将非神经元细胞重编程为神经元样细胞的方法和组合物

摘要

本发明公开了将非神经元细胞重编程为神经元样细胞的方法和组合物。该组合物包括神经元样特性化学诱导剂，所述神经元样特性化学诱导剂包括下述1)-6)中的任意组合：1)环腺苷单磷酸激动剂；2)促神经发生小分子；3)糖原合成激酶抑制剂；4)TGFβ受体抑制剂；5)BET家族溴结构域抑制剂；6)选择性Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶抑制剂和/或p38丝裂原活化激酶抑制剂；所述6)是选择性组分。本申请的使非神经元真核细胞获得神经元样特性的组合物在16天的诱导时间内能够产生超过90％的TUJ1阳性细胞。通过进一步的促成熟阶段，这些化学方法诱导的神经元样细胞有着神经元特异性的表达谱，能够产生动作电位并且形成功能性突触。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学领域中将非神经元细胞重编程为神经元样细胞的方法和组合物。

背景技术

在再生医学上，一个主要的问题是如何获得可定制的功能性细胞类型。近年来，直接 谱系重编程已经作为操纵细胞命运的新方法出现，这种方法很有前景，在操纵细胞命运上 快而且直接，并且能够绕开涉及多能干细胞操作所可能导致的致瘤性风险。通过病毒介 导的已知的细胞命运决定的转录因子或microRNA，成纤维细胞能够被直接转变为不同类别 的功能细胞类型(Davisetal.,1987；Vierbuchenetal.,2010；Xuetal.,2015；Yoo etal.,2011)。这种直接重编程方法已经被用在疾病模型上，预示在再生医学上潜在的 重要应用价值(Xuetal.,2015)。并且，在体内原位直接重编程细胞命运也预示着治疗 疾病的重要前景(Xuetal.,2015)。尽管如此，但是，低效率的诱导，技术操作上的繁 杂以及使用病毒载体操作带来的基因组整合的风险已经引发了对这些方法在未来实用性 的担忧。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何直接将非神经元真核细胞重编程为神经元样细胞(即 如何将非神经元真核细胞转变为神经元样细胞)。

为了解决以上技术问题，本发明提供了可以将部分分化或完全分化的非神经元真核细胞 重编程为(转变为)神经元样细胞的一组小分子，该组小分子为赋予非神经元真核细胞神经 元样特性的一组化合物或诱导非神经元真核细胞转变为神经元样细胞的一组化合物。将该组 小分子命名为神经元样特性化学诱导剂，简称为CINPs。CINPs的分子量低于2000道尔顿，如 低于1500道尔顿、低于1000道尔顿、低于或等于900道尔顿或低于或等于500道尔顿。

本发明提供了使非神经元真核细胞获得神经元样特性的组合物，所述组合物包括神经元 样特性化学诱导剂(CINPs)，所述神经元样特性化学诱导剂包括下述1)-6)中的任意组合：

1)环腺苷单磷酸(cAMP)激动剂；

2)促神经发生小分子(neurogenicsmallmolecules)；

3)糖原合成激酶(GSK)抑制剂(glycogensynthasekinase(GSK)inhibitors)；

4)TGFβ受体抑制剂(TGFβreceptorinhibitors)；

5)BET家族溴结构域抑制剂(BETfamilybromodomaininhibitors)；

6)选择性Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(selectiveinhibitorofRho-associated, coiled-coilcontainingproteinkinase，ROCK)抑制剂和/或p38丝裂原活化激酶抑制剂；

其中，所述6)是选择性组分。

上述使非神经元真核细胞获得神经元样特性的组合物中，所述6)在能促进非神经元真 核细胞向神经元样细胞转变的使用量下可选择加入。

上述使非神经元真核细胞获得神经元样特性的组合物可诱导非神经元真核细胞获得神经 元样特性，可用于制备将非神经元真核细胞重编程为神经元样细胞的培养基。

上述使非神经元真核细胞获得神经元样特性的组合物中，所述非神经元真核细胞为哺乳 动物非神经元真核细胞，所述组合物的活性成分可为下述C1、C2、C3、C4、C5或C6：

C1、由所述环腺苷单磷酸激动剂、所述促神经发生小分子、所述糖原合成激酶抑制剂、 和BET家族溴结构域抑制剂组成；

C2、由所述环腺苷单磷酸激动剂、所述促神经发生小分子、所述糖原合成激酶抑制剂、 所述TGFβ受体抑制剂和BET家族溴结构域抑制剂组成；

C3、由所述环腺苷单磷酸激动剂、所述促神经发生小分子、所述糖原合成激酶抑制剂、 和所述TGFβ受体抑制剂组成；

C4、由所述C1和所述6)组成；

C5、由所述C2和所述6)组成；

C6、由所述C3和所述6)组成。

上述使非神经元真核细胞获得神经元样特性的组合物中，所述环腺苷单磷酸激动剂(cAMP 激动剂)包括，但不限于前列腺素E2(prostaglandinE2，PGE2),咯利普兰(rolipram) (例如，使用浓度可为50μM),金雀异黄素(genistein)、双丁酰环腺苷单磷酸 (Dibutyryl-cAMP，DBc-AMP)(例如，使用浓度可为10μM)或8-溴-环腺苷单磷酸 (8-Bromo-cAMP)(例如，使用浓度可为200μM)和佛司可林(Forskolin，F)。佛司可林 的使用浓度可为5-500μM,如20-300μM、20-200μM、50-100μM、20μM,40μM,60μM, 80μM,100μM,120μM,140μM,160μM,180μM或200μM。

上述使非神经元真核细胞获得神经元样特性的组合物中，所述促神经发生小分子可为N- 环丙基-5-(2-噻吩基)-3-异恶唑甲酰胺 (N-Cyclopropyl-5-(2-thienyl)-3-isoxazolecarboxamide，ISX9，I)。ISX9的使用浓度 可为5-100μM,如10-40μM、10-20μM、5μM,10μM,15μM,20μM,25μM,30μM,35μM,40μM, 45μM或50μM。

上述使非神经元真核细胞获得神经元样特性的组合物中，所述糖原合成激酶抑制剂可为 下述四种物质中的至少一种：6-[2-[4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)嘧啶-2- 基氨基]乙基氨基]吡啶-3-甲腈 (6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5-methyl-1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl]amino]- 3-pyridinecarbonitrile，CHIR99021，C)；CHIR99021三盐酸盐(CHIR99021trihydrochloride)3-(2,4-二 氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮 (3-(2,4-Dichlorophenyl)-4-(1-methyl-1H-indol-3-yl)-1H-pyrrole-2,5-dione，SB216763)；GSK3I抑制 剂XV(GSK3IinhibitorXV)；GSK-3抑制剂IX[((2Z, 3E)-6’-bromo-3-(hydroxyimino)-[2,3’-biindolinylidene]-2’-one]；GSK3IX [6-Bromoindirubin-3'-oxime]；GSK-3βInhibitorXII [3-[[6-(3-Aminophenyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-yl]oxy]phenol]；GSK-3抑制剂XVI [6-(2-(4-(2,4-dichlorophenyl)-5-(4-methyl-1H-imidazol-2-yl)-pyrimidin-2-ylamino)ethyl-amino)-nic otinonitrile]；SB-415286[3-[(3-chloro-4-hydroxyphenyl)amino]-4-(2-nitrophenyl)-1 H-pyrrole-2,5-dione]；andBio[(2'Z,3'E)-6-bromoindirubin-3'-oxime]和(2’Z,3’E)-6-溴靛玉红-3’- 丙酮肟((2'Z,3'E)-6-Bromoindirubin-3'-acetoxime，Bio-acetoxime)。CHIR99021的使用浓度可为 2-100μM,如5-50μM、10-20μM、2-10μM、2μM、5μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、35μM、 40μM、45μM或50μM。Bio-acetoxime的使用浓度可为1μM。GSK3IXV的使用浓度可为0.4μM。 SB216763的使用浓度可为10μM。

上述使非神经元真核细胞获得神经元样特性的组合物中，所述TGFβ受体抑制剂包括但不限于 (4-[4-(1,3-苯并二唑-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]-苯酰胺水合物) (4-[4-(1,3-benzodioxol-5-yl)-5-(2-pyridinyl)-1H-imidazol-2-yl]benzamide，SB431542，S)；E-616452 [2-(3-(6-Methylpyridin-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl)-1,5-naphthyridine]；A83-01 [3-(6-Methyl-2-pyridinyl)-N-phenyl-4-(4-quinolinyl)-1H-pyrazole-1-carbothioamide]；SB505124 [2-[4-(1,3-Benzodioxol-5-yl)-2-(1,1-dimethylethyl)-1H-imidazol-5-yl]-6-methyl-pyridine]；GW 788388 [4-[4-[3-(2-Pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]-2-pyridinyl]-N-(tetrahydro-2H-pyran-4-yl)-benzamide]；SB 525334[6-[2-(1,1-Dimethylethyl)-5-(6-methyl-2-pyridinyl)-1H-imidazol-4-yl]quinoxaline],和 dorsomorphine。SB431542的使用浓度可为1-50μM,如2-40μM或2-10μM或10μM。

上述使非神经元真核细胞获得神经元样特性的组合物中，所述BET家族溴结构域抑制剂为下述物质中的至少 一种：7-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-8-甲氧基-1-((R)-1-(吡啶-2-基)乙基)-1H-咪唑并[4,5-C]喹啉-2(3H)-酮 (7-(3,5-dimethylisoxazol-4-yl)-8-methoxy-1-((R)-1-(pyridin-2-yl)ethyl)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin -2(3H)-one，I-BET151，B)；I-BET151的氢氯化物(I-BET151hydrochloride)；((6S)-(4-(4-氯苯基)-2,3,9- 三甲基-6H-噻吩并[3,2-f][1,2,4]三唑并[4,3-a][1,4]二氮杂卓-6-基)乙酸叔丁酯) ((6S)-4-(4-Chlorophenyl)-2,3,9-trimethyl-6H-thieno[3,2-f][1,2,4]triazolo[4,3-a][1,4]diazepine-6 -aceticacid1,1-dimethylethylester，JQ1)；PFI1 [2-methoxy-N-(3-methyl-2-oxo-1,2,3,4-tetrahydroquinazolin-6-yl)benzenesulfonamide]；Bromosporine 和1-[7-(3,4-二甲氧基苯基)-9-[[(3S)-1-甲基哌啶-3-基]甲氧基]-2,3,4,5-四氢-1,4-苯并氧氮杂卓-4-基]丙 烷-1-酮 (1-[7-(3,4-Dimethoxyphenyl)-9-[[(3S)-1-methylpiperidin-3-yl]methoxy]-2,3,4,5-tetrahydro-1,4-ben zoxazepin-4-yl]propan-1-one，I-CBP112)；

