用于鉴定广金钱草类型的引物组、试剂盒以及鉴定广金钱草类型的方法

摘要

本发明提出了用于鉴定广金钱草类型的引物组、用于鉴定广金钱草类型的试剂盒、以及鉴定广金钱草类型的方法。用于鉴定广金钱草类型的引物组由下列构成：第一引物至第七引物，其中，所述第一引物至第七引物分别具有SEQ？ID？NO：1～7所示的核苷酸序列。本发明用于鉴定广金钱草类型的引物具有下列优点的至少之一：通用性强、利用该引物鉴定广金钱草类型的准确性高、客观性强以及稳定性高。

说明书

技术领域

本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及用于鉴定广金钱草类型的引物组、 用于鉴定广金钱草类型的试剂盒以及鉴定广金钱草类型的方法。

背景技术

广金钱草，中药名，为豆科植物广金钱草的干燥地上部分。其功效为利湿退 黄，利尿通淋，主治黄疸尿赤，热淋，石淋，小便涩病，水肿尿少。分布于福建、 湖南、广西和广东等省区。

然而，目前对于广金钱草的鉴定仍有待改进。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的目的 在于提出一种用于鉴定广金钱草类型的引物组、一种用于鉴定广金钱草类型的试 剂盒以及一种鉴定广金钱草类型的方法。利用用于鉴定广金钱草类型的引物组、 用于鉴定广金钱草类型的试剂盒以及鉴定广金钱草类型的方法可以客观、准确或 者稳定地鉴定出广金钱草的类型。

需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

经过文献调查、市场调查以及实地调查等多种途径对广金钱草药用植物野生 资源和栽培资源进行考察，发现广金钱草野生资源分布稀疏且数量较少，栽培资 源成为市场主要流通商品。此外，野生药材与栽培药材、不同产区栽培药材之间 存在有效成分含量差异大等质量差异，而药材的良莠对产品的质量具有重要影响， 在生产过程中必须对其进行严格控制。根据其外部形态、断面等特征进行性状鉴 别，具有一定的主观性，对鉴别者专业知识及经验要求很高，且该技术仅能鉴别 广金钱草的真伪，无法判断其分布区域，现已经不能满足市场的需求。

本发明的发明人经过大量实验发现，分别采集不同区域的广金钱草作为样本， 分别提取DNA，利用引物对DNA片段进行扩增，然后将扩增的产物进行凝胶电 泳，并对电泳结果进行分析，鉴定出广金钱草类型。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种用于鉴定广金钱草类型的引物组。 根据本发明的实施例，该用于鉴定广金钱草类型的引物组由下列构成：第一引物 至第七引物，其中，所述第一引物至第七引物分别具有SEQIDNO：1～7所示的 核苷酸序列。该引物用于扩增广金钱草基因组DNA上的片段，通过对扩增产物 分析，以进一步鉴定广金钱草的类型。由此，最终得到的用于鉴定广金钱草类型 的引物具有下列优点的至少之一：通用性强、利用该引物鉴定广金钱草类型的准 确性高、客观性强以及稳定性高。

根据本发明的实施例，上述用于鉴定广金钱草类型的引物组还可以具有下列 附加技术特征至少之一：

根据本发明的一个实施例，所述第一引物至第七引物具有相同的摩尔含量。 本发明限定第一引物至第七引物需具有相同的摩尔含量，目的是消除引物的浓度 对扩增条带清晰度或者特异性等扩增效率的影响。由此，根据本发明实施例的用 于鉴定广金钱草类型的引物可以进一步具有较强的通用性、利用该引物鉴定广金 钱草类型的较强准确性、较强客观性或者较高稳定性。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种用于鉴定广金钱草类型的试剂盒。 如前所述，根据本发明的实施例，包括：前面所述的用于鉴定广金钱草类型的引 物组。因此，最终得到的用于鉴定广金钱草类型的试剂盒具有下列优点的至少之 一：使用简便、通用性强、利用该试剂盒鉴定广金钱草类型的准确性高、客观性 强以及稳定性高。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种鉴定广金钱草类型的方法。如前所 述，根据本发明的实施例，包括：(1)对核酸样品进行PCR扩增，以便获得扩 增产物，其中，所述核酸样品含有来自待鉴定广金钱草样本的基因组DNA，所 述PCR扩增采用前面所述的引物组或者前面所述的试剂盒；以及(2)基于所述 扩增产物的构成，确定所述待鉴定广金钱草样本的类型。由于不同类型的广金钱 草，其个体间基因的核苷酸序列存在着差异性，通过对广金钱草基因组DNA片 段进行扩增，对扩增产物的构成进行分析，确定广金钱草样本的类型。由此，最 终得到的鉴定广金钱草类型的方法具有下列优点的至少之一：操作简便、引物通 用性强、准确性高、客观性强以及稳定性高。

