一种定量检测广东虫草的特征性核苷酸序列、核酸分子引物和方法

摘要

本发明公开了一种定量检测广东虫草的特征性核苷酸序列、核酸分子引物和方法。定量快速检测广东虫草的特征性核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO.2所示。定量快速检测广东虫草的核酸分子引物，该核酸分子引物为：FS：5`-GCTCCGATTCGATGGC-3`；RS：5`-TACAGCAGGCAGGTGGC-3`。利用本发明的核酸分子引物FS和RS进行荧光PCR扩增，仅广东虫草能够激发荧光信号，而其他虫草如冬虫夏草、蛹虫草和分枝虫草均在循环数小于35时均无Ct值，表明了本发明的核酸分子引物FS和RS具有很高的特异性，可以用于快速检测广东虫草(菌丝体和子实体)及其相关制品的真伪和含量。

说明书

技术领域：

本发明属于利用分子生物学方法检测中药材真伪的技术领域，具体涉及用于检测广东虫草(Cordycepsguangdongensis)的特征性核苷酸序列以及分子引物和定量检测广东虫草的方法。

背景技术：

广东虫草(CordycepsguangdongensisT.H.Li,Q.YLin&B.Song)是2008年在广东境内发现的特有虫草新品种。经研究发现，该虫草安全无毒可食，具有较好的抗氧化活性、抗疲劳和延寿作用等。广东虫草的虫草素和腺苷含量虽比蛹虫草低、但比冬虫夏草高，其虫草酸含量与冬虫夏草比较接近，具有较好的开发应用价值和市场潜力。2013年国家卫生部批准“广东虫草子实体”成为新资源食品，是继蛹虫草之后的又一个“虫草子实体”新资源食品，可作为冬虫夏草的替代品，缓解了虫草市场的压力，也丰富了虫草市场。因此，研制快速、定量检测广东虫草及其相关制品的真伪及含量技术对广东虫草产业的健康发展具有重要的意义，对广东虫草的商业化生产与产品检验具有实质应用价值。在前期的研究中，专利发明人已申请并获得了国家发明专利授权的“鉴别广东虫草的特征性核苷酸序列、核酸分子引物和方法ZL201110212383.5.”，该专利只能对广东虫草进行定性检测，而不能定量检测。

内参基因(referencegenes)是在不同个体及组织细胞中均稳定表达的基因，又叫管家基因(house-keepinggene)，常用的内参基因如微管蛋白(tubulin)，β肌动蛋白(β-actin)，甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)，18sRNA真核生物核糖体RNA(18srRNA)等(张玉芳,2014)。在生物学研究中，内参基因主要用于对目的基因定量结果的校正，即需要判定实验结果是基因本身的表达量的高低，还是操作过程中造成的误差，所以需要同时检测内参基因作为参照。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供了能够用于快速检测广东虫草(菌丝体和子实体)相关制品的真伪以及检测广东虫草含量的广东虫草的特征性核苷酸序列。

本发明的定量快速检测广东虫草的特征性核苷酸序列，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，共包含234bp的碱基。该定量快速检测广东虫草的特征性核苷酸序列源于广东虫草的α-tubulin蛋白编码基因序列(其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，共包含1498bp的碱基)。

本发明的第二个目的是提供扩增上述定量快速检测广东虫草的特征性核苷酸序列的核酸分子引物，其特征在于，该核酸分子引物为：

FS：5`-GCTCCGATTCGATGGC-3`；

RS：5`-TACAGCAGGCAGGTGGC-3`。

上述核酸分子引物序列FS和RS的退火温度相近，均不能形成引物二聚体。该核酸分子引物不与冬虫夏草、蛹虫草和分枝虫草等虫草起反应，仅与广东虫草发生反应而具有极高的特异性。在荧光定量PCR过程中依据荧光信号的强弱来检测底物中广东虫草的含量，且灵敏度高。因此，利用该核酸分子引物通过荧光定量PCR扩增可以快速地对广东虫草(菌丝体、子实体)及其相关制品的真伪进行检测并且能测定其含量。

本发明的第三个目的是提供一种定量快速鉴别广东虫草的试剂盒，其特征在于，包括上述核酸分子引物FS和RS，以及常规的DNA提取试剂和荧光定量PCR反应试剂。

本发明第四个目的是提供一种定量快速检测广东虫草的方法，其特征在于，采用上述核酸分子引物FS和RS作为扩增引物，利用荧光定量PCR方法检测广东虫草。

本发明基于Genbank中α-tubulin蛋白编码基因家族序列，设计了特异性的核酸分子引物FL和RL，以该核酸分子引物FL和RL作为引物，以广东虫草的基因组DNA为模版，按照常规PCR方法进行PCR，获得的DNA片段，经测序其具体核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，其长度为1498bp。经blastx比对，验证该序列属α-tubulin蛋白编码基因家族。根据SEQIDNO.1序列设计适合荧光定量PCR的特异性分子引物FS和RS。利用本发明的核酸分子引物FS和RS进行荧光PCR扩增(扩增序列如SEQIDNO.2所示)，仅广东虫草能够激发荧光信号，而其他虫草如冬虫夏草、蛹虫草和分枝虫草均在循环数小于35时均无Ct值(如图1)，表明了本发明的核酸分子引物FS和RS具有很高的特异性，可以用于快速检测广东虫草(菌丝体和子实体)及其相关制品的真伪。广东虫草α-tubulin蛋白编码基因的标准曲线如图2，其相关系数为0.990，扩增效率为99.5％，Ct值线性范围为18.11-35.03，回归方程为y＝-5.7253x+32.154，根据回归方程式可测算出广东虫草被测样品的相对含量。

