治疗犬皮肤真菌病的药物组合物及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种治疗犬皮肤真菌病的药物组合物及其制备方法和应用，属于犬皮肤真菌病的药物制备和应用领域。本发明首先公开了一种治疗犬皮肤真菌病的药物组合物，包括以下各组分：全蝎提取物、姜黄提取物和昆布提取物。本发明进一步公开了制备所述复方抗真菌药物组合物的方法，包括：按所述质量份称取各组分，然后加入适宜辅料或载体，按照常规制备方法制备成兽用外用制剂。本发明还公开了一种疗效更佳的治疗犬皮肤真菌病的药物，该药物由彼此独立的组分1和组分2组成；其中，组分1包括全蝎提取物、姜黄提取物和昆布提取物；组分2为伊曲康唑。本发明治疗犬皮肤真菌病的药物组合物具有成本低、安全性好、疗效好、副作用小等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及一种治疗皮肤真菌病的复方抗真菌制剂，尤其涉及一种治疗犬皮肤真菌病的复方抗真菌药物组合物及其制备方法和应用，属于犬皮肤真菌病的药物制备和应用领域。

背景技术

犬作为人类最亲密的伴侣动物，在现在的生活中扮演着重要角色。不合理饲养管理犬只、不科学合理的洗浴、饮食营养不均衡、过量长期使用抗生素，以及城市的环境污染等，致使犬皮肤真菌病的发病呈现逐年增加的发展趋势。

皮肤真菌病(表面真菌病)，是指真菌侵染表皮及其附属构造的真菌性疾病。目前引起人和动物感染的真菌的种类有一千四百余种，其中可引起犬皮肤感染的真菌只有几十种。引起犬皮肤真菌病的病原菌种类繁多，其中主要为犬小孢子菌，有时也可检测到石膏状小孢子菌、疣状毛癣菌和须毛癣菌等。

皮肤真菌病的治疗方法除了化学药物治疗外，现在临床上还可以用中药、抗真菌香波和营养物质进行辅助治疗。中药治疗犬皮肤真菌病具有抗菌谱广、可在真菌细胞内产生多方面效应、且毒副作用小、不易产生耐药性的特点。近年来利用中药进行抗真菌作用研究取得了不少进展。外用抗真菌香波可用于皮肤真菌病的辅助治疗，它能够降低皮肤真菌病的传染性，但单独应用时治疗效果不佳。

针对上述问题，亟需找到一种能有效治疗皮肤真菌病的抗真菌制剂，以提高疗效。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种治疗犬皮肤真菌病的复方抗真菌制剂；

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种治疗犬皮肤真菌病的复方抗真菌制剂的制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：

本发明首先提供了一种治疗犬皮肤真菌病的复方抗真菌药物，由全蝎提取物、姜黄提取物和昆布提取物组成。

优选的，各组分的重量份的：全蝎提取物0.8-1.2份、姜黄提取物6-10份和昆布提取物30-50份；

更优选的，各组分的重量份是：全蝎提取物1份、姜黄提取物10份和昆布提取物40份。

其中，所述全蝎、昆布和姜黄的提取物采用水提取法或醇提取法制备，优选的为水提法，采用水提取法提取的各药物主要成分的得率要高于醇提取法；另外，所采用的水提法或醇提法均为本领域的常规提取方法，本领域技术人员可根据情况采用相应的提取方法，均能适用于本发明。

本发明还提供了另一种治疗犬皮肤真菌病的复方抗真菌药物组合物，由全蝎、姜黄和昆布制成。

优选的，各原料的重量份的：全蝎0.8-1.2份、姜黄6-10份和昆布30-50份；

更优选的，各原料的重量份是：全蝎1份、姜黄10份和昆布40份。

全蝎：拉丁学名:ButhusmartensiiKarsch，为钳蝎科动物东亚钳蝎的干燥体。全蝎的乙醇提取物对8种浅表致病真菌均有一定程度抑制作用，尤其对石膏样毛癣菌、裴氏着色菌、絮状表皮癣菌、中克氏孢子丝菌等较为敏感，其抑制真菌效果的作用明显优于大蒜的浸出液。