根据本发明的实施例，上述鉴定广金钱草类型的方法还可以具有下列附加技 术特征至少之一：

根据本发明的实施例，基于20μL的反应体系，所述PCR扩增条件为：甲酰 胺0.5μL；10×Taqbuffer2μL；Mg²⁺2.0μL；模板DNA1.0μL；dNTP1.5μL；引 物1.0μL；Taq酶1.0μL；以及余量的ddH₂O。发明人经过大量实验优化得到PCR 扩增条件。添加甲酰胺能够加强PCR序列分析，防止出现背景强、特异序列分 析阶梯弱、模棱两可的信号和过早的终止等现象。当模板DNA添加量过高，点 样孔至泳道会出现相应增强的弥散背景，反之模板DNA过低，扩增产物强度相 应减弱，无扩增产物。当模板DNA浓度为1.0μL时，扩增产物基本稳定、条带 清晰、稳定且分辨率高。Mg²⁺为聚合酶的金属辅因子，对影响聚合酶的活性具有 较强的影响。当引物添加量为1.0μL时，扩增结果基本一致，但随着引物浓度的 逐渐增加，开始出现弥散背景增强的趋势，并且有些扩增带发生减弱或缺失。由 此，根据本发明实施例的鉴定广金钱草的方法可以进一步具有更简便的操作、较 强的引物通用性、较高的准确性、较强的客观性或者较高的稳定性。

根据本发明的实施例，步骤(2)包括：(2-1)对所述扩增产物进行凝胶电 泳；以及(2-2)基于所述凝胶电泳在预定长度区域是否出现条带，确定所述待 鉴定广金钱草样本的类型。对至少两个广金钱草核酸样本进行PCR扩增，随后 进行凝胶电泳，预定长度区域出现条带的样本和未出现条带的样本具有差异性， 根据此差异确定广金钱草的类型。由此，根据本发明实施例的鉴定广金钱草的方 法可以进一步具有更简便的操作、较强的引物通用性、较高的准确性、较强的客 观性或者较高的稳定性。

根据本发明的实施例，在步骤(2-1)中，所述凝胶电泳的条件为：1.5％琼 脂糖凝胶，电泳电压为110V/cm，电泳时间90分钟。发明人经过大量实验，琼 脂糖凝胶浓度、电泳电压及电泳时间对能否得到清晰条带至关重要。发明人经过 条件筛选，意外地发现，当琼脂糖凝胶的浓度为1.5％，电泳电压为110V/cm， 电泳时间为90分钟时，能够有效地对扩增产物DNA样本进行区分，发明人发 现，当琼脂糖凝胶的浓度超过1.5％时，DNA分子在琼脂糖凝胶中的移动速度非 常缓慢，造成所有的条带都集中在一个较小的区域中，难以区分，造成电泳时间 长，琼脂糖凝胶发热严重，容易融化。如果琼脂糖凝胶的浓度低于1.5％时，会 造成DNA分子在琼脂糖凝胶中的移动速度非常快，同样会导致所有的条带都集 中在一个较小的区域中，难以区分，甚至会脱离琼脂糖凝胶进入电解液中，造成 电解液污染。另外，发明人发现，如果电泳时间超过90分钟，会使得待测样品 条带和Marker可能脱离凝胶，造成电解液污染，如果电泳时间低于90分钟，则 会造成待测样品条带无法与其他DNA分子有效地区分开。如果电泳电压超过 110V/cm，则会造成DNA分子在琼脂糖凝胶中的移动速度过快，所有的DNA分 子均集中在较小的区域内，从而难以区分，同时在高电压下凝胶会发热较快而导 致胶融化。如果电压过低，则会造成DNA分子在琼脂糖凝胶中的移动速度非常 缓慢，造成所有的条带都集中在一个较小的区域中，难以区分。由此，根据本发 明实施例的鉴定广金钱草的方法可以进一步具有更简便的操作、较强的引物通用 性、较高的准确性、较强的客观性或者较高的稳定性。

