一种利用ISSR指纹图谱鉴定咖啡种质资源的方法

摘要

本发明涉及生物信息技术领域，公开了一种利用ISSR指纹图谱鉴定咖啡种质资源的方法。该方法将标准咖啡品种DNA用SEQ？ID？NO:1和/或2所示序列引物进行PCR扩增，根据扩增产物的凝胶电泳结果以咖啡品种编号和条带存在位点编号为横、纵坐标，在每一横、纵坐标交结处记录标准咖啡品种条带的检测结果，得到标准咖啡品种的ISSR指纹图谱；将待测咖啡品种DNA用同样引物PCR扩增，扩增产物按上述方法构建待测咖啡品种的ISSR指纹图谱，并与标准咖啡品种的ISSR指纹图谱比对判断。本发明应用ISSR分子标记技术从遗传本质上对咖啡种质资源进行了准确鉴定，解决了咖啡种质鉴定困难的问题，且简单、易操作，检测迅速。

说明书

技术领域

本发明涉及生物信息技术领域，具体的说是涉及一种ISSR指纹图谱鉴定 咖啡种质资源的方法。

背景技术

咖啡与可可、茶并列世界三大饮料作物，其产量、消费量、经济价值均 占首位，是一种高附加值的热带经济作物。国内主产区在云南和海南，种植 面积已达180余万亩，产量11多万吨，产值达16亿元。以往咖啡的分类主要是 依靠形态学的方法，然而由于大多数形态性状受环境等因数影响大，很难进 行种质鉴定和良种选育的要求。DNA分子标记技术是一种快速高效的遗传分 析方法，已经广泛地应用于植物的遗传研究，分子标记辅助育种已经在水稻、 小麦和棉花等重要经济作物的研究和生产中得到应用，并取得明显的经济效 益。

DNA分子标记能反映生物个体或种群基因组中某种差异特征的DNA片 段，可以从根本上揭示植物内在的基因差异，近年来已经广泛应用到作物品 种鉴定和种质资源分类等研究领域。目前，应用较多的是SSR、ISSR、RAPD 和AFLP等分子标记。其中，ISSR(Inter-simplesequencerepeat)，即简单序 列重复区间扩增，是由加拿大蒙特利尔大学Zietkiewicz等于1994年创建的一 种分子标记技术，其原理是在SSR的3＇或5＇端锚定1-4个碱基作为引物， 对两侧具有反向排列SSR的一段序列进行扩增，而不是扩增SSR本身。锚定碱 基避免了SSR在基因组上的滑动，因而大大提高了PCR扩增的稳定性和可重复 性。

ISSR分子标记技术兼具SSR、RAPD、RFLP、AFLP等分子标记的优点， 与SSR相比，ISSR不需要预先获知序列信息而大大降低成本，且多态性更加 丰富；与RAPD相比，ISSR退火温度在55℃左右，保证了PCR扩增的稳定性 和重复性；与RFLP、AFLP相比，ISSR利用在植物基因组中常出现的简单 重复序列设计引物，无需预先克隆和测序，技术要求不高、速度较快、成本 低廉。目前，ISSR标记技术在种质资源的准确鉴定、遗传多样性、基因定位、 遗传图谱构建及分子标记辅助选择等研究中得到了广泛应用。但是在构建咖 啡DNA指纹图谱、并利用ISSR分子标记技术进行咖啡种质资源鉴定的方法尚 未见报道，而其他物种的种质资源的ISSR指纹图谱鉴定往往需要多达数条 ISSR引物来PCR扩增各品种DNA谱带的特异性，这在实际的鉴定过程中极为 不方便。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种利用ISSR指纹图谱鉴定咖啡种质 资源的方法，使该方法能够采用一至两条的较少引物对咖啡种质资源通过 ISSR分子标记技术准确、简便的鉴定。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种利用ISSR指纹图谱鉴定咖啡种质资源的方法，包括以下步骤：

