一种RNA及其用途、包含该RNA的组合物、重组表达载体和宿主细胞

摘要

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种RNA及其用途、包含该RNA的组合物、重组表达载体和宿主细胞。该RNA能有效抑制Hsa-miR-222的表达水平，增强TRAIL对肿瘤的杀伤活性。本发明提供的重组病毒是有生物学活性的，有希望成为肿瘤基因治疗的候选病毒。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种RNA及其用途、包含该RNA 的组合物、重组表达载体和宿主细胞。

背景技术

肿瘤是威胁人类健康的头号杀手之一，并且目前并没有十分有效的手段 来治疗肿瘤。传统的治疗方法，如化疗、放疗、手术和靶向药物，尽管最初 能成功控制住肿瘤，但往往又会反过来诱导宿主细胞产生一系列其他的行为， 进而最终导致肿瘤的复发、扩散和转移。基因治疗由于其针对性强、靶向性 好、有效和基本无毒副作用等优点，这些年正在越来越受到人们的青睐和关 注。TRAIL(tumornecrosisfactor-relatedapoptosisinducingligand) 属于肿瘤坏死因子(TNF)家族成员，因其可以选择性地杀死肿瘤细胞， 但对绝大多数正常组织没有毒性而成为癌症基因治疗的研究热点之一。研究 表明静脉多次注射重组可溶性TRAIL可诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤的生长 和形成，延长实验动物的生存时间的同时却不引起可监测到的毒性发生。尽 管它可以诱导多种肿瘤细胞凋亡，但不同的肿瘤细胞对TRAIL的敏感性不同， 因此增强抗性细胞对TRAIL的敏感性具有良好的临床应用前景。

目前研究表明，TRAIL抗性的机制在不同细胞中是不同的，有诸如假受 体占位、细胞内部抗凋亡分子的高表达等假说，但是有些假说验证困难，且 目前并没有十分有效的方法来改善TRAIL抗性问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种RNA及其用途、包含该RNA的组合物、重 组表达载体和宿主细胞。该RNA能有效抑制miR-222的表达水平，增强TRAIL 对A549的杀伤活性。本发明提供的重组病毒是有生物学活性的，有希望成为 肿瘤基因治疗的候选病毒。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种RNA，其特征在于，其具有：

(Ⅰ)、如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列；或

(Ⅱ)、如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列的互补序列；或

(Ⅲ)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码 的简并性而与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列不同的序列；或

(Ⅳ)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)或(Ⅲ)所述序列至少有70％同源性的序列。

本发明还提供了所述RNA用于抑制Hsa-miR-222的用途。

本发明还提供了一种组合物，包括TRAIL_95-281和所述的RNA。

本发明还提供了所述组合物的制备方法：

步骤1：将编码TRAIL_95-281与所述的RNA的核苷酸序列连接到载体中， 构建表达载体；

步骤2：将所述表达载体转化宿主细胞，表达，收集表达产物，即得。

本发明还提供了一种重组表达载体，包括：

(1)编码TRAIL_95-281的核苷酸序列；和/或

(2)编码本发明所述RNA的核苷酸序列。

在本发明的一些具体实施方案中，所述重组表达载体的构建方法，将编 码TRAIL_95-281与所述RNA的核苷酸序列连接到载体中，构建表达载体。

在本发明的一些具体实施方案中，所述重组表达载体的构建方法中的载 体为质粒或病毒。

在本发明的一些具体实施方案中，所述重组表达载体的构建方法中病毒 为腺相关病毒。

本发明还提供了一种宿主细胞，包括所述的重组表达载体。

所述重组表达载体的结构为 pAM-CAG-pL-INS-TRAIL_95-281-polyA-U6-miR-222-TuD-WPRE-BGHpolyA的 AAV重组表达载体,简称AAV-TRAIL-miR-222-TuD。

所述重组表达载体包括:pAM(theabbreviationoftheplasmidof anti-ampcilinconstruction)、ITR(adeno-associatedvirus2invertedterminalrepeat sequence)、CAG(cytomegalovirusimmediated-earlyenhancer/chickenβ-actin hybrid)、INS(humanInsulin)secretionsignalpeptide、pL(poly-linker)、 TRAIL_95-281(编码TRAIL第95至281位氨基酸)、polyA(多聚腺苷酸)、 U6、miR-222-TuD、WPRE(WoodchuckHeptitisVirusPosttranscriptional RegulatoryElement)、BGH(Bostaurusgrowthhormone)、polyA(多聚腺苷酸) 和ITR(adeno-associatedvirus2invertedterminalrepeatsequence)。