姜黄：拉丁学名:CurcumalongaL.，为姜科植物姜黄或郁金的根茎。姜黄的挥发油具有较强的抗真菌作用，其姜黄异构体也同样具有较强的抗真菌作用。将姜黄的有效成分制成外用药液，对各种手足癣都有程度不一的抗真菌作用。

昆布：为海带科植物海带或翅藻科植物昆布(鹅掌菜)的干燥叶状体。夏、秋二季采捞，晒干。不同浓度的昆布浸出液对常见皮肤真菌具有不同程度的抑菌作用。

本发明对复方抗真菌药物组合物的组分进行了筛选试验。首先对丁香、冰片、全蝎、肉桂、陈皮、椰壳、昆布、姜黄单剂的抑制真菌情况进行观察，筛选出抑菌效果最好的单剂全蝎，其MIC值最低，为0.94±0.34mg/mL；然后，进行全蝎与其他药物两两复合，发现全蝎与丁香、全蝎与昆布和全蝎与姜黄三组组合抑制真菌的效果好于其他组合，其MIC值均为1.04±0.32mg/mL；在此基础上，进行全蝎与其他两种药物复合，发现全蝎、昆布和姜黄的组合好于其他组合，因此，确定了全蝎、昆布、姜黄这三种中药作为抗菌复方药物组合物的组分。

在此基础上，本发明通过三因素三水平的复方抗真菌药物组合物的剂量确定试验，确定了该复方抗真菌药物组合物各组分的最佳重量份是：全蝎提取物1份、姜黄提取物10份和昆布提取物40份，即三者的用量质量比为1:10:40。

本发明还提供了一种制备治疗犬皮肤真菌病的药物组合物的制备方法，包括以下步骤：按所述质量份称取各组分，然后加入适宜辅料或载体，制备成外用制剂，即得。

所述辅料包括二甲亚砜、甘油或95％乙醇中的任意一种或任意多种按照任意比例组成的混合物。

所述外用制剂为贴剂、软膏、擦剂或喷雾剂；优选为喷雾剂。

本发明还提供了所述的复方抗真菌药物组合物在制备治疗犬皮肤真菌病的药物中用途。

为了进一步提高疗效，本发明将上述的复方抗真菌药物组合物与其它药物的联用进行了筛选，结果表明，将上述复方抗真菌制剂(即：蝎姜昆复方抗真菌制剂)与伊曲康唑注射液进行联合使用，治疗犬皮肤真菌的有效率达93.33％，显著高于蝎姜昆复方抗真菌制剂与888注射液或抗真菌一号注射液的联用效果。

因此，本发明更进一步提供了一种治疗犬皮肤真菌病的药物，该药物由彼此独立的组分1和组分2组成；其中，所述组分1为上述的复方抗真菌药物组合物；所述组分2为伊曲康唑。

本发明所述的复方抗真菌制剂采用喷洒的方式施药，其用量为0.1～0.2mL/cm²体表面积，一般2次/d，连续用药14天；伊曲康唑采用注射的方式施药，其用量为0.1mg/kg，1次/7d，连用2次；依病情可以适当增加用药次数和用药天数。

本发明对所述的复方抗真菌药物组合物的临床治疗效果进行了观察。通过对确诊为皮肤真菌病局部耳部感染、局部小面积感染和全身感染的三组犬，根据病情注射具有抗菌作用的药物，最终结果表明：在耳部感染组，蝎姜昆复方抗真菌制剂治疗效果最佳，有效率达80％，与尔康、耳特净的治疗效果比较，差异显著(P＜0.05)。在小面积感染组，蝎姜昆复方抗真菌制剂治疗效果最佳，有效率达86.67％，与本组其他药物的治疗效果比较，差异显著(P＜0.05)。在全身感染组，伊曲康唑+蝎姜昆复方抗真菌制剂治疗效果最佳，有效率达93.33％，与本组其他药物的治疗效果比较，差异显著(P＜0.05)，表明了本发明复方抗真菌制剂具有较好的治疗效果。