根据本发明的实施例，所述预定长度区域是基于已知类型的广金钱草样本确 定的。由此，根据本发明实施例的鉴定广金钱草的方法可以进一步具有更简便的 操作、较强的引物通用性、较高的准确性、较强的客观性或者较高的稳定性。

根据本发明的实施例，所述已知来源的广金钱草样本来自于下列产地至少之 一：桂林市临桂区中庸乡仓库岭村；柳州市融安县泗顶镇三坡村；梧州市苍梧县 新地镇都梅村；来宾市兴宾区桥巩乡吉林村；桂林市临桂县五通镇东岭村；桂林 市临桂县宛田镇；桂林市临桂区中庸乡中庸村；湛江市遂溪县乌塘镇；湛江市遂 溪县城月镇实荣村；惠州市博罗县罗阳镇光头村；汕尾市海丰县梅龙镇银液九径 村；湛江市遂溪县乌塘镇；惠州市博罗县罗阳镇巷口村；紫金县蓝塘镇市北村； 以及化州市河西长堤路。广金钱草主要分布于福建、湖南、广西和广东等省区， 所以在上述地区进行样本采集。由此，根据本发明实施例的鉴定广金钱草的方法 可以进一步具有更简便的操作、较强的引物通用性、较高的准确性、较强的客观 性或者较高的稳定性。

在本发明的第四方面，本发明提出了一种鉴定广金钱草类型的方法。根据本 发明的实施例，所述方法包括：

(3-1)广金钱草植物基因组DNA的提取

采集到的新鲜广金钱草叶片经变色硅胶吸水干燥后用无水乙醇洗净叶片表 面，待无水乙醇挥干后用剪刀剪成细小的碎片，加入液氮后迅速用球磨仪研磨成 粉末。

将磨好的叶片粉末(约30mg)迅速加入到800μL预热到65℃的DNA提取 缓冲液(预先加入RNase50μg)中65℃水浴25分钟，每5分钟将EP管颠倒数 次，防止叶片粉末结块。取出EP管，置于冰上，加入等体积的Tris-饱和酚：氯 仿：异戊醇(25:24:1)，充分摇匀后放入离心机，20℃下10000rpm离心10min， 取600μL上清液。向上清液中加入等体积氯仿：异戊醇(24:1)，摇匀后放入离 心机中，20℃下10000rpm离心10min，取上清液400μL于灭菌后的EP管中。 此上清液为未纯化的DNA溶液。

选用天根新型植物基因组提取试剂盒对提取的基因组DNA进行纯化。向未 纯化的DNA溶液中加入700μL缓冲液GP2，充分混匀。将混匀的液体转入吸附 柱CB3中，10000rpm离心30s，弃掉废液(吸附柱容积为700μL，可分次加入 离心)。向吸附柱CB3中加入500μL的缓冲液GD(预先加入无水乙醇)，放置 10min，10000rpm离心30s，弃掉废液。向CB3中加入600μL漂洗液PW，(预 先加入无水乙醇)10000rpm离心30s，倒掉废液。向CB3中加入90％乙醇， 10000rpm离心30s，倒掉废液。将CB3置于室温放置15min，挥干乙醇。将CB3 放入灭菌后的EP管中，加入100μL的TE缓冲液(预热至40℃)，室温放置5 分钟，10000rpm离心2min，将离心得到的溶液再加入到吸附柱CB3中，室温放 置3min，10000rpm离心2min，得到纯化后的广金钱草DNA。

(3-2)ISSR-PCR反应体系的优化及其稳定性分析

(3-2-1)ISSR-PCR扩增程序的建立

以哥伦比亚大学大学公布的60个ISSR通用引物为基础，用NEWENGLAND BIOLABSTmCalculator引物退火温度在线计算器以及PrimerPremier5引物设 计软件对其退火温度进行计算，Tm值均在50℃附近。初步程序设置为：95℃预 变性5min；95℃变性45s；50℃退火40s；72℃延伸60s；循环40次；72℃延伸 10min；4℃保存。