其中，ITRsequence(PatentWO0220748)的序列如SEQIDNo.5所示；CAG sequence的序列如SEQIDNo.6所示；INSsecretionsignalpeptidesequence (Genbankaccessionno.NM000207)的序列如SEQIDNo.7所示；WPRE sepuence(Genbankaccessionno.J04514)的序列如SEQIDNo.8所示； BGH(Bostaurusgrowthhormone)pAsequence的序列如SEQIDNo.9所示； TRAIL_95-281aminoacidsequence(PatentZL03138357.2)的序列如SEQID No.10所示。

在本发明的一些具体实施方案中，所述宿主细胞为细胞株，所述细胞株 选自HeLa细胞、A549细胞、Bel-7402细胞、CNE-2Z细胞、EC109细胞、 MGC-803细胞、SW1990细胞、DU145细胞、U251细胞、A875细胞、HCT116 细胞、MCF7细胞或SK-OV-3细胞。

本发明还提供了所述组合物、所述重组表达载体、所述宿主细胞在制备 治疗肿瘤的药物中的应用。

在本发明的一些具体实施方案中，所述肿瘤为原发性、继发性或转移性 的肿瘤。

在本发明的一些具体实施方案中，所述肿瘤包括肺癌、肝癌、鼻咽癌、 食管癌、结直肠癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、乳 腺癌、宫颈癌或卵巢癌。

本发明的实验证明，在HeLa细胞、A549细胞、Bel-7402细胞、CNE-2Z 细胞、EC109细胞、MGC-803细胞、SW1990细胞、DU145细胞、U251细胞、 A875细胞、HCT116细胞、MCF7细胞、SK-OV-3细胞中转染了Has-miR-222 的mimics以后能增强细胞对TRAIL的抗性，而转染了Has-miR-222的inhibitor 以后能增强细胞对TRAIL的敏感性(图1)。人工设计的miR-222特异性抑 制剂TuD(图2A)，并在原有pAM/CAG-TRAIL载体基础上加入polyA以终 止II类启动子CAG，然后插入一个新的III类启动子U6来表达miR-222-TuD (图2B)。将构建好的共表达质粒转入到293T细胞中验证各个抑制剂对 miR-222的靶向抑制作用，miR-222-TuD能有效抑制miR-222的表达水平(图 2C)。将各个共表达质粒转入Hela中，用AnnexinV-FITC/PI双染细胞凋亡 检测试剂盒流式检测细胞凋亡，可以看到，miR-222-TuD能增强TRAIL对Hela 的杀伤活性(图2D)。

采用辅助病毒缺陷包装系统进行该重组共表达载体的包装，病毒用碘克 沙醇密度梯度超速离心纯化，超滤浓缩，Real-timePCR确定其最终滴度。同 样方法制备和包装编码绿色荧光蛋白(EGFP)的AAV重组病毒(AAV-EGFP) 作为阴性对照，只编码TRAIL蛋白的AAV-TRAIL作为阳性对照。将 AAV-EGFP病毒侵染293细胞和A549细胞72h后，观察细胞的荧光表达情 况，可以看到细胞被成功侵染并表达了绿色荧光蛋白(图3A)。将AAV-EGFP、 AAV-TRAIL、AAV-TRAIL+miR-222-TuD分别侵染293细胞，检测到在被 AAV-TRAIL和AAV-TRAIL+miR-222-TuD侵染后，TRAIL的表达水平明显 升高(图3B)，而被AAV-TRAIL+miR-222-TuD侵染后，miR-222的表达被 明显抑制(图3C)。在A549裸鼠体内移植瘤实验中，经AAV-TRAIL治疗 后，肿瘤生长受到抑制，但在AAV-TRAIL+miR-222-TuD联合治疗组可以看 到更明显的生长抑制(图4)，并且miR-222-TuD是通过靶向抑制miR-222 间接促进其靶基因PTEN来发挥作用(图5)，表明得到的重组病毒是有生物 学活性的，有希望成为肿瘤基因治疗的候选病毒。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实 施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示miR-222对TRAIL抗性的影响；转染了miR-222的mimics 和inhibitors以后，再用TRAIL蛋白刺激人宫颈癌细胞Hela、人肺腺 癌细胞A549、人肝癌细胞Bel-7402、人鼻咽癌细胞CNE-2Z、人食 管癌细胞EC109、人胃癌细胞MGC-803、人胰腺癌细胞SW1990、 人前列腺癌细胞DU145、人神经胶质瘤细胞U251、人黑色素瘤细 胞A875、人乳腺癌细胞MCF7、人结直肠癌细胞HCT116、人卵巢 癌细胞SK-OV-3对细胞的杀伤作用；

