一种具有诱导抗性活性的细菌菌株及其培养方法和应用

摘要

本发明公开了一种具有诱导抗性活性的细菌菌株及其培养方法和应用，该菌株为苏云金芽孢杆菌(Bacillus？thuringiensis)，保藏号为CGMCC？No.10831。上述细菌菌株的液体培养基由以下质量百分比的原料制备而成：酵母浸膏0.1％-0.2％、蛋白胨0.5％-0.6％、牛肉浸膏0.3％-0.4％、蔗糖1％-2％，余下为蒸馏水。本发明的苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensise)Sneb1076或其代谢物具有对大豆的诱导活性，可用于大豆的种子处理，不仅可促进大豆植株和根部的生长，同时对大豆胞囊线虫胞囊的形成具有较好的抑制作用，为大豆胞囊线虫防治提供一个新途径。

说明书

技术领域

本发明涉及菌株领域，具体涉及一种具有诱导抗性活性的细菌菌株及其培养方法和应用。

背景技术

植物寄生线虫在世界上许多国家和地区发生和为害，种类多种多样。在全球范围内，植物寄生线虫的发生与危害随着农林业的发展和耕作栽培制度的变化日益严重，据Esser统计，到1990年为止全世界已报道发现植物寄生线虫207属4832种(刘维志，段玉玺.2000.植物病原线虫学.北京：中国农业出版社，P.1-2)。据估计，植物寄生线虫造成世界主要农作物的年损失率为12.3％，超过1000亿美元，而实际的损失远远超过估计，理由是许多线虫造成的危害因没有田间可见症状或专化性特征而未引起注意(王寿华.果树线虫学.北京：中国农业科技出版社，1994.P.1-5)，此外，世界范围内对线虫为害的新发现还在不断增加，而且一些更新的农业栽培体制使线虫问题更加突出，再者，线虫与其它生物相互作用而对植物产生的直接或间接影响还在急剧增加。从这种意义上说，线虫造成的危害较其它生物更加隐蔽！目前对植物有害的线虫约有3000多种，在我国主要有胞囊线虫、松材线虫、甘薯茎线虫等。胞囊线虫是农业上为害最大的一类线虫，病害发生后，一般减产10％左右，严重的高达75％以上，甚至绝收(A.G.Whitehead，1998.PlantNematodeControl.ISBN0851991882CABInternational)。目前，植物寄生线虫的防治仍以化学防治为主，但近年来，化学杀线剂的应用浪费大，污染环境，选择性差，灭生性强，破坏土壤生物区系等弊端日益为人们所重视(张克勤，何世川，周薇等.1991.细菌和细菌在线虫生防中的作用及其研究进展.杀虫微生物.3：55-66)，21世纪称为环保世纪，一些有效的化学杀线剂的应用逐步受到限制，因此对植物寄生线虫的生物防治研究自然成为热点问题。已报道的可防治植物寄生线虫的生防细菌主要类群有：Bacillius，Pseudomonas，Acinebacter，Chromobacterium，Enterobacter，Serratia，Burkholderia等，其中以Bacillus和Pseudomonas中的种类最多。过去对苏云金芽孢杆菌的生防作用一般都是利用BT毒蛋白对昆虫的生物防治，直接对线虫有杀死活性的研究也有类似报道，而对于处理植物种子产生诱导抗性防御病害报道的很少，而对于利用苏云金芽孢杆菌处理大豆种子诱导大豆植株根系产生抗植物线虫的研究和发明均未见报道。如何利用菌株的代谢物诱导植物产生抗性，激发植物的免疫系统，是本发明关注的关键。

发明内容

针对上述问题，本发明通过系统筛选获得一株苏云金芽孢杆菌，利用该菌或该菌的代谢产物处理大豆种子，可诱导大豆在种子萌发和生长期间产生对大豆胞囊线虫的抗性，从而为解决了大豆胞囊线虫病害的问题提供了新的途径。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种具有诱导抗性活性的细菌菌株，所述菌株为苏云金芽孢杆菌BacillusthuringiensisSneb1076，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：中国.北京.朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2015年5月21日；保藏登记入册的编号：CGMCCNo.10831。B.thuringiensisSneb1076是从大量土壤细菌菌株中筛选出的一株对大豆胞囊线虫具有良好诱导抗性的细菌菌株。

上述一种具有诱导抗性活性的细菌菌株的培养方法，包括如下步骤：

S1、按质量百分比称取：酵母浸膏0.1％-0.2％、蛋白胨0.5％-0.6％、牛肉浸膏0.3％-0.4％、蔗糖1％-2％，余下为蒸馏水，混合后，得液体培养基；

S2、将步骤S1所得的液体培养基按每瓶150mL的比例分装于250mL的三角瓶内，分装完成后将菌种接种到液体培养基中，pH6.8-7.0，温度为25-28℃，摇床转速150r·min^-1，发酵2-3d，得可用于诱导大豆产生抗大豆胞囊线虫抗性的细菌代谢物。

上述一种具有诱导抗性活性的细菌菌株可用于制备植物寄生线虫生物防治诱导抗性制剂。所述诱导抗性制剂包含有效量的上述苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensise)或步骤S2所得的代谢产物。

其中，所述的植物寄生线虫为胞囊线虫(Soybeancystnematode)。

本发明通过研究发现，从土壤中筛选出多株具有诱导大豆抗大豆胞囊线虫的细菌菌株，其中苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensise)Sneb1076防效较好，且相对稳定。