(3-2-2)ISSR-PCR反应工作液的浓度

各反应底物浓度如下：

底物 浓度 10×Taq buffer - Mg²⁺- dNTPmixture 2.5mM 引物 10mM 模板DNA ～100ng/uL 甲酰胺 -

ddH₂O -

(3-4)ISSR-PCR扩增及其产物分析

(3-4-1)ISSR-PCR扩增

在表5所列出的ISSR-PCR反应体系及表6所列出的退火温度的条件下，对 15分核酸样品进行ISSR-PCR扩增反应。经扩增反应后，取PCR反应产物7μL 与3μL核酸染料工作液混合，在1.5％的琼脂糖凝胶中进行电泳检测，电压为 110V/cm，电泳时间为90min，以100-IIbpDNAMarker为PCR产物片段的长度 标尺。电泳完成后，将胶块放在紫外分析仪上拍照并记录。根据产物进行凝胶电 泳后的结果显示，UBC836、UBC890两条引物扩增出的产物特异性较差，对15 份核酸样品的区分能力小，而UBC808、UBC809、UBC842、UBC844、UBC845、 UBC855、UBC888共7条引物对样品模板DNA扩增效果较好，优选扩增较好的 7条引物扩增出的条带作为后续聚类分析的对象。为方便描述，将UBC808命名 为第一引物，UBC809命名为第二引物，依次类推，将UBC842至UBC888命名 为第三至第七引物。

表5ISSR-PCR反应体系

反应底物 加入体积(μL) ddH₂O 11.0 甲酰胺 0.5 10×Taq buffer 2.0 Mg²⁺2.0 模板DNA 1.0 dNTP mixture 1.5 Primer 1.0 Taq酶 1.0

表6ISSR-PCR中引物退火温度的设置

(3-4-2)聚类分析

从电泳图可以看出，7条引物共扩增出67条条带，其中多态性条带共计51 条，多态性比率达76.1％，每条引物可扩增出5～11条特异性条带，平均每条引 物可扩增出7.29条条带。扩增产物在相同迁移位置有带计为1，无条带计为0， 构建0-1原始数据矩阵，用SPSS进行聚类分析，并建立聚类树，并对聚类结果 进行分析。

此外，根据本发明的实施例，本发明用于鉴定广金钱草类型的引物组、用于 鉴定广金钱草类型的试剂盒以及鉴定广金钱草类型的方法具有以下优点的至少 之一：

1、根据本发明的实施例，本发明用于鉴定广金钱草类型的引物组具有通用 性，不具有较强的种特异性，降低设计费用，并且准确性高、稳定性高。

2、根据本发明的实施例，目前鉴定广金钱草类型的方法主要是性状鉴定法， 具有较强的主观性。本发明鉴定广金钱草类型的方法具有客观性，能够准确、稳 定的确定广金钱草的类型。

3、根据本发明的实施例，本发明用于鉴定广金钱草类型的试剂盒使用简便， 能够准确、稳定、客观的确定广金钱草的类型。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述 中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1显示了根据本发明一个实施例的15份模板DNA电泳图；

图2显示了根据本发明一个实施例的ISSR-PCR反应扩增程序；

图3显示了根据本发明一个实施例的9个引物分别以两个不同模板扩增的电 泳图；

图4显示了根据本发明一个实施例的UBC808ISSR-PCR扩增的电泳图；

图5显示了根据本发明一个实施例的UBC809ISSR-PCR扩增的电泳图；

图6显示了根据本发明一个实施例的UBC842ISSR-PCR扩增的电泳图；

图7显示了根据本发明一个实施例的UBC844ISSR-PCR扩增的电泳图；

图8显示了根据本发明一个实施例的UBC845ISSR-PCR扩增的电泳图；

图9显示了根据本发明一个实施例的UBC855ISSR-PCR扩增的电泳图；

图10显示了根据本发明一个实施例的UBC888ISSR-PCR扩增的电泳图； 以及

图11显示了根据本发明一个实施例的聚类分析图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下 面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明 具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明 书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

材料、仪器及试剂

1、广金钱草样品采集

用于实验的15份样品于2014年7、8月在广西、广东两省采集，所采集到 的新鲜叶片在当地用滤纸包裹好后放入装有变色硅胶的自封袋中常温保存，保存 时间为一周。15份广金钱草药材来源信息见表1。