步骤1、选取标准咖啡品种中的一种或两种以上，分别进行DNA提取， 然后采用SEQIDNO:1和/或SEQIDNO:2所示序列中的ISSR引物进行PCR 扩增，所得扩增产物进行凝胶电泳检测，根据凝胶电泳图结果以标准咖啡品 种编号和所有标准咖啡品种的条带存在位点编号为横、纵坐标，在每一个横、 纵坐标交结处记录标准咖啡品种条带的检测结果，将有扩增条带的标记为有 条带，无扩增条带的标记为无条带，得到标准咖啡品种的ISSR指纹图谱；

步骤2、提取待测咖啡品种的DNA，采用步骤1相同的ISSR引物进行 PCR扩增，将所得到的扩增产物进行凝胶电泳检测，根据凝胶电泳图结果以 待测咖啡品种编号和步骤1所述所有标准咖啡品种的条带存在位点编号为横、 纵坐标，在每一个横、纵坐标交结处记录待测咖啡品种条带的检测结果，将 有扩增条带的标记为有条带，无扩增条带的标记为无条带，得到待测咖啡品 种的ISSR指纹图谱，然后与所述标准咖啡品种的ISSR指纹图谱进行比对判 断。

其中，本发明对PCR扩增的反应体系及扩增程序进行了优化，避免了试 验过程人为产生的误差，使结果更为稳定和可靠。

作为优选方案，本发明所述PCR扩增体系为：反应总体积为20μL，其中 Mg²⁺浓度为1.5mmol/L、dNTP浓度为0.3mmo/L、引物浓度为0.4μmol/L、咖 啡品种的DNA用量为20ng、TaqDNA聚合酶用量为1.0U、2μL10×PCRbuffer。

其中，若引物不止一条，则每条引物的浓度均为0.4μmol/L。

作为优选方案，所述PCR扩增程序为：

94℃预变性4min；

94℃变性15s、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃或55℃复性1min、72℃ 延伸78s，循环40次；

72℃延伸7min，4℃保存。

本发明所述凝胶优选为琼脂糖凝胶电泳，所述琼脂糖凝胶电泳进一步优 选采用胶浓度为1.3％的琼脂糖凝胶。

在本发明的具体实施方式中，本发明选取了30种标准咖啡品种为咖啡种 质资源材料(见表1)对本发明所述方法的准确性进行验证。由于实际情况限 制，本发明不能穷举咖啡品种验证上述引物是否能够区分本领域所有品种， 但是本发明只需SEQIDNO:1所示序列的ISSR引物可以区分本发明所采用的 30个咖啡品种的28种，仅有2种需要SEQIDNO:2所示序列引物共同鉴定。

除此之外，按照本发明所述方法还可以将表1标准咖啡种质资源之外的 其他咖啡种质资源构建标准咖啡品种的ISSR指纹图谱，或者将现有所知的标 准咖啡种质资源构建标准咖啡品种的ISSR指纹图谱，如此便可鉴定更多的待 测咖啡品种。

表1标准咖啡种质资源表

编号 咖啡品种 编号 中文名 编号 中文名 1 27号 11 兴30 21 卡帝莫(巴西) 2 24号 12 兴29 22 CTM1 3 热研1号 13 兴28 23 CTM2 4 24-2 14 26号 24 CTM4 5 24-10号 15 热研2号 25 CTM19 6 24-11号 16 S288 26 黄果 7 兴34 17 喀麦隆 27 紫叶 8 兴33 18 蒙多诺沃 28 S28 9 兴32 19 卡杜拉(高) 29 铁毕卡 10 兴31 20 马来西亚2号 30 波邦

在本发明所述方法的指纹图谱构建过程中，所述将有扩增条带的标记为 有条带以及将无扩增条带的标记为无条带的步骤，可自行设定有条带和无条 带的代表符号，如“+”和“－”、“√”和“×”、“有”和“无”等等， 而本发明优选，所述标记为有条带标记为1，所述标记为无条带标记为0，以 便和电子设备联用，提高条带识别和处理的效率。此外，咖啡品种编号可以 为横坐标也可以为纵坐标，相应的，条带存在的位点编号可以为纵坐标也可 以为横坐标，这属于表示形式的不同，本发明不做具体限制。同时，待测咖 啡品种ISSR指纹图谱与标准咖啡品种的ISSR指纹图谱比对时，需完全一致 才能认定是所属咖啡品种。