本发明具有以下有益效果：

本发明的苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensise)Sneb1076或其代谢物具有对大豆的诱导活性，可用于大豆的种子处理，不仅可促进大豆植株和根部的生长，同时对大豆胞囊线虫胞囊的形成具有较好的抑制作用，为大豆胞囊线虫防治提供一个新途径。

具体实施方式

为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensise)Sneb1076的培养

将苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensise)Sneb1076的菌株接种到试管培养基上，培养基配方为牛肉膏蛋白胨培养基，即成分：牛肉浸膏3g，酵母浸膏1g，蛋白胨10g，蔗糖10g，琼脂17-20g，加蒸馏水至1000mL。28℃培养3d，获得试管种。

再将试管种接种到250mL三角瓶(每瓶装150mL)液体培养基中，培养基配方为：以重量百分比计，酵母浸膏0.1％-0.2％、蛋白胨0.5％-0.6％、牛肉浸膏0.3％-0.4％、蔗糖1％-2％，余下为蒸馏水，pH为6.8-7.0，发酵温度为25-28℃，摇床转速150r·min^-1、发酵时间2-3d。形成的发酵液或发酵液的制成品可以直接或间接处理大豆种子。被处理的大豆种子可以减轻由大豆胞囊线虫病害所造成的危害。

实施例2

苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensise)Sneb1076发酵产品防治大豆胞囊线虫田间效果试验

本试验分别在辽宁省沈阳市沈阳农业大学试验田，辽宁省沈阳市康平市试验田和黑龙江省大庆市农科院试验田进行田间效果试验。将制备好的发酵液原液，采用液种1∶70体积比进行种子包衣处理，在阴凉条件下阴干，将处理过的大豆种子正常播种，大豆植株在苗期可以产生对大豆胞囊线虫的抗性，并且诱抗效果比较稳定，取得很好的防治效果。

1.试验制剂

按前述液体发酵培养方法制备苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensise)Sneb1076的发酵液，待备用。

2.试验用大豆品种

辽豆15，辽宁省农业科学院大豆研究所提供。

3.种子处理方法

将大豆种子先用5.0％次氯酸钠溶液表面消毒5min，再用无菌水冲洗3-5次。将制备好的发酵液采用液种1∶70体积比进行种子包衣处理，在阴凉条件下阴燥，备用。

4.试验方法

本试验分别在辽宁省沈阳市沈阳农业大学试验田，辽宁省沈阳市康平市和黑龙江省大庆市农科院试验田进行田间效果试验，三处试验田大豆胞囊线虫均很严重，主栽作物大豆和玉米等。以未经过包衣的大豆种子和NA液体培养液包衣的大豆种子为对照，在栽后45d进行调查，将大豆植株连根挖出，保持根系完整，调查大豆根系胞囊数和根腐病情级数。

5.试验结果

使用Sneb1076发酵产品处理的大豆，大豆根系胞囊数显著低于对照，在沈阳农业大学，康平和大庆的田间防效分别为68.1％，79.4％和51.5％，包衣处理后的大豆与未处理的大豆存在显著差异。

表1Sneb1076发酵产品包衣处理大豆种子的田间防效

实施例3

苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensise)Sneb1076发酵产品防治大豆胞囊线虫盆栽效果试验

为了验证其诱抗的稳定性，特此进行了盆栽的防治效果研究。本试验在沈阳农业大学温室大棚进行盆栽效果试验，以未经过包衣的大豆种子和NA液体培养液包衣的大豆种子为对照，试验重复三次。

1.试验制剂

按前述液体发酵培养方法制备苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensise)Sneb1076的发酵液，待备用。

2.试验用大豆品种

辽豆15，辽宁省农业科学院大豆研究所提供。

3.种子处理方法

将大豆种子先用5.0％次氯酸钠溶液表面消毒5min，再用无菌水冲洗3-5次。将制备好的发酵液采用液种1∶70体积比进行种子包衣处理，在无菌条件下干燥，备用。

4.供试线虫

采自辽宁省沈阳市康平市试验田的根际胞囊土，经鉴定为大豆胞囊线虫(Soybeancystnematode)，通过淘洗过筛法挑取饱满成熟的胞囊，放入盛有无菌水的灭菌培养皿中，然后用0.5％NaCLO消毒3min，并无菌水冲洗3次，从中挑取完整且饱满的胞囊，置入盛有适量无菌水的灭菌培养皿中，将其放入28℃的恒温箱中培养，3d后将孵化出的二龄幼虫J2接种到温室内易感病的大豆根部进行扩繁。将扩繁获得的胞囊采用浅盘法孵化出J2，制备成线虫悬浮液200条/mL。

5.试验方法

将Sneb1076的发酵液原液采用液种1∶70体积比进行种子包衣处理，将包衣后晾干的大豆种子播种到育12×12cm的苗钵中，每盆接种2000条大豆胞囊线虫。以未经过包衣的大豆种子和NA液体培养液包衣的大豆种子为对照，在移栽后45d进行调查，测量大豆株高、根长、根鲜重和根内线虫数。

6.试验结果

使用Sneb1076发酵产品处理的大豆，根结数明显低于对照，大豆株高、根长、茎秆重、根鲜重与未处理的大豆存在明显差异，盆栽防效为40.7％。

表2Snef1076发酵产品包衣处理大豆种子的盆栽防效

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。