表1广金钱草来源表

样品编号 产地 栽培/野生 A 桂林市临桂区中庸乡仓库岭村 栽培 B 柳州市融安县泗顶镇三坡村 栽培 C 梧州市苍梧县新地镇都梅村 半野生 D 来宾市兴宾区桥巩乡吉林村 半野生 E 桂林市临桂县五通镇东岭村 栽培 F 桂林市临桂县宛田镇 栽培 G 桂林市临桂区中庸乡中庸村 栽培 H 湛江市遂溪县乌塘镇 栽培 I 湛江市遂溪县城月镇实荣村 栽培 J 惠州市博罗县罗阳镇光头村 半野生 K 汕尾市海丰县梅龙镇银液九径村 栽培 L 湛江市遂溪县乌塘镇 野生 M 惠州市博罗县罗阳镇巷口村 野生 N 紫金县蓝塘镇市北村 栽培 O 化州市河西长堤路 半野生

2、仪器与试剂

恒温水浴锅，高速冷冻离心机(EPPENDORFCENTRIFUGE5424R)，球磨 仪(RETECHMM400)，酶标仪(SPECTRAMAXM190)，微波炉，梯度PCR 扩增仪(BIO-RAD)，PCR扩增仪(TECHNE)，电泳仪(北京君意公司)，紫外分 析仪ZF1-II(上海嘉鹏科技)，移液器(EPPENDORF)。

十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，PVP-K30，β-巯基乙醇，Tris-HCl， EDTA-Na2，NaCl，氯仿，异戊醇，Tris碱，冰乙酸，EDTA，NaOH，Tris-饱和 酚，RNase(美国SIGMA)，天根新型植物基因组提取试剂盒(北京天根生化科 技)，10×Taqbuffer(Mg²⁺Free)(VAZYME公司)，25mMMg²⁺(VAZYME公 司)，Taq酶(VAZYME公司)，dNTPMIXTURE(10mMeach)(上海生工)， PRIMER(上海捷瑞生物工程有限公司合成)，甲酰胺(上海捷瑞生物工程有限公司)， 6×loadingbuffer，50×TAE，SybraGreenI，琼脂糖凝胶(上海捷瑞生物工程有限 公司)，娃哈哈纯净水，无水乙醇。

实施例2

溶液配置

1、50×TAE溶液

准确称量242gTris碱、57.1ml冰乙酸、100ml0.5mol/LEDTA，用NaOH调 至pH8.0，水定容至1L，待用。

电泳缓冲液：将50×TAE溶液用纯净水稀释50倍，得到1×TAE工作液。

2、DNA提取缓冲液

2％(W/V)CTAB，3％(W/V)PVP，1mol/LTris-Hcl(pH＝8.0)50mL，0.5mol/L EDTA-Na₂(pH＝8.0)20mL，NaCl41g，水定容至500ml。灭菌后加入β-硫基乙醇 1000μL。

3、核酸染料工作液

用1×TAE工作液将SybraGreenI稀释100倍后，加入2倍体积的6×loading buffer，充分混匀，得到核酸染料的工作液。

实施例3

广金钱草植物基因组DNA的提取

采集到的新鲜广金钱草叶片经变色硅胶吸水干燥后用无水乙醇洗净叶片表 面，待无水乙醇挥干后用剪刀剪成细小的碎片，加入液氮后迅速用球磨仪研磨成 粉末。

将磨好的叶片粉末(约30mg)迅速加入到800μL预热到65℃的DNA提取 缓冲液(预先加入RNase50ug)中65℃水浴25分钟，每5分钟将EP管颠倒数 次，防止叶片粉末结块。取出EP管，置于冰上，加入等体积的Tris-饱和酚：氯 仿：异戊醇(25:24:1)，充分摇匀后放入离心机，20℃下10000rpm离心10min， 取600μL上清液。向上清液中加入等体积氯仿：异戊醇(24:1)，摇匀后放入离 心机中，20℃下10000rpm离心10min，取上清液400μL于灭菌后的EP管中。 此上清液为未纯化的DNA溶液。