本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

本发明所述的复方抗真菌药物组合物在治疗犬皮肤真菌病中具有成本低、安全性好、有效率高、疗效好、副作用小等优点，克服传统抗真菌药物治疗的真菌病易复发、难治愈、疗程长等缺点。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

1试验菌株和药物

1.1试验菌株

本发明所用菌株为犬小孢子菌、石膏样小孢子菌、须癣毛癣菌、红色毛癣菌、絮状表皮癣菌、糠秕马拉色菌。所有菌株均由中国微生物菌种保藏管理委员会医学真菌中心提供。

1.2试验中药

丁香、冰片、全蝎、肉桂、陈皮、椰壳、昆布、姜黄等药物；

888注射液(规格2ml：主要成分为酮康唑和伊维菌素)，批号：20120405，购买于军事医学科学院军事兽医研究所。

1.3试验西药

耳特净(规格7.5g：其中含有克霉唑75mg)软膏，美国先灵葆雅动物保健用品有限公司；

尔康(规格20ml：其中含有酮康唑0.2g)滴耳液，批号：20120810，南京金盾动物药业有限责任公司；

皮特芬(规格100ml：其中含有盐酸特比萘酚1g)喷剂，批号：20120715，南京金盾动物药业有限责任公司；

顺峰康王(规格20g：其中含有酮康唑200mg)软膏，批号：20120516，广东顺峰药业有限公司；

伊曲康唑(规格1ml：其中含有伊曲康唑10mg)注射液，批号：20120711，德国茵芬乐宝药厂；

安特芬(其中含有盐酸特比萘酚0.125g)片剂，批号：20120516，南京金盾动物药业有限责任公司；

抗真菌一号(规格2ml：其中含有酮康唑)注射液，批号：20120405，军需大学新兽药研究中心；

霉菌净(规格15g：其中含有伊曲康唑300mg)擦剂，批号：20121127，天津保灵动物保健品有限公司；

派奥洁抗真菌香波(其中含有咪康唑硝酸盐)，法国Virbac公司；

Michlo抗真菌香波(其中含有3％葡萄糖酸洗必泰)，批号：MC091018，北京牧宁科技有限公司。

1.4仪器设备和其他耗材

ZL-1001型伍德氏灯，上海市吉米宠物用品有限公司；

奥林巴斯双目显微镜CX31，OlympusCorporation；

外科手术手套、手术刀片、灭菌纱布、酒精灯、一次性灭菌注射器等；

载玻片、盖玻片、Diff-quik染色液(纳博科林)、10％KOH甘油溶液等。

预备实施例1药物提取(水提取法)

将全蝎、昆布和姜黄分别进行粉碎，分别称取粗粉100g，置于不锈钢煎药器皿中，加入蒸馏水1000mL，浸泡6h后，放置在加石棉网的电炉上，加热煎煮1h，用绢布进行过滤，获取煎液，滤出的药渣再加上蒸馏水500mL，按前法浸泡、煎煮、滤过，合并两次滤液，加热浓缩至小体积，超滤膜过滤，采用真空干燥箱70℃减压干燥36h，获得试验用中药材水提粉末。各中药水提取物于室温干燥保存。

预备实施例2药物提取(醇提取法)

将全蝎、昆布和姜黄分别进行粉碎，分别称取粗粉100g，60％乙醇在60℃的水浴锅中回流提取3次，每次30min，提取液过滤后再浓缩至大约5ml。超滤膜过滤，采用真空干燥箱70℃减压干燥36h，获得试验用中药材醇提粉末。各中药醇提取物于室温干燥保存。