为了便于理解本发明构思，对本发明所述方法中提到的“根据凝胶电泳 图结果以标准咖啡品种编号和所有标准咖啡品种的条带存在位点编号为横、 纵坐标”进行解释说明，如下：

先确定一个扩增条带数最多的品种(也可选择其他任意一个品种，选择 条带数最多的只是为了方便统计条带存在位点)，然后以这个品种的条带为 参照，结合其他品种的条带位置，将其自己的条带和与其他品种不重合的条 带一并标为条带存在位点，编号作为纵坐标，以下表为例，假设其为凝胶电 泳图。

咖啡品种D有4条条带，以其为基础，结合其他A、B、C三个品种的条 带，将所有不重合的条带一并从头编号记为条带存在位点编号D1-D5，如此 只要在D2-D5条带存在位点处有条带而在D1条带存在位点处无条带的品种 就可鉴定为咖啡品种D，以此类推。

为验证本发明所述方法的准确性，本发明以表1中的标准咖啡种质资源 为材料，构建标准咖啡品种的ISSR指纹图谱，另外选取两种未知、待测的咖 啡品种按本发明所述方法进行鉴定，同时将这两种未知、待测的咖啡品种与 中国热带农业科学院香料饮料研究所咖啡种质资源圃活体保存种质进行对比 鉴定。按照本发明所述方法鉴定的结果为：其中一株不属于上述标准咖啡品 种的ISSR指纹图谱中的任何一种(由于标准咖啡品种选取数量的限制未能鉴 定出待测咖啡的品种)，而另一株鉴定为兴28；中国热带农业科学院香料饮 料研究所咖啡种质资源圃鉴定结果为：其中一株为兴1，而另一株鉴定为兴 28，此结果与本发明所述方法鉴定结果一致，表明本发明所述方法高度的准 确性。

除此之外，按照本发明所述方法还可以将表1标准咖啡种质资源之外的 其他咖啡种质资源构建标准咖啡品种的ISSR指纹图谱，或者将现有所知的所 有标准咖啡种质资源构建标准咖啡品种的ISSR指纹图谱，如此便可鉴定更多 的待测咖啡品种。

由以上技术方案可知，本发明选取适合于咖啡种属的ISSR引物，应用 ISSR分子标记技术从遗传本质上对咖啡种质资源进行准确鉴定，解决了长期 以来咖啡种质鉴定困难的问题，且简单、易操作，检测迅速，为我国咖啡种 质资源的准确鉴定、育种利用和新品种权保护提供了重要依据，为我国咖啡 种质资源标准指纹库的构建奠定了基础。

附图说明

图1所示为本发明实施例1以SEQIDNO:1引物扩增标准咖啡品种后的 琼脂糖凝胶电泳图；

其中，M为DNAMarker，1-30依次表示表1中咖啡品种的标号；

图2所示为本发明实施例1以SEQIDNO:2引物扩增标准咖啡品种的琼 脂糖凝胶电泳图；

其中，M为DNAMarker，1-30依次表示表1中咖啡品种的标号。

具体实施方式

本发明实施例公开了一种利用ISSR指纹图谱鉴定咖啡种质资源的方法。 本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出 的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都 被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关 人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进 行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明在提取DNA的过程中可以采用本领域常用方法提取DNA，也可 采用商用DNA提取试剂盒进行提取。在本发明具体实施过程中，采用天根新 型植物基因组DNA提取试剂盒提取植物总DNA，同时利用琼脂糖凝胶电泳 和总分光光度计检测DNA质量，使提取的总DNA完整性好，且A260/A280 比值在1.6-2.0之间，稀释至10ng/μL，-80℃保存备用。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种利用ISSR 指纹图谱鉴定咖啡种质资源的方法进行详细说明。

实施例1：构建标准咖啡品种的ISSR指纹图谱

1、DNA提取

以表1中不同咖啡种质资源的半成熟新鲜叶片为材料，用天根新型植物 基因组DNA提取试剂盒提取植物总DNA，利用琼脂糖凝胶电泳和总分光光 度计检测DNA质量，使提取的总DNA完整性好，且A260/A280比值在 1.6-2.0之间，稀释至10ng/μL，-80℃保存备用；