实施例4

DNA纯化

选用天根新型植物基因组提取试剂盒对实施例3中提取的基因组DNA进行 纯化。向实施例3未纯化的DNA溶液中加入700μL缓冲液GP2，充分混匀。将 混匀的液体转入吸附柱CB3中，10000rpm离心30s，弃掉废液(吸附柱容积为 700μL，可分次加入离心)。向吸附柱CB3中加入500μL的缓冲液GD(预先加 入无水乙醇)，放置10min，10000rpm离心30s，弃掉废液。向CB3中加入600μL 漂洗液PW，(预先加入无水乙醇)10000rpm离心30s，倒掉废液。向CB3中加 入90％乙醇，10000rpm离心30s，倒掉废液。将CB3置于室温放置15min，挥 干乙醇。将CB3放入灭菌后的EP管中，加入100μL的TE缓冲液(预热至40℃)， 室温放置5分钟，10000rpm离心2min，将离心得到的溶液再加入到吸附柱CB3 中，室温放置3min，10000rpm离心2min，得到纯化后的广金钱草DNA。

实施例5

DNA纯度检测

1、1％(M/V)琼脂糖凝胶的制备

称取0.5g琼脂糖凝胶粉末放入锥形瓶中，加入50mL的1×TAE溶液，摇匀， 微波炉加热至琼脂糖粉末融化(沸腾2次即可)，将融化的琼脂糖凝胶冷却至70℃ 左右，倒入胶床冲，插入梳子，待冷却凝固后拔出梳子，待用。

2、纯度检测

用移液器吸取3μL核酸染料工作液与5μLDNA溶液充分混匀后加入到1％ 琼脂糖凝胶的凹槽中，在5V/cm的电压下电泳30min，电泳完成后将胶块放于紫 外分析仪上检测并拍照记录，结果如图1，其中m为1000bpDNAMarker，A-O 分别对应表1中的核酸样品编号。由图1中可以看出纯化得到的DNA条带清晰， 不存在RNA干扰。

用移液器吸取20μLDNA母液，稀释5倍后，上样于96孔板。用酶标仪对 其浓度和纯度进行测定。结果显示各DNA样品OD₂₆₀/OD₂₈₀均在1.7-1.9以内， 表明DNA纯度高，可以进行下一步的PCR反应。以上纯化后的DNA溶液放于 -86℃冰箱中冻存。

实施例6

ISSR-PCR反应体系的优化及其稳定性分析

ISSR(inter-simplesequencerepeat)是一种微卫星基础上的分子标记。其基 本原理是：用锚定的微卫星DNA(SSR序列)为引物，即在SSR序列的3'端或 5'端加上2-4个随机核苷酸，在PCR反应中，锚定引物可引起特定位点退火，导 致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片段进行PCR扩增。所扩增 区域的多个条带通过凝胶电泳得以分辨，扩增谱带多为显性表现。

ISSR引物的开发不像SSR引物那样需测序获得SSR两侧的单拷贝序列，开 发费用降低。与SSR标记相比，ISSR引物可以在不同的物种间通用，不像SSR 标记一样具有较强的种特异性；与RAPD和RFLP相比，ISSR揭示的多态性较 高，可获得几倍于RAPD的信息量，精确度几乎可与RFLP相媲美，检测非常方 便，因而是一种非常有发展前途的分子标记。

本发明所使用的术语“多态性”为本领域技术人员公知的，是指以适当频率 在一个群体的某个特定遗传位点(基因序列或非基因序列)发生两种或两种以上 变异的现象。

1、ISSR-PCR扩增程序的建立

以哥伦比亚大学大学公布的60个ISSR通用引物为基础，用NEWENGLAND BIOLABSTmCalculator引物退火温度在线计算器以及PrimerPremier5引物设 计软件对其退火温度进行计算，Tm值均在50℃附近。初步程序设置见图2。

2、ISSR-PCR反应工作液的浓度

各反应底物浓度见表2。

表2各反应底物的浓度

底物 浓度 10×Taq buffer - Mg²⁺- dNTPmixture 2.5mM 引物 10mM 模板DNA ～100ng/uL 甲酰胺 - ddH₂O -