图2示pAM/CAG-TRAIL-U6-miR-222-TuD共表达质粒的构建 及功能验证，其中图2(A)：miR-222-TuD的序列设计；图2(B)： pAM/CAG-TRAIL-polyA-U6-miR-222-TuD共表达载体的表达结 构；图2(C)：共表达质粒转染293T细胞后对miR-222表达水平的影响；图 2(D)：流式检测共表达质粒转染Hela细胞后对细胞凋亡的影响；

图3示重组病毒的生物学活性；图3(A)示AAV-EGFP可以成 功侵染293细胞和A549细胞并使其表达绿色荧光蛋白；图3(B) AAV-TRAIL和AAV-TRAIL+miR-222-TuD在侵染293细胞后可以成 功过表达TRAIL；图3(C)AAV-TRAIL+miR-222-TuD可以有效敲 低miR-222的表达水平；

图4示A549荷瘤小鼠经重组AAV-TRAIL和AAV-TRAIL+miR-222- TuD处理后，皮下瘤的生长受到抑制，并且AAV-TRAIL+miR-222-TuD能促 进AAV-TRAIL的使用效果，明显抑制肿瘤生长；图4(A)皮下瘤受抑制的 形态学观察；图4(B)给药后瘤体积变化的动态观察；处图4(C)死时瘤重 的差异；

图5示miR-222-TuD通过调节靶基因PTEN的变化水平发挥作用结果：图5 (A)示PTEN是miR-222靶基因；图5(B)示miR-222-TuD在体内可以上调PTEN 表达水平。

具体实施方式

本发明公开了一种RNA及其用途、包含该RNA的组合物、重组表达载 体和宿主细胞，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。 特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易 见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施 例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文 所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明的第一个目的在于提供Hsa-miR-222在不同细胞系中 对TRAIL抗性的影响。

所述不同细胞系为HeLa细胞、A549细胞、Bel-7402细胞、CNE-2Z细胞、 EC109细胞、MGC-803细胞、SW1990细胞、DU145细胞、U251细胞、A875 细胞、HCT116细胞、MCF7细胞、SK-OV-3细胞。

本发明的第二个目的在于提供一种载体，所述载体表达TRAIL_95-281(编 码TRAIL第95至281位氨基酸)蛋白。

本发明的第三个目的在于设计Hsa-miR-222特异性抑制剂TuD，其序列 如SEQIDNO.1所示。

所述特异性抑制剂TuD可以介导miRNA的降解，其构建入载体中的DNA 序列如SEQIDNO.2所示。

本发明的第四个目的在于提供一种分泌型的可溶性人TRAIL_95-281和 miR-222的抑制剂TuD共表达载体的制备方法，此表达载体的结构为 pAM-CAG-pL-INS-TRAIL_95-281-polyA-U6-miR-222-TuD-WPRE-BGHpolyA的 AAV重组表达载体,简称AAV-TRAIL-miR-222-TuD。

所述载体包括:pAM(theabbreviationoftheplasmidofanti-ampcilin construction)、ITR(adeno-associatedvirus2invertedterminalrepeatsequence)、 CAG(cytomegalovirusimmediated-earlyenhancer/chickenβ-actinhybrid)、 INS(humanInsulin)secretionsignalpeptide、pL(poly-linker)、TRAIL_95-281(编 码TRAIL第95至281位氨基酸)、polyA(多聚腺苷酸)、U6、miR-222-TuD、 WPRE(WoodchuckHeptitisVirusPosttranscriptionalRegulatoryElement)、 BGH(Bostaurusgrowthhormone)、polyA(多聚腺苷酸)和ITR(adeno-associated virus2invertedterminalrepeatsequence)。

其中，ITRsequence(PatentWO0220748)的序列如SEQIDNo.5所示； CAGsequence的序列如SEQIDNo.6所示；INSsecretionsignalpeptide sequence(Genbankaccessionno.NM000207)的序列如SEQIDNo.7所示； WPREsepuence(Genbankaccessionno.J04514)的序列如SEQIDNo.8所示； BGH(Bostaurusgrowthhormone)pAsequence的序列如SEQIDNo.9所示； TRAIL_95-281aminoacidsequence(PatentZL03138357.2)的序列如SEQID No.10所示。