和/或，所述6)为下述四种物质中的至少一种：(+)-(R)-反式-4-(1-氨基乙基)-N-(4- 吡啶基)环己烷甲酰胺二盐酸盐 ((+)-(R)-trans-4-(1-aminoethyl)-N-(4-pyridyl)cyclohexanecarboxamide dihydrochloride，Y27632)，法舒地尔，达马莫德(BIRB796)和(4-(4’-氟苯基)-2-(4’- 甲基亚磺酰基苯基)-5-(4’-吡啶基)-咪唑)(SB203580)。I-BET151的使用浓度可为2-100μM, 如5-50μM、5-20μM、2-10μM、2μM、5μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、35μM、40μM、 45μM或50μM。PFI1的使用浓度可为5μM,JQ1的使用浓度可为1μM,Bromosporine的使用浓度可 为1μM,I-CBP112的使用浓度可为10μM。

上述使非神经元真核细胞获得神经元样特性的组合物中，所述组合物可为C1、C2、C3或 C4；

所述C1由所述F、所述I、所述C和所述B组成；所述C1中，所述F、所述I、所述C 和所述B的摩尔比可为(50-100):(10-20)：(10-20)：(0.5-10)或100：(10-20)：(10-20)： (0.5-2)或100：20：20：(0.5-2)或100：20：20：2；

所述C2由所述F、所述I、所述C、所述S和所述B组成；所述C2中，所述F、所述I、 所述C、所述S和所述B的摩尔比可为(50-100):(10-20)：(10-20)：(2-10)：(0.5-10) 或100：(10-20)：(10-20)：(2-10)：(0.5-2)或100：20：20：(2-10)：(0.5-2)或100： 20：20：10：2；

所述C3由所述F、所述I、所述C和所述S组成；所述C3中，所述F、所述I、所述C 和所述S的摩尔比可为(50-100):(10-20)：(10-20)：(2-10)或100：(10-20)：(10-20)： (2-10)或100：20：20：(2-10)或100：20：20：10；

所述C4由所述C1和所述6)组成组成，所述6)为下述四种物质中的一种：所述Y27632、 法舒地尔、达马莫德和所述SB203580；所述C4中，所述C1以F计和所述6)的摩尔比可为 (50-100):2或100：2。

上述使非神经元真核细胞获得神经元样特性的组合物中，所述神经元样特性可为下述P1、 P2和P3中的至少一种：

P1、具有神经元形态；

P2、表达神经元标记蛋白，所述神经元标记蛋白为如下六种蛋白中的至少一种：TUJ1(神 经特异III类β-微管蛋白)，MAP2(微管相关蛋白2)，NF-H(神经丝H、重链神经丝蛋白)， NeuN(神经元核蛋白)，vGlut(囊泡谷氨酸转运体)和Gad67(谷氨酸脱羧酶67)；

P3、由膜片钳检测到膜去极化。

上述使非神经元真核细胞获得神经元样特性的组合物中，所述非神经元真核细胞可为下 述任一种细胞：成纤维细胞，多能干细胞，血液来源细胞，胚胎来源细胞，皮肤来源细胞， 脂肪组织来源细胞，脂肪细胞，上皮细胞，内皮细胞，间充质细胞，实质细胞，小肠上皮细 胞和结缔组织细胞。

含有上述使非神经元真核细胞获得神经元样特性的组合物的产品也属于本发明的保护范 围，所述产品使非神经元真核细胞获得神经元样特性；所述神经元样特性为下述P1、P2和 P3中的至少一种：

P1、具有神经元形态；

P2、表达神经元标记蛋白，所述神经元标记蛋白为如下六种蛋白中的至少一种：TUJ1(神 经特异III类β-微管蛋白)，MAP2(微管相关蛋白2)，NF-H(神经丝H、重链神经丝蛋白)， NeuN(神经元核蛋白)，vGlut(囊泡谷氨酸转运体)和Gad67(谷氨酸脱羧酶67)；

P3、由膜片钳检测到膜去极化。

含有上述使非神经元真核细胞获得神经元样特性的组合物的产品具体可为R1或R2；

R1、含有所述组合物的成套真核细胞培养基；

R2、含有所述组合物的试剂盒。

上述试剂盒还可以包括用于添加所述组合物的真核细胞培养基。

上述组合物或上述产品在将非神经元真核细胞重编程(转变)为神经元样细胞中的应用 也属于本发明的保护范围，所述神经元样细胞为具有神经元样特性的细胞，所述神经元样特 性为下述P1、P2和P3中的至少一种：

P1、具有神经元形态；

P2、表达神经元标记蛋白，所述神经元标记蛋白为如下六种蛋白中的至少一种：TUJ1， MAP2，NF-H，NeuN，vGlut和Gad67；

P3、由膜片钳检测到膜去极化。

本发明还提供了将非神经元真核细胞重编程(转变)为神经元样细胞的方法。

本发明所提供的将非神经元真核细胞重编程(转变)为神经元样细胞的方法，包括将离 体的非神经元真核细胞(待重编程细胞或起始细胞)在含有所述组合物的神经元诱导培养基 中培养使所述非神经元真核细胞转变为神经元样细胞；所述神经元样细胞为具有神经元样特 性的细胞，所述神经元样特性为下述P1、P2和P3中的至少一种：

P1、具有神经元形态；

P2、表达神经元标记蛋白，所述神经元标记蛋白为如下六种蛋白中的至少一种：TUJ1， MAP2，NF-H，NeuN，vGlut和Gad67；

P3、由膜片钳检测到膜去极化。

上述应用或方法中，所述非神经元真核细胞可为下述任一种细胞：成纤维细胞，多能干 细胞，血液来源细胞，胚胎来源细胞，皮肤来源细胞，脂肪组织来源细胞，脂肪细胞，上皮 细胞，内皮细胞，间充质细胞，实质细胞，小肠上皮细胞和结缔组织细胞。

上述应用或方法中，所述非神经元真核细胞可为没有被转染编码具有促神经发生功能蛋 白质的核酸和/或没有转染小分子RNA；所述具有促神经发生功能蛋白质为下述至少一种： Scl1，Zic1，Olig2，Brn2/4，NeuroD1和Myt1l；所述小分子RNA为miR-9/9和/或miR-124；

和/或，

所述非神经元真核细胞可为部分分化或完全分化的细胞。

上述应用或方法中，所述神经元样细胞不重组性表达神经发生相关的核酸或神经元转录 因子。

上述应用或方法中，所述神经元样细胞不重组性表达编码具有促神经发生功能蛋白质的 核酸和/或小分子RNA；所述具有促神经发生功能蛋白质为下述至少一种：Scl1，Zic1，Olig2， Brn2/4，NeuroD1，Myt1l(Vierbuchen,etal.,Nature,463:1035-1041(2010))，所述小 分子RNA为miR-9/9和/或miR-124(Yoo,etal.,Nature,476(7359):228-31(2011)and Ambasudhan,etal.,CellStemCell,9(2):113-118(2001)。

上述应用或方法中，所述非神经元真核细胞为成纤维细胞，所述神经元样细胞与来自同 一物种的成纤维细胞(待重编程细胞或起始细胞)相比，下述至少一种基因的表达下调：Fap (成纤维细胞激活蛋白alpha),Des(desmin),Slug(锌指蛋白SNAI2),Dcn(decorin),FSp1 (成纤维细胞特异蛋白1),Collagen1和Twist2(twist相关蛋白2,或者A类基础螺旋环 螺旋蛋白39)。这些基因可被下调2、3、4或5倍，或被完全沉默。

上述方法中，待重编程细胞可在适合该待重编程细胞生长的培养基中培养1天或两天， 然后将待重编程细胞在含有所述组合物的神经元诱导培养基中培养14-24天，如14,15,16, 17,18,19,20,21,22,23,或24天。在所述待重编程细胞是成纤维细胞的情况下，成 纤维细胞需要在含有所述组合物的神经元诱导培养基中培养19-21天。本领域技术人员可以 根据待重编程细胞的类型和上述神经元样特性的出现确定适合不同类型的待重编程细胞在含 有所述组合物的神经元诱导培养基的培养时间。上述方法还包括在所述神经元诱导培养基培 养后，将细胞用促成熟培养基培养至少10天，如培养10,11,12,13,14,15,16,17,18, 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29或30天，获得所述神经元样细胞。本领域 技术人员可以根据待重编程细胞的类型和上述神经元样特性的出现确定适合不同类型的待重 编程细胞在促成熟培养基中培养的时间。在所述待重编程细胞是成纤维细胞的情况下，需要 在促成熟培养基中培养14-21天。在促成熟培养基中培养时要和来自同一物种的原代的神经 元细胞或来自同一物种的原代的星型胶质细胞共培养。