注：“-”表示无需稀释，母液为工作液，“～”表示大致浓度。

3、ISSR-PCR反应体系的选择与优化

ISSR-PCR反应体系的确定主要对反应体系中的Mg²⁺、dNTP、Taq酶、引物、 模板DNA的浓度进行优化。对Mg²⁺、dNTP、Taq酶、引物、模板DNA在不同 添加量的实验条件进行选择，建立五因素四水平L₁₆(45)的正交实验。Taq酶 的活性为1U/μL，反应体系的终体积为20μL，其中10×Taqbuffer为2μL，甲酰 胺为0.5μL，模板DNA选自经表1中样品编号为A的样品提取的DNA，引物选 自通用引物UBC808，其他底物按照表3加入反应体系，最终用ddH₂O补足至 20μL，最终滴加15μL石蜡油封住液面，防止PCR反应过程中水挥发造成体系 不稳定。正交实验方案见表4。

表3L₁₆(4⁵)正交实验各因素水品

水平 Mg²⁺/μL Taq酶/μL dNTP/μL 引物/μL 模板DNA/μL 1 1.0 0.5 1.0 0.5 1 2 1.5 1.0 1.5 1.0 1.5 3 2.0 1.5 2.0 1.5 2 4 2.5 2.0 2.5 2.0 2.5

表4正交实验方案

Mg²⁺/μL Taq酶/μL dNTP/μL 引物/μL 模板DNA/μL 1 1.0 0.5 1.0 0.5 1 2 1.5 0.5 1.5 1.0 1.5 3 2.0 0.5 2.0 1.5 2 4 2.5 0.5 2.5 2.0 2.5 5 1.0 1.0 2.0 1.0 2.5 6 1.5 1.0 2.5 0.5 2

7 2.0 1.0 1.0 2.0 1.5 8 2.5 1.0 1.5 1.5 1 9 1.0 1.5 2.5 1.5 1.5 10 1.5 1.5 2.0 2.0 1 11 2.0 1.5 1.5 0.5 2.5 12 2.5 1.5 1.0 1.0 2 13 1.0 2.0 1.5 2.0 2 14 1.5 2.0 1.0 1.5 2.5 15 2.0 2.0 2.5 1.0 1 16 2.5 2.0 2.0 0.5 1.5

经扩增反应后，取PCR反应产物7μL与3μL核酸染料工作液混合，在1.5％ 的琼脂糖凝胶中进行电泳检测，电压为110V/cm，电泳时间为90min，以100-II bpDNAMarker为PCR产物片段的长度标尺。最终优化ISSR-PCR反应体系见表 5，在此条件下电泳条带清晰，明亮，无明显杂带。

表5ISSR-PCR反应体系

反应底物 加入体积(μL) ddH₂O 11.0 甲酰胺 0.5 10×Taq buffer 2.0 Mg²⁺2.0 模板DNA 1.0 dNTP mixture 1.5 Primer 1.0 Taq酶 1.0

实施例7

ISSR-PCR引物的筛选及其分析

1、引物的筛选

在上述最优反应体系下，对选自哥伦比亚大学提供的60个ISSR通用引物 序列进行筛选，最终筛选得出9条多态性好、反应后条带清晰的引物作为本实验 后续试验的引物。接着，将优化后的反应体系用两个不同的模板DNA反应，以 确定其稳定性。结果如图3，从电泳图最左侧808至890分别是以表1中样品编 号为A的样品提取的DNA为模板进行扩增得到的产物，从电泳图最右侧890至 808分别是以样品编号为K的样品提取的DNA为模板进行扩增得到的产物，其 中m为DNAMarkerDL1002，长度为100至1000bp，808为引物UBC808、809 引物为UBC809，其他依次类推，在此不再赘述。图3中可以看出，电泳条带清 晰，稳定性好。

2、引物退火温度的优化

对上述筛选出的9条引物分别进行最佳退火温度的考察。

在理论退火温度的基础上使用梯度PCR仪对引物的退火温度进行优化选择， 设置温度为47.9℃、50℃、50.3℃、50.9℃、51.7℃、52.8℃、54.3℃、56.0℃、 57.4℃、58.5℃、59.3℃、59.8℃、60.0℃。在以上温度条件下进行PCR反应， 并在最适温度下进行微调。经扩增反应后，取PCR反应产物7μL与3μL核酸染 料工作液混合，在1.5％的琼脂糖凝胶中进行电泳检测，电压为110V/cm，电泳 时间为90min，以100-IIbpDNAMarker为PCR产物片段的长度标尺。通过电泳 条带的清晰程度，得出9种引物最终退火温度，具体引物退火温度见表6，其中 理论退火温度是软件根据引物碱基序列得到的退火温度，实际退火温度为经过实 验优化得到的最佳退火温度。