所述载体为质粒或病毒，所述病毒为腺相关病毒。

本发明的第五个目的在于提供一种组合物，包括TRAIL_95-281和抑制 Hsa-miR-222的RNA。

所述组合物中，所述抑制Hsa-miR-222的RNA为TuD，其序列如SEQID NO.1所示。

本发明的第六个目的在于提供上述任一项的载体、组合物或细胞株在治 疗癌症或肿瘤中的用途。

所述癌症或肿瘤为原发性、继发性或转移性的肿瘤。

所述的用途中，所述肿瘤包括宫颈癌、肺癌、肝癌、鼻咽癌、食管癌、 结直肠癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、乳腺癌、卵 巢癌。

在本发明中，采用基因工程等现代生物学技术和方法，提供了编码人 TRAIL_95-281和miR-222-TuD重组AAV共表达载体和病毒的制备、包装、及其 应用。

本发明提供了RNA及其用途、包含该RNA的组合物、重组表达载体和 宿主细胞。其中，如无特殊说明，实施例中涉及的各种反应试剂均可以通过 商业渠道购买得到；如无特殊说明，实施例中涉及的具体操作参见《分子克 隆实验指南第三版》。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1miR-222对TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡活性的影响采用CCK-8法检 测

分别取2×10⁵的HeLa细胞、A549细胞、Bel-7402细胞、CNE-2Z细胞、 EC109细胞、MGC-803细胞、SW1990细胞、DU145细胞、U251细胞、A875 细胞、HCT116细胞、MCF7细胞、SK-OV-3细胞(体积为2ml)接种到6孔 板中，分别转染由Invitrogen公司人工合成的模拟物对照、miR-222模拟物、 抑制剂对照、miR-222抑制剂48h以后，将细胞消化下来接种于96孔板中， 每孔8000个细胞，加入TRAIL蛋白至终浓度100ng/ml，刺激24h，去掉培养 基，每孔加入110μl含CCK-8的培养基(100μl培养基加10μlCCK-8)，37℃ 温育，每隔一小时于MD/SPECTRAMAX340分光光度仪上读取450nm处光 吸收值，计算细胞成活率(细胞成活率＝实验组光吸收值/对照组光吸收值 ×100％)。每一组设定五个样品孔，每组实验重复三次。

miR-222过表达能够引起细胞对TRAIL的抗性，具体见图1(A)～图1 (C)。

转染了miR-222的模拟物和抑制剂以后，再用TRAIL蛋白刺 激人宫颈癌细胞Hela、人肺腺癌细胞A549、人肝癌细胞Bel-7402、 人鼻咽癌细胞CNE-2Z、人食管癌细胞EC109、人胃癌细胞 MGC-803、人胰腺癌细胞SW1990、人前列腺癌细胞DU145、人神 经胶质瘤细胞U251、人黑色素瘤细胞A875、人乳腺癌细胞MCF7、 人结直肠癌细胞HCT116、人卵巢癌细胞SK-OV-3对细胞的杀伤作 用。

实施例2pAM/CAG-TRAIL-polyA-U6-miR-222-TuD共表达质 粒的构建

将U6启动子(如SEQIDNo.3所示)用PCR扩出来以后用 Taq酶加a，切胶回收，连入到T载体中。同时人工合成polyA尾 序列 GGCCGCAATAAAATATCTTTATTTTCATTACATCTGTGTGTTGG TTTTTT(如SEQIDNo.4所示)，退火，用EcoRV单酶切连入了 U6启动子的T载体(EcoRV酶切位点在U6启动子的上游)，将 polyA序列以平端方式连入T载体中，得到polyA和U6启动子串 联的序列。人工合成miR-222-TuD序列，并在上游加上SpeI酶切 位点黏末端，在下游加上HindIII酶切位点和SacI酶切位点黏末端， 同时用SpeI和SacI双酶切连有polyA和U6的T载体(SpeI和SacI 在U6的下游)，将miR-222-TuD序列连入其中，得到 polyA-U6-miR-222-TuD串联的序列。这样以来，在polyA上游的 T载体上有一个原本存在的HindIII酶切位点，而在miR-222-TuD 的下游，有一个我们自己引入的HindIII酶切位点，用HindIII单 酶切该重组T载体，切胶纯化得到我们的目的序列，同时HindIII 单酶切已预先存在的pAM/CAG-TRAIL的rAAV2包装载体 (HindIII酶切位点在TRAIL的下游)，将两部分用T4连接酶连 接在一起，测序鉴定正反向，得到目的重组质粒。经验证功能， TRAIL和miR-222-TuD联合应用的治疗效果很好，因而采用辅助 病毒缺陷包装系统进行该重组AAV-TRAIL-miR-222-TuD载体的 包装，病毒分别采用碘克沙醇密度梯度超速离心纯化，超滤浓缩， Real-timePCR确定其最终滴度。