实施例1复方抗真菌制剂的制备

分别称取预备实施例1所得的全蝎、昆布和姜黄水提粉末0.008kg、0.06kg、0.30kg，分别溶于二甲亚砜中，浸泡12h，再加入甘油和95％乙醇浸泡12h，将上述各组分混合均匀加水至10L，搅拌，浸泡12h，使各组分有效成分充分溶解在水中，过滤，灌装至塑料罐中，每罐100ml，避光保存。

实施例2复方抗真菌制剂的制备

分别称取预备实施例2所得的全蝎、昆布和姜黄醇提粉末0.010kg、0.08kg、0.40kg，分别溶于二甲亚砜中，浸泡12h，再加入甘油和95％乙醇浸泡12h，将上述各组分混合均匀加水至10L，搅拌，浸泡12h，使各组分有效成分充分溶解在水中，过滤，灌装至塑料罐中，每罐100ml，避光保存。

实施例3复方抗真菌制剂的制备

分别称取预备实施例1所得的全蝎、昆布和姜黄水提粉末0.012kg、0.10kg、0.50kg，分别溶于二甲亚砜中，浸泡12h，再加入甘油和95％乙醇浸泡12h，将上述各组分混合均匀加水至10L，搅拌，浸泡12h，使各组分有效成分充分溶解在水中，过滤，灌装至塑料罐中，每罐100ml，避光保存。

实施例4复方抗真菌制剂的制备

分别称取预备实施例2所得的全蝎、昆布和姜黄醇提粉末0.010kg、0.10kg、0.40kg，分别溶于二甲亚砜中，浸泡12h，再加入甘油和95％乙醇浸泡12h，将上述各组分混合均匀加水至10L，搅拌，浸泡12h，使各组分有效成分充分溶解在水中，过滤，灌装至塑料罐中，每罐100ml，避光保存。

实验例1复方抗真菌制剂组分筛选试验

1.试验方法

1.1药物提取及试验浓度的设定

1.1.1药物提取(水提取法)

将丁香、冰片、全蝎、肉桂、陈皮、椰壳、昆布、姜黄药物先进行粉碎，分别称取粗粉100g，置于不锈钢煎药器皿中，加入蒸馏水1000mL，浸泡6h后，放置在加石棉网的电炉上，加热煎煮1h，用绢布进行过滤，获取煎液，滤出的药渣再加上蒸馏水500mL，按前法浸泡、煎煮、滤过，合并两次滤液，加热浓缩至小体积，超滤膜过滤，采用真空干燥箱70℃减压干燥36h，获得试验用中药材水提粉末。各中药水提取物于室温干燥保存。

1.1.2试验浓度的设定

根据表1、2、3所示中药组合将各中药水提粉末混合，用无菌蒸馏水溶解，稀释成10个质量浓度梯度，10倍于终浓度的试验浓度，最终质量浓度分别为5.0mg/mL、2.5mg/mL、1.25mg/mL、0.625mg/mL、0.3125mg/mL、0.156mg/mL、0.078mg/mL、0.039mg/mL、0.01953mg/mL、0.00977mg/mL。

1.1.3药基琼脂稀释法抑菌试验(MIC的测定)

(1)制备含药培养基：将己制备的不含任何抗生素的SDA培养基和含4％橄榄油的SDA培养基，每支试管2.7mL，在121℃，0.15MPa条件下灭菌15min。当灭菌培养基冷却至40℃～50℃时，以无菌条件下将水提取中药成分稀释液稀释0.3mL，按浓度由低到高依次加入培养基稀释10倍，混匀制成斜面。每管最终体积为3mL。

(2)菌悬液的制备：用接种钩挑取已转种活化的皮肤癣菌受试菌株培养基表面的菌块，置于组织研磨器中，加入无菌生理盐水研磨均匀，肉眼呈毛玻璃状外观，在震荡器上震荡15秒，用血细胞计数板计数，将菌悬液浓度调节为1～6×10⁶CFU/ml。