本发明采用荧光定量PCR技术进行检测，检测的限量低至0.2ng/μl，方法简单，特异性好，用时短，1.5h内可完成。

附图说明：

图1是利用核酸分子引物FS和RS作为引物按照荧光定量的PCR方法对不同虫草样品进行实时荧光定量PCR的扩增曲线，图1所示，仅广东虫草在Ct值为20.5时，荧光值达到阈值，而冬虫夏草、蛹虫草在整个PCR循环过程中均未达到阈值，分枝虫草在Ct值为36.15达到阈值但大于广东虫草Ct值线性范围为18.11-35.03。

图2是根据不同浓度的广东虫草样品的DNA为模板，利用FS和RS作为引物按照荧光定量PCR方法进行扩增，获得的广东虫草α-tubulin蛋白编码基因的标准曲线，其相关系数为0.990，扩增效率为99.5％，Ct值线性范围为18.11-35.03，回归方程为y＝-5.7253x+32.154。根据该回归方程式可测算出广东虫草被测样品的相对含量。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

广东虫草基因组DNA的提取和α-tubulin蛋白编码基因序列的获得

称取0.05g-0.15g广东虫草样品置于无菌的研钵中，将液氮倒入并快速研磨，选用UNlQ-10柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒[生工生物工程(上海)股份有限公司，编号B511375-0050]，提取广东虫草基因组DNA，选用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒纯化广东虫草基因组DNA试剂盒[生工生物工程(上海)股份有限公司，编号B518131-0050]。获得广东虫草的基因组DNA。基于Genbank中α-tubulin蛋白编码基因家族序列，设计了特异性的核酸分子引物FL和RL(FL：5`-TGGTAACGCCTGCTGGGA-3`、RL：5`-YTCGCCGACGTACCAGTG-3`均由上海生工生物工程有限公司合成)。以该核酸分子引物FL和RL作为引物，以广东虫草基因组DNA为模版，利用HS-taqMix试剂盒(东盛生物科技有限公司的HS-taqMix试剂盒，其货号为：P2081)进行PCR反应。反应体系为25μL总体积，ddH₂O12.8μL，10倍缓冲液(Mg²⁺)8μL，dNTP(2.5mmol/L)2μL，FL(10μmol/L)0.5μL，RL(10μmol/L)0.5μL，HotStartTaq(5u/μL)0.2μL，模板DNA1μL。反应程序为94℃5min预变性，94℃30s，50℃40s，72℃120s，35个循环，72℃8min。PCR产物送北京华大基因测序，获得的广东虫草α-tubulin蛋白编码基因片段，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，包含1498bp的碱基。

实施例2

广东虫草特异性引物的荧光PCR扩增

根据广东虫草α-tubulin蛋白编码基因(SEQIDNO.1)，利用引物设计软件primer6设计得到16-17个核苷酸组成的一对序列，即FS和RS，其序列如下：

FS：5`-GCTCCGATTCGATGGC-3`；RS：5`-TACAGCAGGCAGGTGGC-3`。引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物扩增获得序列如SEQIDNO.2所示，共234bp的碱基。

利用SuperRealPreMix(SYBRGreen)[天根生化科技(北京)有限公司，编号FP204]试剂盒，进行荧光定量PCR反应，以广东虫草基因组DNA以及冬虫夏草Cordycepssinensis、蛹虫草Cordycepsmilitaris、分枝虫草Cordycepsramosa的基因组DNA为模板。反应体系为20μL总体积：2×SuperRealPreMix10.0Μl，FS(10μmol/L)0.5μL，RS(10μmol/L)0.5μL，模板DNA1μL，加ddH₂O至20.0μL。反应程序为95℃2min预变性，95℃15s，55℃15s，68℃20s，40个循环。使用Mastercyclereprealplex荧光定量PCR仪(艾本德eppendorf公司)

以冬虫夏草、蛹虫草、分枝虫草的基因组DNA为模板，以FS和RS作为引物，按照上述方法进行荧光定量PCR作为对照。结果如图1所示。广东虫草在Ct值20.5时荧光值达到阈值；冬虫夏草、蛹虫草在整个PCR循环过程中均未达到阈值；分枝虫草达到阈值的Ct值为36.15(图1)，大于广东虫草的Ct值线性范围为18.11-35.03(图2)。

按照上述荧光定量PCR的方法进行最低检测量试验，结果显示，检测的限量低至0.2ng/μl。

实施例3

广东虫草DNA初始浓度含量检测

根据已知的不同浓度的广东虫草基因组DNA样品为模板，利用FS和RS作为引物按照实施例2的荧光定量的PCR方法进行扩增，获得的广东虫草α-tubulin蛋白编码基因荧光PCR的Ct值(见表1)，绘制标准曲线(见图2)。其相关系数为0.990，扩增效率为99.5％，Ct值线性范围为18.11-35.03，回归方程为y＝-5.7253x+32.154。根据该回归方程式可测算出广东虫草被测样品的相对含量。

表1不同浓度广东虫草DNA样品的Ct值