pAM/CAG-TRAIL-U6-miR-222-TuD共表达质粒的构建及功能 验证结果：

图2(A)示miR-222-TuD的序列设计；

图2(B)示pAM/CAG-TRAIL-polyA-U6-miR-222-TuD共表达载 体的表达结构；

图2(C)示共表达质粒转染293T细胞后对miR-222表达水平的影响；

图2(D)示流式检测共表达质粒转染Hela细胞后对细胞凋亡的影响。

实施例3重组AAV-TRAIL+miR-222-TuD及其生物学活性测定

人胚肾细胞HEK293T在DMEM完全培养基(DMEM培养基添加10％ 的胎牛血清，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)中培养6h以上，1×PBS 洗涤后加入2×10⁹Gps实施例2制备的重组病毒(培养基为DMEM未添加胎 牛血清，剂量为1×10⁴Gps/细胞)，2-4小时后添加DMEM完全培养基继续培 养。在分别转导重组病毒AAV-EGFP、AAV-TRAIL、 AAV-TRAIL+miR-222-TuD后，裂解人胚肾细胞HEK293T，用TRIzol 提取RNA，进行qPCR检测。

重组AAV病毒的生物学活性检测结果：

其中AAV-EGFP可以成功侵染293细胞和A549细胞并使其表 达绿色荧光蛋白，见图3(A)；

AAV-TRAIL和AAV-TRAIL+miR-222-TuD在侵染293细胞后 可以成功过表达TRAIL，见图3(B)；

AAV-TRAIL+miR-222-TuD可以有效敲低miR-222的表达水 平，见图3(C)。

实施例4WesternBlot

分别注射了AAV-EGFP、AAV-TRAIL、AAV-TRAIL+miR-222-TuD 的肿瘤组织或细胞经裂解液(含1％NonidetP-40、0.35mg/mlPMSF、9.5μg/ml leupeptin和13.7μg/mlpepstatinA的1×PBS)裂解后，12000rpm离心去沉淀， 上清液经BCA蛋白分析试剂盒(PierceChemicalCompany)测定蛋白浓度后进 行SDS-PAGE凝胶电泳，转移至PVDF膜后4℃封闭过夜，经一抗(抗PTEN 多克隆抗体，1:1000稀释于封闭液中，室温2h)、二抗(HRP标记的羊抗兔 抗体1:10000稀释于封闭液中，室温1h)孵育后，彻底洗涤，然后利用ECL系 统(AmershamPharmaciaBiotechCo.)进行蛋白显色。检测PTEN在肿瘤内表 达情况，可以看到在AAV-TRAIL+miR-222-TuD组PTEN表达明显上 调。

miR-222-TuD通过调节靶基因PTEN的变化水平发挥作用结果：

(1)PTEN是miR-222的预测靶基因，见图5(A)；

(2)注射AAV-TRAIL+miR-222-TuD的肿瘤组织中，PTEN表达水平明 显上调，见图5(B)。

实施例5AnnexinV-FITC/PI双染法流式测定细胞凋亡

按照细胞凋亡试剂盒(BD-FITCAnnexinVApoptosisDetectionKitI)说明 书进行。细胞经0.25％EDTA消化处理后，离心，用冰的PBS洗两次，用 1×BindingBuffer重悬为1×10⁶cells/ml，取100μl细胞悬液(1×10⁵cells)，加 入5μlFITCAnnexinV和5μlPI，轻柔混匀，室温避光孵育15分钟。加入400 μl1×BindingBuffer，1小时内用流式细胞仪检测。