(3)接种菌悬液：将己制备的试验真菌的菌悬液用微量移液器取2μL分别接种于含水提药基的SDA培养基斜面。

(4)培养：将己接种犬小孢子菌、石膏样小孢子菌、须癣毛癣菌、红色毛癣菌、絮状表皮癣菌等的悬液的含药培养基置于26℃温箱孵育7天；将己接种糠秕马拉色菌菌悬液的含药培养基置于37℃温箱孵育3～4天。

(5)MIC值的判读：在培养结束后由2人在自然光线下通过肉眼判读。结果判定的前提为阴性对照管培养基清晰，阳性对照管菌落生长良好，将每管生长情况与对照管相比较，以最低药物浓度无培养物生长的药基管为MIC终点，该药物浓度即为该味药该提取成分对该种菌的MIC值。

(6)统计学处理：对所记录的MIC值计算中位数。

2.试验结果

通过中药单剂抑制真菌试验发现(表1)，全蝎的MIC值最低(0.94±0.34mg/mL)，且与其他组别比较，差异显著(P＜0.05)，因此选择其作为主药与其他药物复合进入下一步试验研究。

表1中药单剂抑菌效果观察

注：肩标不同大写字母表示差异显著(P＜0.05)；肩标相同大写字母表示差异不显著(P＞0.05)。

通过全蝎与其他药物两两复合发现(表2)，全蝎与丁香、全蝎与昆布和全蝎与姜黄等三组组合抑制真菌的效果好于其他组合(P＜0.05)，但这三组的抑菌强度还有待加强，因此将这四种中药实施三三组合进入下一步试验研究。

表2两组分抑菌效果观察

注：肩标不同大写字母表示差异显著(P＜0.05)；肩标相同大写字母表示差异不显著(P＞0.05)。

通过全蝎与其他两种药物复合发现(表3)，全蝎+昆布+姜黄的组合好于其他组合(P＜0.05)，因此确定全蝎、昆布、姜黄这三种中药作为复方制剂的组分，进入下一步复方制剂的剂量确定性试验。

表3三组分抑菌效果观察

注：肩标不同大写字母表示差异显著(P＜0.05)；肩标相同大写字母表示差异不显著(P＞0.05)。

实验例2复方抗真菌制剂的剂量确定试验

1.试验方法

根据前期预试验和文献资料，确定了三种组分的浓度水平，具体结果见表4。按表4中称取各组分，并将各组分先溶于二甲亚砜中，浸泡12h，再加入甘油和95％乙醇浸泡12h，将上述各组分混合均匀加水至10L，搅拌，浸泡12h，使各组分有效成分充分溶解在水中，过滤，灌装至塑料罐中，每罐100ml，避光保存。

表4因素水平表

2.试验结果

通过不同浓度水平药物组合抑菌试验发现(表5)，q2+j3+k2抑制真菌的效果最好，与其他浓度水平的组合比较，差异显著(P＜0.05)，最终选择q2+j3+k2(全蝎、姜黄和昆布的复方浸出液，三者的用量比为1:10:40)组成复方制剂，并命名为蝎姜昆复方抗真菌制剂。