上述方法中，神经元诱导培养基含有Neurobasal基础培养基，N2和B27添加成分， GlutaMAX和bFGF；在所述待重编程细胞是成纤维细胞的情况下，含有所述组合物的神经元诱 导培养基可用现有的神经元诱导培养基配制，所述神经元诱导培养基是向Neurobasal培养基 中添加N2、B27、GlutaMAX和bFGF得到的培养基，N2在神经元诱导培养基中的质量含量可 为1％，B27在神经元诱导培养基中的质量含量可为2％，GlutaMAX在神经元诱导培养基中的质 量含量可为1％，bFGF在神经元诱导培养基中的含量可为100-250ng/ml。含有所述组合物的 神经元诱导培养基是向所述神经元诱导培养基中添加所述组合物得到的培养基。本领域技术 人员可以根据待重编程细胞的类型和上述神经元样特性的出现确定适合不同类型的待重编程 细胞的所述组合物中的CINPs的组成及其使用浓度。如Forskolin的使用浓度可为5-500μM， 如20-300μM、20-200μM、50-100μM、20μM、40μM、60μM、80μM、100μM、120μM、140μM、 160μM、180μM或200μM。ISX9的使用浓度可为5-100μM,如10-40μM、10-20μM、5μM、 10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、35μM、40μM、45μM或50μM。CHIR99021的使用浓度可为 2-100μM,如5-50μM、10-20μM、2-10μM、2μM、5μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、35μM、 40μM、45μM或50μM。Bio-acetoxime的使用浓度可为1μM。SB431542的使用浓度可为1-50μM, 如2-40μM或2-10μM或10μM。I-BET151的使用浓度可为2-100μM,如5-50μM、5-20μM、2-10μM、 0.5-2μM、0.5μM、2μM、5μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、35μM、40μM、45μM或50μM。 在所述待重编程细胞是成纤维细胞的情况下，上述方法中，含有所述组合物的神经元诱导培 养基中含有的所述组合物为所述C1、C2、C3或C4，含有所述组合物的神经元诱导培养基中 所述C1的含量以所述F计为5-500μM、20-300μM、20-200μM、50-100μM、20μM、 40μM、60μM、80μM、100μM、120μM、140μM、160μM、180μM或200μM；含有所述组合物的神 经元诱导培养基中所述C2的含量以所述F计为5-500μM，如20-300μM、20-200μM、50 -100μM、20μM、40μM、60μM、80μM、100μM、120μM、140μM、160μM、180μM或200μM；含 有所述组合物的神经元诱导培养基中所述C3的含量以所述F计为5-500μM，如20-300μM、 20-200μM、50-100μM、20μM、40μM、60μM、80μM、100μM、120μM、140μM、160μM、180μM 或200μM；含有所述组合物的神经元诱导培养基中所述C4的含量以所述F计为 50-100μM5-500μM，如20-300μM、20-200μM、50-100μM、20μM、40μM、60μM、80μM、 100μM、120μM、140μM、160μM、180μM或200μM。

上述方法中，所述促成熟培养基具体可为向所述神经元诱导培养基加bFGF、Forskolin， BDNF(Brain-derivedneurotrophicfactor)和GDNF(Glialcellline-derived neurotrophicfactor)得到的培养基，bFGF在所述促成熟培养基中的含量为50ng/ml， Forskolin在所述促成熟培养基中的含量为10μM，BDNF在所述促成熟培养基中的含量为 20ng/ml，GDNF在所述促成熟培养基中的含量为20ng/ml。

上述方法中，所述方法包括从培养的细胞中分离得到所述神经元样细胞。

所述分离是指从培养的细胞中纯化出至少30％,35％,40％,45％,50％,55％,60％,65％,70％, 75％,80％,85％,90％,95％或99％的神经元样细胞。

CiNs可以被纯化出来，例如通过从培养的细胞中进行萃取(通过密度梯度离心和/或流 式细胞分选)。纯度可以通过任意适当的方法进行检测。如通过流式细胞分选(如FACS分析)， CiNs的纯度可以达到99％-100％。CiNs可以被分离出来，比如使用分子(如抗体、抗体衍生 物、配体或Fc-肽融合分子)结合到CiNs的marker(如TUJ1、MAP2、NF-H和NeuN或这些 marker的组合)上的方法，从而选出可以结合到分子上的细胞(阳性选择)。比如在文献 Guez-Barber,J.Neurosci.Methods.,203(1):10-18(2012))中就描述了使用NeuN抗体 通过FACS的方法分离神经元的方法。

由上述方法获得的所述神经元样细胞也属于本发明的保护范围。

所述神经元样细胞可用于治疗和/或改善神经退行性或神经系统疾病或神经元损伤是指 减少/降低神经退行性或神经系统疾病或神经元损伤的相关症状。

作为优先实施例，CiNs细胞是由自身来源的细胞诱导而成，即细胞是来源于患者自身。 然而，CiNs也可由异体来源的细胞诱导。在一种情况下，细胞来自于与受体遗传相关的供体， 另外一种情况下，细胞来源于与受体遗传不相关的供体。如果人CiNs细胞是异体来源(非自 体来源/同种异体来源)的细胞诱导而成，通常需要同时进行免疫抑制治疗，如施用免疫抑制 剂环胞多肽或FK506。CiNs细胞可以应用同时不局限于各种神经退行性变，如阿尔兹海默症 (AD)，亨廷顿症(HD)，帕金森氏症(PD)，肌肉萎缩性侧索硬化症(ALS)，多发性硬化(MS) 和脑性瘫痪(CP)，齿状核红核苍白球路易氏体萎缩症(DRPLA)，神经元核内透明包涵体病 (NIHID)，路易体痴呆，唐氏综合症，哈勒沃登-施帕茨病，朊粒病，嗜银颗粒性痴呆，皮质 基底节变性，拳击员痴呆，弥漫性神经原纤维缠结，格斯特曼一施特劳斯纳病，克雅氏病，3 型尼曼-匹克病，进行性核上麻痹，亚急性硬化性全脑炎，脊髓小脑共济失调，皮克氏病。同 时还有包括并不局限于外伤性脑损伤，中风，化学诱导脑损伤等脑损伤。脑损伤可源于不同 类型的外界损伤，如运动，事故及战争。包括脑震荡，脑缺血(中风)，脑出血，挫伤等脑损 伤可造成个体神经元的损伤或更严重的大量神经组织的丢失。此外CiNs还可应用于包括由病 原体感染造成的脑损伤或由于药物，环境因素或药物滥用造成的化学诱导的脑损伤。

包括所述神经元样细胞的治疗组合物也属于本发明的保护范围。

所述治疗组合物中所述神经元样细胞可通过药学上可接受的载体导入机体、组织或细胞。 如所述神经元样细胞可悬浮在生理缓冲液中，也可连接于支持介质上。支持介质可以由可生 物降解的材料或不可生物降解的材料制成。支持介质可以是天然的聚合物或人工合成的聚合 物。可选用如下天然聚合物：胶原蛋白，透明质酸，多糖，盐和糖。人工合成的聚合物包括 聚乳酸，聚乙醇酸，聚羟基脂肪酸酯及其共聚物，如聚羟基丁酸酯，聚正酯，聚酸酐，聚氨 酯，聚碳酸酯，聚酯。这些支持介质可以植入物，管，网格，或水凝胶的形式存在。支持介 质可以是一个松散的织造或非织造网格，所述神经元样细胞接种到网格中。

所述治疗组合物包括有效量的所述神经元样细胞。一个剂量的所述神经元样细胞可为 10³-10⁷个细胞，如10⁴-10⁵个细胞、10⁴-10⁷个细胞,10⁵-10⁸个细胞,10⁶-10⁹个细胞或10⁶-10⁸个细胞。所述治疗组合物中，所述神经元样细胞可以单位剂量的形式包装。

本申请中，所述具有神经元形态可为具有神经元的形态特征，如神经丝，胞体，树突， 轴突和/或突触。

本申请中所述非神经元真核细胞具体可为哺乳动物非神经元真核细胞，如可从牛，羊， 猪，狗，猫，马，灵长类动物和人中获得。所述非神经元真核细胞可来自骨髓，成纤维细胞， 胎儿组织(例如，胎儿肝组织)，外周血，脐带血，胰腺，皮肤或其他器官或组织。

实验证明，本申请的使非神经元真核细胞获得神经元样特性的组合物在16天的诱导时间 内能够产生超过90％的TUJ1阳性细胞。通过进一步的促成熟阶段，这些化学方法诱导的神经 元样细胞(CiNs)有着神经元特异性的表达谱，能够产生动作电位并且形成功能性突触。本 申请证明可以在没有涉及遗传操作的情况下，实现仅化学方法诱导的跨胚层的体细胞直接重 编程，这种重编程是通过使用化学小分子打破起始细胞的基因网络，并使用化学小分子诱导 目的细胞决定性基因实现的。因为小分子本身是非免疫原性的，成本更低，更加容易操作和 标准化。并且，在细胞水平进行的小分子操作是可逆的，细胞对于小分子本身是可渗透的。因 为这些优势的存在，小分子诱导的策略有潜力被最终转化到治疗应用。

附图说明

图1为神经元命运诱导小分子的发现。

A、筛选小分子的示意图。

B和C、4个小分子被发现可以有效促进Ascl1诱导的成纤维细胞向神经元转变的过程。 B，TUJ1阳性细胞的定量，这些细胞都是圆形胞体，神经突起长度至少为胞体的3倍以上。 通过10个随机视野(20X)来统计细胞数量，图中反映的是TUJ1阳性细胞相对DAPI标记细 胞的比例。C，A或A+FICS处理诱导的代表性的TUJ1阳性细胞。

其中，A，Ascl1，即在神经元诱导培养基中培养转染有表达Ascl1的病毒载体的MEFs处 理；control，未诱导(NI)，即在成纤维细胞培养基中培养未转染表达Ascl1的病毒载体的 MEFs处理；A+F在加入Forskolin(简称F)的诱导培养基(在神经元诱导培养基中加入 Forskolin使Forskolin的含量为100μM得到的培养基)中培养转染有表达Ascl1的病毒载 体的MEFs处理；A+I在加入ISX9(简称I)的诱导培养基(在神经元诱导培养基中加入ISX9 使ISX9的含量为20μM得到的培养基)中培养转染有表达Ascl1的病毒载体的MEFs处理；A+C 在加入CHIR99021(简称C)的诱导培养基(在神经元诱导培养基中加入CHIR99021使CHIR99021 的含量为20μM得到的培养基)中培养转染有表达Ascl1的病毒载体的MEFs处理；A+S在加 入SB431542的诱导培养基(在神经元诱导培养基中加入SB431542(简称S)使SB431542的 含量为10μM得到的培养基)中培养转染有表达Ascl1的病毒载体的MEFs处理；A+FICS在 加入F、I、C和S的诱导培养基(在神经元诱导培养基中加入Forskolin、ISX9、CHIR99021 和SB431542使Forskolin的含量为100μM、ISX9的含量为20μM、CHIR99021的含量为20μM 和SB431542的含量为10μM得到的培养基)中培养转染有表达Ascl1的病毒载体的MEFs处理。

D、小分子诱导过程示意图。FM，成纤维细胞培养基；IM，神经元诱导培养基。IM+SMs (F+I+C+S)处理是在IM+SMs培养基(向神经元诱导培养基中加入Forskolin、ISX9、CHIR99021 和SB431542使Forskolin的含量为100μM、ISX9的含量为20μM、CHIR99021的含量为20μM 和SB431542的含量为10μM得到的培养基)中培养未转染表达Ascl1的病毒载体的MEFs处理。

