)和(C)：移植物CD4-iNKT细胞的扩增因子的预测值。

图4：发展为0-I级aGVHD的患者相对于发展为II-IV级aGVHD的患者的 PBSC移植物在培养第0天(A)和第15天(B)中CD4-iNKT细胞/孔的比较。

实施例

在移植后受体出现急性GVHD时，分析移植物含量以及来自移植物或HSCT 供体外周血的CD4-iNKT细胞的扩增能力

材料与方法

iNKT细胞扩增：来自血液或骨髓样本的供体PBMC以10⁶细胞每孔的密度在 RPMI1640介质中培养在24孔板中，所述RPMI1640介质含有100U/mL抗生素 (青霉素+链霉素)、10％FBS、2mM谷氨酰胺和10mMHEPES。在培养开始时 加入100ng/mL的α-半乳糖神经酰胺(KRN7000)，接着24小时后加入50ng/mL (或845UI/mL)的rhIL-2。2周后，收集细胞，彻底洗涤，并通过台盼蓝排除法 测定其生存能力。

表面染色：通过流式细胞术分析新鲜或培养的供体PBMC。在下列直接荧光 缀合的单克隆抗体存在时，在4℃进行PBMC染色30分钟：预载有α-GalCer的人 类CD1d四聚体(来自ProImmune)、抗人类CD3和抗人类CD4(来自eBioscience)。 细胞重新悬浮在加有2％FBS的PBS1X中，首先使用预载有α-GalCer的人类CD1d 四聚体进行染色，用PSB1XFBS2％进行洗涤，然后用抗CD3和抗CD4抗体进 行染色。在FACSCantoII(BDBiosciences)上采集细胞，并使用FlowJo软件(Tree Star)进行分析。

患者和方法：本发明人已经分析了T细胞亚型中HSC移植物的含量，包括来 自54个同种异体供体的iNKT细胞(52％为匹配相关，以及48％为匹配不相关)， 并可以考察在其中的34个中iNKT细胞的扩增能力(14个骨髓干细胞和21个 PBSC)。使用流式细胞术分析移植物含量比例和总的、CD4^-和CD4⁺iNKT细胞、 CD4⁺、CD8⁺、γδ⁺以及初始()和记忆活化的调节T细胞的绝对数目。使用 IL-2和α-GalCer培养PBMC15天后，分析iNKTCD4⁺和CD4^-亚群的扩增能力。

结果与进行同种异体HSCT之后受试者发展为II级至IV级aGVHD有关，其 发生在54个患者的15个中(28％)，以及来自21个PBSC移植中的6个(28.5％)， 所述结果可以用于考察iNKT亚型的扩增能力。

结果

如图1所示，可通过流式细胞术在CD3+和CD1d-四聚体+细胞中检测总iNKT 细胞群体(图1A)。通过使用抗-CD4标记抗体来检测CD4-和CD4+iNKT亚群 (图1B)。

如图2所示，在IL-2和α-Gal-Cer存在下体外扩增iNKT细胞12至15天后， 观察到两种不同的情况都取决于CD4-iNKT亚群的扩增(2A)或不扩增(2B)。

在单变量分析中(表1)，在不同考察的淋巴细胞子集(subset)和功能分析 中，只有总iNKT/T、CD4^-iNKT/T比率和CD4^-iNKT细胞的扩增能力与II-IV级 aGVHD的发生显著相关(分别为p＝0.039、p＝0.038和p＝0.008)。因此，如先 前报道，与发展为II-IV级aGVHD的患者相比，发展为0-I级aGVHD的患者接受 含有更高比例的CD4^-iNKT细胞的移植物。

表1：在T细胞子集上的移植物含量和II-IV级aGVHD发生之间相关性的单 变量分析

多变量分析中(表2)，移植物中含有的CD4^-iNKT细胞的扩增能力是发生 II-IV级aGVHD的独立预测因子(优势比＝0.19，95％CI：0.029-0.55，p＝0.017)， 以及使用不相关供体(p＝0.028)。

表2：移植物特征对发生II-IV级aGVHD的影响的多变量分析

优势比 [95％CI] p-值 CD4-iNKT细胞的扩增因子 0.19 [0.029-0.55] 0.017 受体年龄 0.88 [0.67-1.01] 0.18 供体年龄 1.13 [0.99-1.4] 0.14 MRD对MUD 6.6.10^-4[1.1.10^-8-7.6.10^-2] 0.028

采用ROC分析(图3)，本发明人发现移植物含有的CD4^-iNKT细胞的扩增 因子是发生II-IV级aGVHD的最佳预测因子(曲线下面积(AUC)＝0.76)。包 括所有的移植物，测试的灵敏度为96％(扩增因子低于1.8的发展为aGVHD的概 率)，以及特异性为70％(不发展为aGVHD的概率高于截止值)。在PBSC移植 中(n＝21例，其中6例II-IV级aGVHD)，测试具有AUC＝1以及100％的灵敏性 和特异性时，其预测性甚至更好(图3和4)。

在15例供体中，在来自G-CSF动员前的外周血中或移植物中的CD4^-iNKT 细胞的扩增能力上，本发明人观察到类似的模式(表3)。

表3：在12例PBSC和3例BMC分析供体中比较来自移植物或外周血样本 的CD4-iNKT细胞的扩增能力

参考文献

在整个本申请中，各种参考文献描述了本发明所属的现有技术的状态。这些 参考文献的公开内容通过引用并入本公开中。

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RubioMT，Moreira-TeixeiraL，BachyE，BouilliéM，MilpiedP，ComanT，SuarezF， MarcaisA，SibonD，BuzynA，Caillat-ZucmanS，Cavazzana-CalvoM，VaretB，DyM， HermineO，Leite-de-MoraesM.Earlyposttransplantationdonor-derivedinvariantnatural killerT-cellrecoverypredictstheoccurrenceofacutegraft-versus-hostdiseaseandoverall survival.Blood.2012Sep6；120(10)：2144-54.