双染法流式测定细胞凋亡结果：

转染单独表达TRAIL的质粒能引起Hela细胞凋亡，而转染了TRAIL与 miR-222-TuD的共表达质粒后，明显促进了对Hela的凋亡作用，见图2(D)。

实施例6小鼠动物模型的建立

取5至6周龄、体重约20g的Balb/c裸鼠，皮下接种2×10⁶人肺癌细胞 A549，每三或四天测量一次肿瘤的长短径，计算瘤体积(体积＝1/2×长径×短 径²)。实验结束时断颈处死裸鼠，肿瘤或各组织样品称重后经液氮冷冻后贮 存在-70℃或在4％paraformaldehyde固定。

实施例7荷瘤小鼠的实验治疗与观察

取5至6周龄、体重约20g的Balb/c裸鼠，皮下接种2×10⁶人肺癌细胞 A549，(1×PBS悬液100μl)，即实施例6制备的小鼠动物模型。肿瘤长至 100mm³时，将实验动物分成三组：a)AAV-EGFP阴性对照组；b)AAV-TRAIL 阳性对照组；c)AAV-TRAIL+miR-222-TuD重组病毒(病毒滴度10¹¹)治疗组。 每组5只，通过瘤内多点注射。每周观察不同组动物肿瘤的生长情况和生存 时间。做3批重复实验。

A549荷瘤小鼠经重组AAV-TRAIL和AAV-TRAIL+miR-222-TuD处理 后，皮下瘤的生长受到抑制，并且AAV-TRAIL+miR-222-TuD能促进 AAV-TRAIL的使用效果，明显抑制肿瘤生长：

(1)皮下瘤受抑制的形态学观察，见图4(A)；

(2)给药后瘤体积变化的动态观察，见图4(B)；

(3)处死时瘤重的差异，见图4(C)。

过去几十年的研究显示，TRAIL在肿瘤和免疫系统里均发挥着十分重要 的功能，是一个非常有治疗潜力的因子。和TNF家族其他配体成员比较， TRAIL具有如下三个优势：1)具有强大的和特异性诱导肿瘤细胞凋亡的能力， 但对正常细胞无此效应；2)比TNF-α和Fas-L有更广的抗癌谱；3)对NF-κB 仅有很微弱的激活作用，即使是全身用药，也不会像TNF-α和Fas-L那样产 生严重的炎症反应。因此许多生物技术和制药公司都以此针对激活肿瘤细胞 的死亡程序来设计药物，目前，不同的TRAIL受体激动剂，包括TRAIL本身， 和各种竞争性的抗DR4、DR5的单克隆抗体都作为新型的肿瘤治疗靶点在临 床试验当中。但是目前仍然有其面临的困境，比如抗性问题。

本专利中，Hsa-miR-222在多种细胞系中表现出了对TRAIL抗性的影响， 过表达miR-222的模拟物以后细胞对TRAIL抗性增强，而抑制掉miR-222以 后，细胞的凋亡率增加，即对TRAIL抗性减弱。因此我们设计了miR-222的 特异性抑制剂miR-222-TuD来和TRAIL联合应用。可以看到，Hela细胞作为 对TRAIL敏感的细胞株，在转染了只表达TRAIL的质粒以后，细胞是发生了 明显凋亡的，而在此基础之上，TRAIL+miR-222-TuD共表达质粒仍能显著增 强TRAIL的杀伤作用。A549同样作为对TRAIL比较敏感的细胞株，在用其 成瘤以后的动物实验中，分别注射包装的AAV病毒，和对照组相比，注射了 AAV-TRAIL组的肿瘤生长受到部分抑制，而注射AAV-TRAIL+miR-222-TuD 联合治疗的病毒组，肿瘤生长在AAV-TRAIL单独使用的基础之上又有更进 一步的凋亡。也就是说，对于TRAIL敏感的细胞，TRAIL+miR-222-TuD的 联合应用，仍能进一步增强细胞对TRAIL的敏感性，可以作为临床上降低 TRAIL使用剂量的新选择。

我们对Hsa-miR-222的靶基因进行了预测，选中了一些候选靶基因，将 肿瘤组织中的蛋白提取出来进行westernblot验证，最后发现，其靶基因PTEN 在AAV-TRAIL+miR-222-TuD联合治疗组是明显上调的。miRNA通过靶向抑 制其靶基因来发挥作用，而miR-222-TuD又是miR-222的特异性抑制剂，因 而在体内检测到其靶基因PTEN的上调，是和实际情况相符合的，一方面说 明miR-222-TuD在体内确实发挥了抑制miR-222的作用，另一方面说明其增 强TRAIL抗性功能的机制可能是通过PTEN。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普 通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润 饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。