E、IM+SMs(F+I+C+S)处理的代表性TUJ1阳性细胞。

F、小分子诱导的TUJ1阳性细胞的定量图(相对DAPI标记细胞，随机选10个20X的视 野来进行统计)。FICS是上述IM+SMs(F+I+C+S)处理，F是在上述加入Forskolin(简称 F)的诱导培养基中培养未转染表达Ascl1的病毒载体的MEFs的处理；I是在上述加入ISX9 (简称I)的诱导培养基中培养未转染表达Ascl1的病毒载体的MEFs的处理；C是在上述加 入CHIR99021(简称C)的诱导培养基中培养未转染表达Ascl1的病毒载体的MEFs的处理；S 是在上述加入SB431542的诱导培养基中培养未转染表达Ascl1的病毒载体的MEFs的处理； DMSO，空白对照。

所有数据的呈现形式为均值加减标准差。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001(学生t检验)。 标尺为100μm。

图2为诱导化合物的剂量依赖效应。

A、FICB诱导细胞的代表性神经突起形态。标尺：100μm。

B、4个小分子以一个剂量依赖效应诱导神经元的产生。神经元诱导效率(基于TUJ1阳 性细胞量)通过每个条件的随机视野来确定。NI为未诱导，即在成纤维细胞培养基中培养未 转染表达Ascl1的病毒载体的MEFs处理；DMSO，空白对照；CHIR99021(μM)中的0、2、5、 10、20、50分别表示在向FIB培养基(向神经元诱导培养基中加入Forskolin、ISX9和 I-BET151，使Forskolin的含量为100μM、ISX9的含量为20μM和I-BET151的含量为2μM得 到的培养基)中加入CHIR99021使CHIR99021的含量分别为0、2、5、10、20和50μM得到的 培养基中培养未转染表达Ascl1的病毒载体的MEFs处理；ISX9(μM)中的0、5、10、20、 40和100分别表示在向FCB培养基(向神经元诱导培养基中加入Forskolin、CHIR99021和 I-BET151，使Forskolin的含量为100μM、CHIR99021的含量为20μM和I-BET151的含量为2μM 得到的培养基)中加入ISX9使ISX9的含量分别为0、5、10、20、40和100μM得到的培养基 中培养未转染表达Ascl1的病毒载体的MEFs处理；Forskolin(μM)中的0、20、50、100、 200、300分别表示在向ICB培养基(向神经元诱导培养基中ISX9、CHIR99021和I-BET151， 使ISX9的含量为20μM、CHIR99021的含量为20μM和I-BET151的含量为2μM得到的培养基) 中加入Forskolin使Forskolin的含量分别为0、20、50、100、200、300μM得到的培养基中 培养未转染表达Ascl1的病毒载体的MEFs处理；I-BET151(μM)中的0、2、5、10、20、50 分别表示在向FIC培养基(向神经元诱导培养基中加入Forskolin、ISX9和CHIR99021，使 Forskolin的含量为100μM、ISX9的含量为20μM和CHIR99021的含量为20μM得到的培养基) 中加入I-BET151使I-BET151的含量分别为0、2、5、10、20和50μM得到的培养基中培养未 转染表达Ascl1的病毒载体的MEFs处理。

图3为高效获得化学诱导的神经元(CiNs)。

A、发现促进重编程小分子的示意图

B、定量统计FICSB诱导的或从FICSB中减掉每个小分子后诱导的TUJ1阳性细胞、 NEUN/TUJ1双阳性细胞和TAUEGFP/TUJ1双阳性细胞。

NI为未诱导，即在成纤维细胞培养基中培养未转染表达Ascl1的病毒载体的MEFs处理； DMSO，空白对照；FICSB是在FICSB培养基(向神经元诱导培养基中加入Forskolin、ISX9、 CHIR99021、SB431542和I-BET151，使Forskolin的含量为100μM、ISX9的含量为20μM、CHIR99021 的含量为20μM、SB431542的含量为10μM和I-BET151的含量为2μM得到的培养基)中培养未转染 表达Ascl1的病毒载体的MEFs处理；-F是在去除上述FICSB培养基中的Forskolin得到的培养基 中培养未转染表达Ascl1的病毒载体的MEFs处理；-I是在去除上述FICSB培养基中的ISX9得到 的培养基中培养未转染表达Ascl1的病毒载体的MEFs处理；-C是在去除上述FICSB培养基中的 CHIR99021得到的培养基中培养未转染表达Ascl1的病毒载体的MEFs处理；-S是在去除上述 FICSB培养基中的SB431542得到的培养基(简称FICB培养基，FICB培养基是向神经元诱导培养 基中加入Forskolin、ISX9、CHIR99021和I-BET151，使Forskolin的含量为100μM、ISX9的含 量为20μM、CHIR99021的含量为20μM和I-BET151的含量为2μM得到的培养基)中培养未转染表 达Ascl1的病毒载体的MEFs处理；-B是在去除上述FICSB培养基中的I-BET151得到的培养基中 培养未转染表达Ascl1的病毒载体的MEFs处理；FICB是在上述FICB培养基中培养未转染表达 Ascl1的病毒载体的MEFs处理；

C、FICS或FICS+I-BET151诱导14天后的TUJ1染色细胞。FICS为上述-B处理；FICSB 为上述FICSB处理。

D、代表性的TUJ1、MAP2、NF-H、GABA和vGLUT1阳性诱导细胞。右下图为左下图中圈出 部分的放大(2倍)。图中的细胞是在上述FICB培养基中培养未转染表达Ascl1的病毒载体 的MEFs。

E、和小鼠原代神经元共培养两周后的成熟的TAUEGFP阳性CiNs表达TUJ1和NEUN。

F、诱导CiNs的示意图。FM，成纤维细胞培养基；诱导培养基为上述FICB培养基。

G、CiNs单细胞分析。FBs，成纤维细胞；PNs，原代神经元。

标尺：100μm(C和D上、中、左下图)，50μm(E)，20μm(D右下图)。

图4为诱导化合物的生物活性。

A、单细胞分析鉴定CiNs的神经元亚型。

B、和原代星形胶质细胞共培养后的CiNs可记录到自发的EPSCs。

C、和他们各自的功能替代物相比，FSK、CHIR和I-BET151对于诱导TUJ1阳性细胞的效 果。Control，未诱导；DMSO，空白对照。I-CBP112、Bromosporine、JQ1、PFI1分别表示 将上述FICB培养基中的I-BET151替换为10μMI-CBP112、1μMBromosporine、1μMJQ1或5μM PFI-1得到的培养基，Rolipram、DBcAMP、8-Br-cAMP分别表示将上述FICB培养基中的 Forskolin替换为50μMRolipram、10μMDBcAMP或200μM8-Br-cAMP得到的培养基， BIO-acetoxime、GSK3iXV、SB216763分别表示将上述FICB培养基中的CHIR99021替换为1μM BIO-acetoxime、0.4μMGSK3iXV或10μMSB216763得到的培养基。所有数据的呈现形式为 均值加减标准误。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001(学生t检验)。

图5.CiNs的电生理功能性质

A、用上述FICB培养基化学诱导14-20天后进行了膜片钳检测。标尺：50μm。

B、CiNs的全细胞电流钳检测，通过注射电流动作电位被激发。图中突出了一个典型的 动作电位。

C、CiNs的全细胞电压钳检测，可记录到内向和外向电流。

D和E、在和原代神经元共培养后，CiNs的功能性膜属性被显著增强了。图中突出了一 个典型的动作电位。

F、和原代神经元共培养后的CiNs可记录到自发的EPSC，并且能被20μMCNQX和50μM AP5阻断。

图6为直接重编程过程中诱导细胞来源的谱系追踪。

A、基因谱系追踪体系的实验原理。

B、通过共染COL1A1确认tdTomato阳性小鼠胚胎成纤维细胞的属性(如箭头所指)。

C、通过FACS纯化tdTomato阳性的小鼠胚胎成纤维细胞。

D、在用上述FICB培养基化学诱导20天后，tdTomato阳性细胞产生了大量的细胞突起。

E、对于用上述FICB培养基诱导的TUJ1阳性细胞分别来源于tdTomato阳性(tdTomato+) 细胞和阴性(tdTomato-)细胞的比例定量。tdTomato阳性细胞代表起始细胞是成纤维细胞， tdTomato阴性细胞代表起始细胞是非成纤维细胞。

F-Q、用上述FICB培养基诱导得到的TAUEGFP/tdTomato双阳性细胞共表达TUJ1(F-I)， MAP2(J-M)和NF-H(N-Q)。

所有数据的呈现形式为均值加减标准误。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001(学生t检验)。 标尺为100μm。

图7.避开中间增殖阶段的直接化学重编程.