表5不同浓度水平药物组合抑菌效果观察

注：肩标不同大写字母表示差异显著(P＜0.05)；肩标相同大写字母表示差异不显著(P＞0.05)。

实验例3最佳药物组合的筛选试验

1.试验方法

1.1治疗方法

对全身感染皮肤真菌病的犬，全身剃毛后进行治疗。其中，每组病例15例具体用药及治疗方法见表6。

表6不同病例的用药方案

1.2效果判定

将疗效分为痊愈、显效、好转、无明显效果等四个级别。根据皮肤病变区域状况、临床症状等进行综合评价，疗效判断时间在治疗完成4～6周后，临床疗效判断标准如下：

(1)以皮肤病变完全消退或仅留色素斑，被毛长出，无痒感，实验室检测为阴性，为治愈，判定为3分。

(2)以皮肤病变消退≥60％，皮损程度减轻，痒感明显减轻，为显效，判定为2分。

(3)以皮肤病变消退20％～60％，痒感减轻，为好转，判定为1分。

(4)以皮肤病变消退<20％或继续加重，痒感同治疗前或加剧，为无效，判定为0分。

有效病例是治愈病例与显效病例的总数，按公式计算出有效率。具体公式：有效率(％)＝(治愈病例数+显效病例数)/治疗病例总数×100％。

疗效评分为每个治疗亚组总分/治疗病例总数。

1.3数据分析

数据以均数±标准差表示。采用统计软件SPSS18.0对数据进行t检验，p<0.05视为差异显著。

2.试验结果

结果表明，蝎姜昆复方抗真菌制剂+伊曲康唑注射液复配，有效率达93.33％，显著高于蝎姜昆复方抗真菌制剂与888注射液或抗真菌一号注射液组合。

表7不同药物组合治疗犬皮肤真菌病(全身感染)的结果

实验例4临床病例效果观察

1.试验方法

1.1治疗方法

对实践期间确诊为皮肤真菌病的犬，根据身上不同部位病变个数及感染面积的大小将试验犬分为局部耳部感染组、局部小面积感染组和全身感染组，每个组又分为各治疗亚组，每组病例15例。局部小面积感染组病例限定为1～3处病变部位或病变面积小于5cm²，治疗前对局部剃毛。全身感染组病例限定为全身多处出现病变部位(大于5处或病变部位面积大于15cm²)，治疗前全身进行剃毛。具体用药及治疗方法见表8。

表8不同病例的用药方案

1.2临床效果的判定

将临床疗效分为痊愈、显效、好转、无明显效果等四个级别。根据皮肤病变区域状况、临床症状等进行综合评价，疗效判断时间在治疗完成4～6周后，临床疗效判断标准如下：

(1)以皮肤病变完全消退或仅留色素斑，被毛长出，无痒感，实验室检测为阴性，为治愈，判定为3分。

(2)以皮肤病变消退≥60％，皮损程度减轻，痒感明显减轻，为显效，判定为2分。

(3)以皮肤病变消退20％～60％，痒感减轻，为好转，判定为1分。

(4)以皮肤病变消退<20％或继续加重，痒感同治疗前或加剧，为无效，判定为0分。

有效病例是治愈病例与显效病例的总数，按公式计算出有效率。具体公式：有效率(％)＝(治愈病例数+显效病例数)/治疗病例总数×100％。

疗效评分为每个治疗亚组总分/治疗病例总数。

1.3数据分析

数据以均数±标准差表示。采用统计软件SPSS18.0对数据进行t检验，p<0.05视为差异显著。

2.试验结果

针对患病犬的具体病情制定相应治疗方案，在耳部感染组蝎姜昆复方抗真菌制剂治疗效果最佳，有效率达80％，与尔康、耳特净的治疗效果比较，差异显著(P＜0.05)。在小面积感染组蝎姜昆复方抗真菌制剂治疗效果最佳，有效率达86.67％，与本组其他药物的治疗效果比较，差异显著(P＜0.05)。霉菌净的治疗效果不佳(P＜0.05)。在全身感染组伊曲康唑+蝎姜昆复方抗真菌制剂治疗效果最佳，有效率达93.33％，与本组其他药物的治疗效果比较，差异显著(P＜0.05)。具体治疗结果见表9。

表9不同药物治疗犬皮肤真菌病的结果

注：组内同列数据肩标不同大写字母表示差异显著(P＜0.05)；肩标相同大写字母表示差异不显著(P＞0.05)。