2、ISSR-PCR扩增

反应总体积为20μL，其中Mg²⁺浓度为1.5mmol/L、dNTP浓度为0.3mmo/L、 引物(SEQIDNO:1-2所示序列)浓度为0.4μmol/L、咖啡品种的DNA用量为 20ng、TaqDNA聚合酶用量为1.0U、2μL10×PCRbuffer。

PCR扩增仪中建立反应程序，反应程序包括

94℃预变性4min；

94℃变性15s、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃或55℃复性1min、72℃ 延伸78s，循环40次；

72℃延伸7min，4℃保存。

3、ISSR-PCR扩增结果检测

采用琼脂糖凝胶电泳法，胶浓度为1.3％，经DuGreen染色后在天能4200 紫外凝胶成像系统中观察并记录结果，结果见图1和图2；

4、标准咖啡品种的ISSR指纹图谱构建

为方便以后的鉴定工作，本实施例根据凝胶成像的条带信息建立指纹图 谱，应用指纹图谱自动识别系统Gel2.0、Crosschecker、IMAGEpackage对所 述咖啡种质资源的DNA特征条带进行识别和处理，以所有标准咖啡品种的条 带存在位点编号为纵坐标，以标准咖啡品种编号为横坐标，在每一个横、纵 坐标交结处记录标准咖啡品种条带的检测结果，有扩增谱带记录为“1”，没 有扩增谱带记录为“0”，构建出标准咖啡品种的ISSR指纹图谱。

按照本实施例方法构建指纹图谱，见表2、表3，凝胶图见图1和图2。

表2标准咖啡品种的ISSR(SEQIDNO:1引物)指纹图谱

表3标准咖啡品种的ISSR(SEQIDNO:2引物)指纹图谱

注：1-30代表的咖啡品种见表1。

实施例2：待测咖啡品种的鉴定

选取两种未知咖啡品种为待测材料，按照实施例1中的方法进行DNA提 取、ISSR-PCR扩增、ISSR-PCR扩增结果检测；

根据凝胶成像的条带信息建立指纹图谱，应用指纹图谱自动识别系统 Gel2.0、Crosschecker、IMAGEpackage对所述咖啡种质资源的DNA特征条 带进行识别和处理，以实施例1中所有的标准咖啡品种的条带存在位点编号 为横坐标，以待测咖啡品种编号为纵坐标，在每一个横、纵坐标交结处记录 待测咖啡品种条带的检测结果，有扩增谱带记录为“1”，没有扩增谱带记录 为“0”，构建出待测咖啡品种的ISSR指纹图谱，见表4和表5。

表4待测咖啡品种的ISSR(SEQIDNO:1引物)指纹图谱

表5待测咖啡品种的ISSR(SEQIDNO:2引物)指纹图谱

分别将表4和表2、表5和表3进行比对，未知咖啡品种1与所建立的标 准咖啡品种的ISSR指纹图谱不同，证明其不属于表1中的30种咖啡品种的 任意一种；而未知咖啡品种2与所建立的标准咖啡品种的ISSR指纹图谱中的 标准咖啡品种编号13的指纹图谱完全一致，鉴定为兴28。

同时将这两种未知、待测的咖啡品种与中国热带农业科学院香料饮料研 究所咖啡种质资源圃活体保存种质进行对比，鉴定结果为：其中一株为兴1， 而另一株鉴定为兴28，此结果与本发明所述方法鉴定结果一致，表明本发明 所述方法高度的准确性。

为了进一步证明本发明所述方法的准确性，按照实施例1的方法构建标 准兴1咖啡品种的ISSR指纹图谱(仍以所有的标准咖啡品种的条带存在位点 编号和标准咖啡品种编号为横、纵坐标)，结果与表4、表5中未知咖啡品种 1的ISSR指纹图谱完全一致，表明本发明所述方法具有高度准确性。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当 指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下， 还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要 求的保护范围内。