A、BrdU分析。BrdU实验原理图。

B、重编程后的TUJ1阳性细胞没有被标记上BrdU。

C、重编程后的CiNs被标记上BrdU的比例定量。每个重复选5个随机视野(20X)，每 个条件用两个重复来确定细胞数量。wBrdU+表示诱导过程中被嵌入了Brdu，证明重编程过 程经历了细胞增殖阶段，w/oBrdU+表示诱导过程中未被嵌入了Brdu，证明重编程过程未经 历中间细胞增殖阶段。所有数据的呈现形式为均值加减标准误。标尺为100μm。

D、ISX9的结构式。

E、Forskolin的结构式。

F、SB431542的结构式。

G、CHIR99021的结构式。

H、I-BET151hydrochloride的结构式。

图8.CiNs诱导过程中的整体基因表达谱。

A和B、成纤维细胞、小分子诱导的成纤维细胞和原代神经元之间的层次聚类(A)和重 叠表达程度(B)。

C、散点图显示化学诱导后，多个神经元特异基因被上调，而成纤维细胞基因被抑制。

D、差异表达基因的热图显示小分子诱导了很多神经元特异基因和亚型特异基因的表达， 而沉默了很多成纤维细胞关键的基因。

E、化学诱导后主要富集基因的GO分析。

图9.化学重编程的路径

A、热图显示FICB诱导19天后的细胞中神经元富集基因以及成纤维细胞富集基因的整体 性变化。

B和C、实时定量PCR证实了主宰神经元基因的激活(B)以及成纤维细胞基因的抑制(C)。

D、ISX9对于激活一些神经元基因是必需的。NI表示未诱导，即在成纤维细胞培养基中 培养的来源于杂合TauEGFP基因敲入小鼠的MEFs8天的处理；ISX9表示在神经元诱导培养 基培养来源于杂合TauEGFP基因敲入小鼠的MEFs8天的处理；FICB表示在上述FICB培养基 中培养来源于杂合TauEGFP基因敲入小鼠的MEFs8天的处理。

E和F、48小时时，每个化学小分子对于Ngn2的激活和成纤维细胞基因的抑制的作用。 NI表示未诱导，即在成纤维细胞培养基中培养来源于杂合TauEGFP基因敲入小鼠的MEFs48 小时的处理；FICB表示在上述FICB培养基中培养来源于杂合TauEGFP基因敲入小鼠的MEFs48 小时的处理；

-F是在去除上述FICB培养基中的Forskolin得到的培养基中培养来源于杂合TauEGFP 基因敲入小鼠的MEFs48小时的处理；-I是在去除上述FICB培养基中的ISX9得到的培养基 中培养来源于杂合TauEGFP基因敲入小鼠的MEFs48小时的处理；-C是在去除上述FICB培 养基中的CHIR99021得到的培养基中培养来源于杂合TauEGFP基因敲入小鼠的MEFs48小时 的处理；-B是在去除上述FICB培养基中的I-BET151得到的培养基中培养来源于杂合TauEGFP 基因敲入小鼠的MEFs48小时的处理；FI是在去除上述FICB培养基中的CHIR99021和 I-BET151得到的培养基中培养来源于杂合TauEGFP基因敲入小鼠的MEFs48小时的处理；FC 是在去除上述FICB培养基中的ISX9和I-BET151得到的培养基中培养来源于杂合TauEGFP基 因敲入小鼠的MEFs48小时的处理；FB是在去除上述FICB培养基中的ISX9和CHIR99021得 到的培养基中培养来源于杂合TauEGFP基因敲入小鼠的MEFs48小时的处理；IC是在去除上 述FICB培养基中的Forskolin和I-BET151得到的培养基中培养来源于杂合TauEGFP基因敲 入小鼠的MEFs48小时的处理；IB是在去除上述FICB培养基中的Forskolin和CHIR99021 得到的培养基中培养来源于杂合TauEGFP基因敲入小鼠的MEFs48小时的处理；CB是在去除 上述FICB培养基中的ISX9和Forskolin得到的培养基中培养来源于杂合TauEGFP基因敲入 小鼠的MEFs48小时的处理；F是在神经元诱导培养基中加入Forskolin使Forskolin的含 量为100μM得到的培养基培养来源于杂合TauEGFP基因敲入小鼠的MEFs48小时的处理；I 是在神经元诱导培养基中加入ISX9使ISX9的含量为20μM得到的培养基培养来源于杂合 TauEGFP基因敲入小鼠的MEFs48小时的处理；C是在神经元诱导培养基中加入CHIR99021使 CHIR99021的含量为20μM得到的培养基培养来源于杂合TauEGFP基因敲入小鼠的MEFs48小 时的处理；B是在神经元诱导培养基中加入I-BET151使I-BET151的含量为2μM得到的培养 基培养来源于杂合TauEGFP基因敲入小鼠的MEFs48小时的处理。

G、每个小分子对于整体基因表达的影响。“上调”代表表达量比成纤维细胞至少提高了 两倍的基因，而“下调”代表表达量比成纤维细胞至少降低了两倍的基因。FICB处理同图E 中FICB处理、FICB-F处理同图E中-F处理，FICB-I处理同图E中-I处理，FICB-C处理同 图E中-C处理，FICB-B处理同图E中-B处理，4天FICB表示使用FICB在神经诱导培养基 诱导MEFs4天所得到的细胞。

H、在诱导CiNs中小分子扮演角色的概要图。

所有数据的呈现形式为均值加减标准误。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本 发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明， 均可从商业途径得到。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述细 胞均在37℃5％(体积百分数)CO₂的环境中培养。本申请所有实验中用的I-BET151均指I-BET 151hydrochloride，简称为B。

定义

“激动剂”是指能够显著增强某一基因表达或活性的物质。和没有激动剂的对照相比， 激动剂可以增强基因表达或活性10％,20％,30％,40％,50％,60％,70％,80％,90％或更多。 有些情况是表达或活性高于对照的1.5倍，2倍，3倍，4倍，5倍，10倍或更多。

“化学诱导的神经元(CiNs)”或“神经元样细胞”是指通过化学物质处理，从不是神经 元的细胞转变来的具有神经元样特性的细胞。

“培养”是指将细胞培养在细胞培养基中并根据情况进行传代。一个细胞培养可能是原 代培养(例如，没有传代过的细胞培养)或者可能是二代或更多代的培养(例如，被传代过 一次或多次的细胞培养)。

“CINPs”是指可以诱导或赋予非神经元细胞神经元样特性的化学物质。

“外源的”是指一个分子或物质(例如，核酸或蛋白质)是来自于细胞或生物体外部。 相反，“内源的”是指一个分子或物质来自于细胞或生物体自身。

“糖原合成激酶(GSK)抑制剂”是指可以抑制GSK的物质。GSK包括GSK1，GSK2和GSK3。

“抑制剂”是指导致基因表达量或活性和对照相比显著降低的物质。被抑制的表达或活 性和对照相比可以是10％,20％,30％,40％,50％,60％,70％,80％,90％或更多。有些情况是 表达或活性低于对照的1.5倍，2倍，3倍，4倍，5倍，10倍或更多。

“培养基”和“细胞培养基”是指细胞培养环境。培养基是一个典型的等渗溶液，可以 是液体，胶状或者半固体的，例如，给细胞提供一个粘附基质或提供支持。培养基可以含有 细胞生长必需的营养成分，化学物质和结构支持。

“非神经元细胞”是指在形态和功能上都不具有神经元性质的细胞。

“重编程”是指一种细胞类型转变为另一种细胞类型。例如，一个非神经元细胞可以被 重编程为一个神经元样的细胞。当用化学物质将细胞重编程为一个神经元样的细胞，那这种 得到的细胞就是化学诱导的神经元样细胞。

“转化生长因子β(TGFβ)受体抑制剂”是指抑制TGFβ受体的物质。TGFβ受体是单 通道丝氨酸/苏氨酸激酶受体。三个TGFβ受体类型包括I型，II型和III型。例如，TGFβ 受体1，TGFβ受体2和TGFβ受体3.

“治疗”和/或“改善”神经退行性或神经系统疾病或神经元损伤是指减少/降低神经退 行性或神经系统疾病或神经元损伤的相关症状。

一、实验步骤

1、成纤维细胞培养

纯合TauEGFP基因敲入小鼠(Tucker,etal.,NatNeurosci.,4:29-37(2001))， FSP1-Cre转基因小鼠(Bhowmick,etal.,Science,303:848-851(2004))以及 Rosa-CAG-LSL-tdTomato小鼠(简称Rosa26-tdTomato小鼠或R26-CAG-LSL-tdTomato小鼠) (Madisen,etal.,NatNeurosci.,13:133-140(2010))均从JacksonLaboratories购得。

1.1、用于分离成纤维细胞的杂合TauEGFP基因敲入小鼠：将纯合TauEGFP基因敲入小鼠 与野生型小鼠ICR或C57杂交后得到杂合TauEGFP基因敲入小鼠。

1.2用于谱系追踪的FSP1-Cre/R26-tdTomato/TauEGFP小鼠：将纯合TauEGFP基因敲入小 鼠、FSP1-Cre转基因小鼠和R26-CAG-LSL-tdTomato小鼠杂交得到 FSP1-Cre/R26-tdTomato/TauEGFP小鼠(图6中A)。FSP1-Cre转基因小鼠中Cre重组酶的表达 受成纤维细胞特异蛋白1(FSP1)基因启动子调控(Bhowmick,etal.,Science,303:848-851 (2004)；Iwano,etal.,J.ClinInvest.,110:341-350(2002)；Strutz,etal.,JCell Biol.,130:393-405(1995))。而Rosa26-tdTomato小鼠在Rosa26区域插入了CAG启动子以及 受控于Loxp-stop-Loxp的tdTomato荧光蛋白基因。FSP1-Cre转基因小鼠与Rosa26-tdTomato 小鼠杂交后再进一步与纯合TauEGFP基因敲入小鼠杂交则得到目标小鼠 -FSP1-Cre/R26-tdTomato/TauEGFP小鼠(图6中A)。该小鼠用于下述步骤5、细胞谱系追踪证 明化学重编程诱导成纤维细胞转变为神经元的实验。下述其它实验中所用的成纤维细胞均来 自步骤1.1的杂合TauEGFP基因敲入小鼠。

1.3下文中的成纤维细胞均是小鼠胚胎皮肤来源的成纤维细胞(mouseembryonicskin-derived fibroblasts，MEFs)，MEFs是从胚龄13.5天的胚胎分离获得(Vierbuchenetal.,Nature, 463:1035-1041(2010))。所分离得到的成纤维细胞均培养在成纤维细胞培养基(Dulbecco’s ModifiedEagleMedium(Hyclone)附加10％胎牛血清(FBS；Hyclone)，β-巯基乙醇(β-ME； Sigma-Aldrich)，非必需氨基酸(NEAA；LifeTechnologies)以及氨苄青霉素/链霉素(PS； LifeTechnologies))中。成纤维细胞在传2-3代后开始诱导。

2、获得化学诱导的神经元细胞(CiNs)