表6ISSR-PCR中引物退火温度的设置

3、退火温度稳定性分析

随机选取1个样品的模板DNA，在最优ISSR-PCR反应体系及退火温度下， 重复3次PCR反应实验，结果显示ISSR-PCR反应体系稳定，引物实际退火温 度在该体系下稳定性良好。

实施例8

ISSR-PCR扩增及其产物分析

1、ISSR-PCR扩增

在最佳ISSR-PCR反应体系及退火温度的条件下，对15分核酸样品进行 ISSR-PCR扩增反应。经扩增反应后，取PCR反应产物7μL与3μL核酸染料工 作液混合，在1.5％的琼脂糖凝胶中进行电泳检测，电压为110V/cm，电泳时间 为90min，以100-IIbpDNAMarker为PCR产物片段的长度标尺。电泳完成后， 将胶块放在紫外分析仪上拍照并记录。根据产物进行凝胶电泳后的结果显示， UBC836、UBC890两条引物扩增出的产物特异性较差，对15份核酸样品的区分 能力小，而UBC808、UBC809、UBC842、UBC844、UBC845、UBC855、UBC888 共7条引物对样品模板DNA扩增效果较好，其电泳图见图4-10，其中m为Marker DL1002，A-O分别表示15份核酸样本编号，具体见表1。优选扩增较好的7条 引物扩增出的条带作为后续聚类分析的对象。

2、聚类分析

图4-10中看出，7条引物共扩增出67条条带，其中多态性条带共计51条， 多态性比率达76.1％，每条引物可扩增出5～11条特异性条带，平均每条引物可 扩增出7.29条条带。扩增产物在相同迁移位置有带计为1，无条带计为0，构建 0-1原始数据矩阵，具体记录见表7-13。用SPSS进行聚类分析，并建立聚类树， 见图11。

表7UBC808扩增产物条带记录

01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0

表8UBC809扩增产物条带记录

01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 1 1 0 1 0 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0

表9UBC842扩增产物条带记录

01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0

0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 0 1 0 0 1 1 1 0 1 1 1 1 0

表10UBC844扩增产物条带记录

01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 1 1 0 0 0 0

表11UBC845扩增产物条带记录

01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0

表12UBC855扩增产物条带记录

01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

表13UBC888扩增产物条带记录

01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 0 1 0 1 1 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0

3、聚类分析结果

根据ISSR-PCR分子标记数据所建立起的聚类树来分析，广西省桂林市临桂 县地区的4份样品聚为一类，广东省湛江市地区的3份样品单独聚为一类，惠州 市地区两份样品聚为一类，这3类地区的广金钱草种质资源相对稳定。柳州市融 安县与来宾市地区所种植的广金钱草聚为一类；广州市紫金县蓝塘镇地区的广金 钱草与桂林地区的广金钱草聚为一类；梧州市地区的广金钱草与化州市地区的广 金钱草聚为一类；汕尾市所种植的广金钱草与惠州市地区所种植的广金钱草聚为 一类。

从种植地区情况来看，桂林市中庸乡、临桂县的五通镇、宛田镇的地理位置 较近，且常年大面积种植广金钱草，广金钱草种植有一定的历史，当地的广金钱 草资源十分稳定，每年收获广金钱草时间为11月初，且保留种子为来年继续种 植用，当地不从外地引种广金钱草。与临桂地区种植情况相似的是广东省湛江市 乌塘县地区，同样也为当地收获种子后来年继续种植。这两个地区的种植面积在 本次资源调查的地区为最大的两个地区，其中广西省桂林市临桂县种植面积最大。

与桂林地区地理位置相近的为柳州市和来宾市，柳州市融安县泗顶镇所种植 的广金钱草为第一年种植，其种子采购于广东省，但从聚类分析来看，当地所种 植的广金钱草种质仍为广西地区的种质，这种情况可能与种子收购商所收购的种 子为广西地区所产。在来宾市地区所采集到的广金钱草为当地农户引种的野生广 金钱草，产量很小，近年由于收购的价格低，大多农户不再种植，改种其他作物 (如桉树)。

与桂林地区所种植的广金钱草聚为一类的还有广东省紫金县所种植的药材， 这与采样时所询问到的引种情况完全一致。当地所使用的广金钱草种子采购于桂 林。

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