小分子(表格2)根据制造商说明用DMSO溶解并稀释，之后分别按以下浓度使用(在细 胞培养基中的浓度)：ISX9，20μM；SB431542，10μM；Forskolin，100μM；CHIR99021， 20μM；I-BET151，0.5-2μM。将传代的成纤维细胞铺于Matrigel包被的板子(BD；1:30 稀释于预冷的PBS)并直至长到聚合才开始用加入小分子的神经元诱导培养基进行化学诱导 (推荐铺被密度为100,000个细胞每6孔板一个孔，培养4天后开始诱导)。加入小分子的神 经元诱导培养基为向神经元诱导培养基中添加相应小分子得到的培养基。神经元诱导培养基 是向Neurobasal培养基中添加N2、B27、GlutaMAX、氨苄青霉素/链霉素(全部购于Life technologies)和bFGF(Origene)得到的培养基，N2在神经元诱导培养基中的质量含量为 1％，B27在神经元诱导培养基中的质量含量为2％，GlutaMAX在神经元诱导培养基中的质量含 量为1％，bFGF在神经元诱导培养基中的含量为100ng/ml。为了降低I-BET151的毒性，促进 细胞存活及重编程，可以在诱导早期(从0到4或者8天)加入ROCK抑制剂Y27632(2μM) 或者Fasudil(2μM)。在化学诱导20天后，这个阶段观察到细胞发出神经丝，诱导培养基 换成成熟培养基向所述神经元诱导培养基加bFGF、Forskolin，BDNF(Brain-derived neurotrophicfactor)(Peprotech公司产品)和GDNF(Glialcellline-derived neurotrophicfactor)(Peprotech公司产品)得到的培养基，bFGF在所述成熟培养基中 的含量为50ng/ml，Forskolin在所述成熟培养基中的含量为10μM，BDNF在所述成熟培养 基中的含量为20ng/ml，GDNF在所述成熟培养基中的含量为20ng/ml。诱导至20天的细胞用 0.25％的胰酶消化或者用枪头吹下来并接种到原代分离的星形胶质细胞上进行共培养以进一 步促进诱导细胞成熟。加入小分子的神经元诱导培养基在诱导过程中每3到4天换一次液。 对于细胞增殖鉴定实验，BrdU(5-bromo-2-deoxyuridine)按终浓度10μM加入培养基。

2.1第一轮化学筛选(Ascl1+1)

多西环素(doxycycline，dox)诱导的Ascl1慢病毒载体的制备和转染按照文献 (Vierbuchen,etal.,Nature,463:1035-1041(2010))进行。为激活外源Ascl1的表达， 在感染16-20小时后在成纤维细胞培养基中添加2μg/mldox(Sigma-Aldrich)。48小时后， 细胞被转移到加入小分子的神经元诱导培养基，用于筛选的小分子单独加入神经元诱导培养 基。在诱导期间，每3-4天换液。用于第一轮化学筛选的小分子库如表1所示，部分小分子 信息如表2所示。

表1、开发重编程小分子使用的化学小分子库

表2、用于重编程诱导的小分子信息

注：ISX9＝N-Cyclopropyl-5-(2-thienyl)-3-isoxazolecarboxamide

SB431542＝4-[4-(1,3-benzodioxol-5-yl)-5-(2-pyridinyl)-1H-imidazol-2-yl]benzamide

I-CBP112＝1-[7-(3,4-Dimethoxyphenyl)-9-[[(3S)-1-methylpiperidin-3-yl]methoxy]-2,3,4,5-tetrahydro-1,4-benzoxazepin-4-yl]propan-1-one；

JQ1＝(6S)-4-(4-Chlorophenyl)-2,3,9-trimethyl-6H-thieno[3,2-f][1,2,4]triazolo[4,3-a][1,4]diazepine-6-aceticacid1,1-dimethylethylester

CHIR99021(“C”)＝[6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5-methyl-1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl]amino]-3-pyridinecarbonitrile]

2.2、第二轮化学筛选(FICS+1)进一步寻找到可以促进化学重编程的小分子I-BET151

为了将不涉及外源遗传操作的纯化学重编程过程变得更高效，使其成为一个更稳定的诱 导体系，进行了第二轮的化学筛选，寻找可以促进神经元细胞重编程以及功能成熟的其他小 分子。在这个筛选中，通过观察神经突起发生的变化检测所添加的小分子的影响。此外，通 过免疫组化等鉴定方法(如TUJ1免疫染色)进行确认。成纤维细胞接种于12孔培养板，成纤 维细胞被种植于12孔板中，连同已经加了FICS的基础小分子的培养基，候选的筛选用小分子 被逐一单孔加入到已种植的成纤维细胞中，FICS+DMSO被作为此筛选策略的阴性对照，在16 天的诱导期，培养基每3-4天换液，显著增加神经突起的发生的小分子为候选化合物。通过筛 选约1500个小分子，发现了一个小分子I-BET151可以有效增强细胞重编程的比例(可诱导约 90％的TUJ1阳性细胞)以及神经突起的发生，采用免疫组化染色进一步证实。拥有圆形立体的 胞体结构、以及至少比胞体长三倍的神经突起的细胞被记作TUJ1阳性细胞。共选取了10个20 倍视野来定量诱导的TUJ1阳性细胞数。

3、免疫荧光分析

细胞用PBS两次后用4％多聚甲醛溶液室温固定20min。随后，细胞用PBS洗2次，然后用 0.25％PBST(PBS加0.25％TritonX-100)通透和用3％驴血清(DS)在37℃孵育1小时。圈出 染色区域，分别加入稀释的第一抗体，在4℃孵育过夜。接下来，细胞用PBS洗三次，在添加 3％驴血清和第二抗体的PBS中室温下孵育1小时。需要时，细胞的细胞核用DAPI(Roche MolecularBiochemicals)染色.T所用的第一抗体如下:rabbitanti-TUJ1(Covance, 1:500),mouseanti-TUJ1(SantaCruz,1:100),mouseanti-MAP2(Sigma-Aldrich,1:200), rabbitanti-NF-H(Abcam,1:500),mouseanti-NeuN(Millipore,1:50),rabbitanti-GABA (Sigma-Aldrich,1:10,000),rabbitanti-vGLUT1(SynapticSystems,1:5,000),rabbit anti-COL1A1(Abcam,1:500),mouseanti-BrdU(SantaCruz,1:50),goatanti-SOX2(Santa Cruz,1:100),rabbitanti-PAX6(Covance,1:250),rabbitanti-GFAP(Dako,1:400), mouseanti-A2B5(Millipore,1:200),goatanti-SOX10(SantaCruz,1:20),andrabbit anti-P75(Millipore,1:100).所用的第二抗体如下:FITCandTRITC-conjugated secondaryantibodies(JacksonImmunoResearch)andAlexaFluor647-conjugated secondaryantibodies(LifeTechnologies)。

4、实时荧光定量PCR

使用QiagenRNeasyPlusminikit提取总RNA，使用TransScriptOne-stepgDNARemoval andcDNASynthesisSuperMix(TransGenBiotech)反转录成cDNA。实时定量PCR使用带有 PowerSYBRGreenPCRMasterMix(2×)的7300实时PCR系统(AppliedBiosystems)进行。 引物列于表3。

表3.用于实时荧光定量PCR和单细胞分析的引物

基因表达量是用ΔΔCT方法分析。所有的结果用β-actin表达量进行归一化处理，将 未诱导的成纤维细胞的值设置为1。实验重复两次。

5、流式细胞分析

TAU-EGFP阳性细胞率使用FACSCalibur流式细胞仪(BectonDickinson)测定，用FlowJo 分析流式细胞仪检测数据。tdTomato阳性细胞用MoFlocellsorter(DakoCytomation)进 行分选。

6、单细胞基因表达分析

按照(Tang,etal.,Nat.Protoc.,5:516:535(2010))获得单细胞转录物，用Power GreenMasterMixkit(LifeTechnologies)制备单细胞的cDNA。按照步骤4的方法 进行实时荧光定量PCR。

数据采用PCR系统相关的软件进行分析，根据熔解曲线评估每个反应的特异性。计算循 环阈值(cyclethreshold，CT)确定单细胞基因表达谱值。引物列于表3。

7、原代神经细胞培养和二次铺被诱导神经细胞

使用新生1天的野生型C57小鼠制备原代神经元细胞。小鼠被处死后，大脑被取出放在已 经预冷的生理盐水中。在预冷的HBSS中切割大脑海马区(9.5g/LHanks’缓冲盐,4.2mM NaHCO₃,10mMHEPES,12mMMgSO₄,7g/L葡萄糖,0.3g/L牛血清白蛋白,0.5％氨苄青 霉素/链霉素,用NaOH将pH调节到7.4)。使用5ml0.2％的胰酶(Gibco,溶解于消化液中)消化 海马区组织2-3分钟，用1mg/ml胰酶终止剂(Sigma,溶解于HBSS)终止消化反应。消化溶液 包含：4.2NaHCO₃,25HEPES,137NaCl,5KCl,和7Na₂HPO₄(单位：mM)，用NaOH将pH调 到7.4.消化后的细胞清洗三次后于1,000rpm离心10分钟。这些分离出的神经元细胞被重悬 于包含有2％B27和2mM谷氨酰胺以及0.5％的双抗的Neurobasal培养基(Invitrogen)中。总计 1*10⁶被铺被于已经预处理了12.5μg/ml的多聚-D-赖氨酸(Sigma)并放置于6孔板中的玻片 上。这些孔板被放置于37度，5％二氧化碳的培养箱中培养，每三天换液一次。

在培养了原代神经元和胶质细胞一个星期时间后，这些诱导神经元细胞被小心的从培养 皿中用枪头吹吸或胰酶消化的方法脱壁，被重新铺被到原代神经细胞上。在重新铺被14到21 天之间进行电生理检测和记录。

8、RNA-Seq

从成纤维细胞、CiNs(诱导48小时和19天的)以及原代神经元中分离总mRNA。使用Illumina mRNA-seqPrepKit构建RNA测序文库。通过IlluminaHiSeq2000对片段和随机配对的200bp 双末端文库进行测序。通过TopHat程序绘制转录组读取序列谱。标准化的差异表达基因被检 测到。用RPKM值来评估基因表达水平。通过Cluster3.0和TreeView进行分级聚类。在散点 图中，设两倍的变化为基因表达显著改变的阈值。通过DAVID程序进行差异表达基因的GO分析， 此方法同NatureProtoc.,4(1):44-57(2009)中所描述的一样。

9、RNA-SeqGEO序列号

本研究中RNA-Seq数据的GEO序列号为GSE68715。

10、电生理测试

在全细胞膜片钳实验中，细胞外溶液为人工脑脊液(ACSF)，其中包含141mMNaCl，2.5 mMKCl，1.3mMMgCl₂，2.4mMCaCl₂，1.25mMNaH₂PO₄，10mM葡萄糖和10mMHEPES，并 用NaOH调节pH至7.4。玻璃吸量管微电极内液包含140mM葡萄糖酸钾，1mMCaCl₂，10mM EGTA，2mMMgCl₂，10mMHEPES和5mMNa₂ATP，并用KOH调节pH至7.3。电极由P97电极 拉制仪制作，使得阻抗达到约5MW。膜片钳记录信息由EPC-10放大器收集，PathchMaster 软件处理。记录钠电流与钾电流时，细胞膜电位起初钳制在-80mV，然后以10mV的增幅从 -80mV去极化至+80mV，每个去极化电位持续时间为1s。采样时间与去极化间隔时间分别为 2ms与2s。河豚毒素(TTX，10mM)溶解于细胞外溶液中，由ALA-VM4阀箱施于细胞。从诱 导神经元洗脱后，检测内向快速失活电流是否为钠电流。在电流钳实验中，超极化电流被注 射到诱导神经元细胞中，使其膜电位维持在-70mV左右。诱发动作电位的阶跃电流之间间隔 为3s。细胞被钳制在0pA以记录静息膜电位。电流钳实验中，采样频率为25kHz。为了记 录自发性兴奋性突触后电流(sEPSCs)与自发性抑制性突触后电流(sIPSCs)，诱导细胞分别 被钳制在-70mV(接近氯离子反转电位)和0mV。采样频率为20kHz。

二、结果

1、筛选可诱导神经命运的小分子化合物

为了找出可诱导神经命运的小分子，开展了第一轮化学筛选，在之前的研究中，有三个 转录因子组合(Ascl1、Brn2和Myt1l)被证明可以诱导小鼠的成纤维细胞转变成神经元，其 中，Ascl1是诱导神经命运的主宰基因，而Brn2和Myt1l作为辅助因子可以增强神经命运的 转变(Vierbuchenetal.,Nature,463:1035-1041(2010)).。没有Brn2和Myt1l，Ascl1 单独诱导神经元的效率很低(Vierbuchenetal.,Nature,463:1035-1041(2010))。因此， 首先进行了一轮化学筛选寻找可以增强Ascl1诱导效果的小分子(图1中A)。该筛选在来 自杂合TauEGFP基因敲入小鼠的小鼠胚胎皮肤来源的成纤维细胞((MEFs))中进行，该MEFs 转染有表达Ascl1的病毒载体(Tuckeretal.,NatNeurosci.,4:29-37(2001)； Vierbuchenetal.,Nature,463:1035-1041(2010))。

通过筛选大约5000个小分子(表1)，发现Forskolin、ISX9、CHIR99021和SB431542 这4个小分子分别都能增强Ascl1的诱导效率，使TAUEGFP/TUJ1双阳性的神经细胞数量提高 至少两倍(图1中B)。而Ascl1和这4个小分子结合在一起使用可进一步增强诱导神经元 的产生效率(比Ascl1单独作用效率高10倍以上)(图1中B和C)。因此，确定了这4个 小分子的组合可以稳定促进基于外源因子Ascl1的从小鼠成纤维细胞到神经元命运的转变。

为考察外源的“主宰基因”对于诱导神经元命运是否是非必需的，仅用小分子对起始的 成纤维细胞进行诱导(图1中D)。有意思的是，在没有外源Ascl1的情况下，“FICS” (Forskolin，ISX9，CHIR99021和SB431542)这4个小分子的组合足以诱导神经元命运的产 生，只是诱导时间加长了(21天)，所获得的细胞大于30％都是TUJ1阳性的并且具有基本的 神经元样的细胞形态(图1中D和F；表2)。每个小分子单独作用并不能诱导出神经元样 的细胞，表明他们之间的协同作用非常重要(图1中F)。这些发现表明这一新的小分子组 合可以起始成纤维细胞向神经元命运的转变。

2、进一步寻找到可以促进化学重编程的小分子I-BET151

为了增强不涉及外源遗传操作的纯化学重编程过程，使其成为一个更稳定的诱导体系， 用来自杂合TauEGFP基因敲入小鼠的小鼠胚胎皮肤来源的成纤维细胞进行了第二轮的化学筛 选，寻找可以促进神经元细胞重编程以及功能成熟的其他小分子。根据需要，这种理想的小 分子应该能促进诱导神经元的神经突起的发生，并最好使细胞获得一个更复杂的形态学结构 (图3中A)(Vierbuchenetal.,2010)。通过在“FICS+1”的体系上筛选了大概1500个小分 子(图3中A)，发现了一个小分子I-BET151可以有效增强细胞重编程的比例(可诱导约90％的 TUJ1阳性细胞)以及神经突起的发生(图3中B和表2)。此外，在这一新的“FICSB”组合中， SB431542(S)虽然可以增强诱导神经元的存活以及神经突起的发生，但对于神经元的获得并 不是必需的(图3中C和图2中A)。在之后的实验中都使用“FICB”这一小分子组合，并对每个 小分子的使用浓度都进一步做了优化(图2中B)。在FICB诱导16-20天后，可获得90％以上的TUJ1 阳性细胞(其中71％为TAUEGFP/TUJ1双阳性，30％为NEUN/TUJ1双阳性)，这些细胞有大量的神 经突起(图3中B)。FICB诱导的细胞共表达很多神经元特异的标记基因，包括MAP2和NF-H(图 3中D)。此外，FICB诱导的细胞看起来是既有兴奋性神经元又有抑制性神经元的混杂群体，因 为VGLUT1阳性以及GABA阳性的这两种细胞都可以被检测到(图3中D)。综合在一起，这些结果 表明通过使用FICB可以实现神经元样细胞的化学重编程诱导。

3、化学小分子诱导神经元(CiNs)基因表达谱相似于功能神经元

为了进一步促进诱导的神经样细胞功能成熟，参考文献报道的做法，将步骤2中FICB诱导 的细胞与来自新生小鼠的原代胶质细胞或原代神经元在促成熟培养基(向上述神经元诱导培 养基加bFGF、Forskolin，BDNF(Brain-derivedneurotrophicfactor)和GDNF(Glialcell line-derivedneurotrophicfactor)得到的培养基，bFGF在所述促成熟培养基中的含量为 50ng/ml，Forskolin在所述促成熟培养基中的含量为10μM，BDNF在所述促成熟培养基中的 含量为20ng/ml，GDNF在所述促成熟培养基中的含量为20ng/ml)中共培养(Chandaetal., 2014；Vierbuchenetal.,2010)。在促成熟培养14-21天后，诱导细胞进一步成熟而伸出更 多的神经突起(图3中E)。将经过这个过程后所最终诱导出来的神经元称为化学诱导的神经元 细胞(CiNs)(图3中F)。为了排除混杂的多细胞群对基因表达谱结果的噪音影响，从单细胞 水平对CiNs的基因表达谱进行了分析，并进一步确定诱导神经元所属的功能亚型。实验证明 多个典型的泛-神经元与功能突触蛋白共表达在同一个细胞内。在CiN细胞群中，兴奋性与抑 制性神经元均可以被检测到。大部分(约占45.8％)的CiNs为表达vGlut的兴奋性谷氨酰胺能神 经元，而表达Gad67的抑制性神经元约占20.8％(图4中A)。不仅如此，诱导细胞不仅建立起 神经元特异的转录谱，同时成纤维细胞特异基因，如Fsp1、Col1a1的表达也被沉默(图3中G 和图4中A)。

4、CiNs具备的神经元电生理功能特征

为了检测CiNs的电生理功能特性，对步骤3的CiNs进行了全细胞膜片钳记录实验(图5中 A)。化学诱导14-20天的CiNs细胞膜去极化后，电流钳取具有显著细胞突起的CiNs细胞检测， 能够记录到动作电位(35.0％,n＝20)(图5中B；表4)。同时，电压钳记录到快速非活化内向及 外向电流，证明CiNs细胞膜表面电压依赖的钾离子及钠离子通道开放(图5中C；表4)。此外， 将CiNs与单层培养的原代胶质细胞或神经元共培养后，CiNs细胞膜的神经元功能特性显著增 强(53.8％,n＝39)(图5中D和E；表5)。自发的兴奋性突触后电流也被检测到(47.6％,n＝21)(图 5中F和图4中B；表5)。兴奋性突触后电流可以被受体特异的拮抗剂，如6-氰基-7-硝基喹喔 啉-2,3-二酮(CNQX)和2-氨基-5-磷酰基戊酸酯(AP5)，所抑制(图5中F)。以上实验结果证明 CiNs具有神经元细胞膜的功能特性，并且在与原代胶质细胞或神经元共培养后，CiNs细胞之 间或与原代神经元之间能够形成突触连接和通讯。

表4.未经共培养的CiNs电生理特性

注：Rm:输入阻抗；Cm:膜电容；RMP:静息膜电位；APthreshold:动作电位阈值；APamp:动作电位峰度； Ina-max:最大钠电流峰值。所有数据为均值+/-标准误。

表5.经原代胶质细胞或神经元共培养的CiNs电生理特性

注：所有数据为均值+/-标准误。

5、细胞谱系追踪证明化学重编程诱导成纤维细胞转变为神经元

为了证明化学重编程得到的神经元是由成纤维细胞转变而来，利用Cre-LoxP细胞谱系追 踪系统来跟踪表达成纤维细胞特异基因，Fsp1，的细胞的命运转变(Bhowmicketal., 2004；Iwanoetal.,2002；Madisenetal.,2010；Strutzetal.,1995)(图6中A)。由 TdTomato荧光蛋白标记的细胞同时表达另一种典型成纤维细胞蛋白，COL1A1，从而进一步证 明被标记细胞为成纤维细胞(图6中B和C)。在经过化学诱导后(用上述FICB培养基培养)， TdTomato阳性细胞发出大量神经元样细胞突起(图6中D)。结果表明TdTomato阳性细胞可以通 过化学重编程相对高效地被诱导为神经元(图6中E-Q)。以上结果为化学重编程诱导成纤维细 胞转变为神经元提供了直接的遗传学证据。

6、CiNs的化学诱导过程不经过中间增殖阶段

为了进一步理解化学重编程所经历的中间过程，在上述小分子诱导(用上述FICB培养基 进行培养)来自杂合TauEGFP基因敲入小鼠的小鼠胚胎皮肤来源的成纤维细胞进行化学重编程 的同时，用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)处理细胞(图7中A)(Vierbuchenetal.,2010)。结 果显示大部分(约80％)的TUJ1阳性细胞没有被BrdU标记(图7中B和C)，说明化学小分子诱导 的细胞重编程并不经过中间细胞增殖阶段。

7、在诱导CiNs产生的过程中，小分子直接激活了神经元关键的转录因子并打破了成纤维 细胞特异的基因调控网络

为探究小分子如何在化学重编程中发挥作用，首先采用每个小分子的功能替代物尝试将 其替代来进一步研究他们的生物学活性。将来自杂合TauEGFP基因敲入小鼠的小鼠胚胎皮肤来 源的成纤维细胞分别在相应的小分子诱导培养基中按照上述方法进行培养14-21天后检测 TUJ1阳性细胞。结果表明Forskolin(cAMP激活剂)、CHIR99021(GSK3抑制剂)和I-BET151 (BET家族溴结构域抑制剂)分别可以被其他的cAMP激活剂、GSK3抑制剂和BET抑制剂所替代 (图4中C)，表明了他们在CiNs化学重编程诱导过程中的功能靶点。

为了更好地理解细胞命运重编程的过程，用RNA-Seq分析来检测小分子处理48小时以及19 天后的细胞(用上述FICB培养基分别培养杂合TauEGFP基因敲入小鼠的MEFs48小时和19天) 整体基因表达谱的变化。层次聚类的结果显示，诱导细胞和原代神经元聚类很近，但和成纤 维细胞很远(图8中A)。相应的，在选取了特异表达于成纤维细胞、CiNs和原代神经元中的特 异表达基因(表达量相差至少3倍)进行分析后(Caiazzoetal.,2011；Duetal.,2014)， 发现这些特异表达基因的重叠情况在诱导后的细胞和原代神经元之间呈现出一定的相似性 (图8中B)。对比成纤维细胞，诱导19天后的细胞(神经元样细胞，CiNs)富集表达很多神经 元特异的基因，包括参与神经元形态发生和维持、离子通道以及功能突触组分的基因(Mapt、 Gap43、Stmn3、Stmn4、Syn1、Syp和Syt1)(图8中C和D)。此外，成纤维细胞标志基因(Fap、 Des、Twist2等)被下调了(图8中D)(Caiazzoetal.,2011；Kimetal.,2011)，表明CiNs 丢失了原始的成纤维细胞特性。其中，以成纤维细胞中同一基因的表达量为1，诱导19天后的 细胞(神经元样细胞，CiNs)中的Fap,Des,Slug,Dcn,和Twist2表达量分别是0、0.04、0.16、0.003、 0.065。与此结果具有一致性的是，在进一步选择了特异性表达基因(表达量高至少10倍)进 行分析后，发现小分子诱导的细胞中成纤维细胞基因表达网络被打破了，而神经元富集基因 被上调了(图9中A)。化学诱导19天后，60.6％的神经元富集基因被上调了至少两倍，而只有 1.8％被下调了。另外，80％的成纤维细胞富集基因被下调了至少两倍，而只有6.1％被上调了， 这表明化学诱导既可以整体性地激活神经元富集基因，同时又能抑制成纤维细胞富集基因的 表达(图9中A)。GO分析显示化学诱导后上调的基因主要是参与突触传导、神经元分化、神经 元发育、离子运输、轴突生成、离子通道激活以及其他一些神经发育的关键生物学过程(图9 中E)。下调的基因则主要参与细胞周期、细胞分裂等生物学过程(图9中E)。综合在一起，这 些结果表明小分子诱导后的细胞获得了一个类似原代神经元的转录谱并打破了原始细胞的转 录网络。

RT-qPCR分析结果表明神经命运决定基因的激活和成纤维细胞命运决定基因的下调在小 分子处理24小时之内就发生了(图9中B和C)。ISX9对于激活很多神经元特异基因是必需的， 包括像NeuroD1这种神经元主宰基因(matergenes)(图9中D)。在化学诱导48小时后，NeuroD1 和Ngn2这两个神经命运主宰基因的表达被显著上调了(图9中B和E)，表明这两个转录因子可 能参与了最初的化学诱导过程。有意思的是，Ascl1这一最常被用于诱导神经元命运转变的主 宰转录因子在重编程早期并没有被激活(图9中B)。

接下来，确定了每个小分子在调节这些内源性细胞命运决定基因的表达上的作用。通过 从组合中逐一撤除每个小分子，结果发现ISX9对于诱导关键神经基因是必需的(图9中D-F)， 表明这些小分子是通过一个基于ISX9的协同作用来诱导神经命运决定基因表达的。有意思的 是，实验结果表明I-BET151是抑制内源性成纤维细胞命运决定基因表达谱的核心小分子(图9 中F和G)，导致了成纤维细胞核心转录网络的有效破坏。这些结果表明小分子通过协同性地激 活目的细胞命运主宰基因并抑制起始细胞命运主宰基因的方式对细胞命运进行了操控(图9 中H)。

三、讨论

本申请开发了一组全新的小分子，能够高效诱导从成纤维细胞向功能神经元细胞跨胚层 的直接谱系重编程。这些化学方法诱导的神经元细胞表现出原代神经元细胞的特征，体现在 表达神经细胞的基因表达谱以及具备相应的电生理功能。化学方法直接重编程诱导神经元的 发现和化学方法诱导细胞多能性的发现(Houetal.,2013)证明了体细胞命运能够通过采 用小分子化合物操纵细胞信号通路和内源的细胞命运决定网络的方式实现，而整个过程不需 要外源转基因或其它细胞命运特异的因子，比如microRNAs。

虽然主宰转录因子被认为是细胞命运的主导决定因素(Xuetal.,2015)，本申请展示了 一组小分子化合物就足够激活这些基因的表达。就像在研究中展示的一样，ISX9，一种异恶 唑，已经被报道通过激活的钙离子信号促进神经分化(Schneideretal.,2008)，在本申请的 诱导体系中对于在成纤维起始细胞上激活神经基因是必须的，这种激活效应被其它小分子进 一步加强(图9中D和E)。在诱导CiNs的重编程过程中，Ngn2和NeuroD1是第一轮响应的 基因，它们在小分子处理6小时内就被激活(9中B)。最近，Ngn2，在发育中的神经命运决 定性的原神经基因，已经被报道可以在辅助其它转录因子和小分子的情况下从成纤维细胞直 接诱导神经命运的发生(Bertrandetal.,2002；Liuetal.,2013)。其它的神经基因(因 子)也在接下来的化学重编程进程中被后续性激活(图9中A和图8中D)。这些结果揭示了 小分子主导的成纤维细胞向神经元细胞的直接重编程过程是一种层级性的转录激活的过程， 在这个过程中被小分子有效激活的细胞命运决定的基因可能起始和稳定了自我调节的神经特 异性转录网络环路，并进一步的激发了下游的调控基因的表达，并建立神经元的功能特征。

有趣的是，添加到小分子组合中的I-BET151显著的增进了重编程过程(图3中B和C)， 并且，进一步发现I-BET151是破坏成纤维细胞核心转录网络的核心小分子(图9中F)。 I-BET151被报道能够竞争性的结合到BET家族蛋白的BRD结构域(Sealetal.,2012)。BRD4， BET家族蛋白之一，被报道能够特异性的结合到已激活(开放的)染色质区域和维持细胞特 异的基因表达谱BRD4(Wuetal,2015)。抑制BRD4可能破坏细胞命运的维持特性并且改变 起始细胞类型的表达谱(Chiangetal.,2014；DiMiccoetal.,2014)，这和本申请发现 的I-BET151在早期重编程过程中直接破坏了成纤维细胞特异的基因网络是一致的(图9中D 和F)。并且，本申请也和细胞命运改变的“彼此抑制模型”(Wangetal.,2011)，以及 已有的报道证明细胞命运能够通过敲除起始细胞类型的关键转录因子是一致的(Hannaet al.,2008)。并且，就在最近已发现BRD4通过结合到核心基因的超级增强子上来维持胚胎干 细胞(ESCs)的多能性，而抑制BRD4导致ESCs核心干性网络的丢失和促使向神经外胚层的 特化(DiMiccoetal.,2014)。作用于结合在超级增强子区的蛋白复合体或者相关激活(维 持)基因表达的因子上的小分子有可能将来能够成为一种广泛的擦除起始细胞身份的擦除剂。

另外，虽然在本申请的研究中被鉴定出的小分子并非特异作用神经谱系的，但是它们作 用的信号通路已被报道涉及体外的神经定向分化，甚至包括体内的神经发育。CHIR99021通 常作为一个糖原合成酶激酶3B的抑制剂被用于诱导多能干细胞向神经分化(Chamberset al.,2009)，并且这个小分子最近也被报道能够增进转录因子介导的神经直接重编程 (Ladewigetal.,2012)。Forskolin是一种独特的二萜腺苷酸环化酶激活剂，并且通常被 用于增加cAMP的水平(Seamonetal.,1981)，而cAMP反应结合元件(CREB)，Forskolin 的一个下游靶点，已经被报道用来调节神经的特化和促进轴突的再生(Seamonetal.,1981； Dworkinetal.,2010)。这些在定向分化和谱系重编程上有双重功能的小分子揭示了发育线 索和发育相关的信号通路对于开发促进细胞谱系重编程也是很有教益的。

总体而言，本申请揭示了一张新奇的再生医学蓝图，通过使用化学药剂来改变和设计细 胞身份。CiNs和CiPSCs(Houetal.,2013)两项研究的发现揭示了一种通过开发小分子来 操纵细胞命运的普适性策略，这种策略通过小分子替代已经报道的用于谱系重编程的基因， 激活目标细胞类型特异的主宰基因和沉默起始细胞类型的核心基因表达(实现细胞命运的操 纵)。考虑到这种方法未来潜在的治疗用途，可以预期未来通过采用当前已经建立的这种化 学重编程策略，来操纵人类细胞命运。在未来，本申请将可能引导新的其它小分子的发现， 这些新组建的小分子组合将可能实现直接重编程获得其它功能细胞类型，并有可能帮助更精 确的鉴定出决定细胞命运和重编程的新的因子。并且，本申请的研究可能对体细胞命运的可 塑性提供了新的观点，揭示出细胞命运的可塑性可能比以往认为的更加灵活、更加具备可操 作性。

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