一种戴氏绿僵菌MTYJ141025及其应用

摘要

本发明提供了一种戴氏绿僵菌MTYJ141025及其应用，该戴氏绿僵菌MTYJ141025于2014年12月4日保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC？No.？10140。本发明是初次从危害甘蔗的蔗锯天牛幼虫体上分离得到的菌株，培养比较简单，生长快速，对蔗根锯天牛幼虫的毒力强。其分生孢子对甘蔗锯天牛幼虫致病力强，环保无污染、不易产生抗药性，可以广泛地用于甘蔗蔗根锯天牛的防治。

说明书

技术领域：

本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种戴氏绿僵菌(Metarhizium taiiLiang&Liu)MTYJ141025及其应用。

背景技术：

蔗根锯天牛[Dorysthenesgranulosus(Thomson)]隶属于鞘翅目 (Coleoptera)天牛科(Cerambycidae)，广泛分布于广西、广东、海南及云 南等主要甘蔗产区，是危害甘蔗的重要害虫，主要以幼虫咬食甘蔗根茎 部及主根，导致甘蔗整株死亡，严重影响甘蔗生产。由于甘蔗多为宿根 蔗，再加上随着甘蔗大面积的连作种植，蔗根锯天牛的发生危害日趋严 重，目前主要采取以农药防治为主的防治措施。化学农药虽然具有见效 快，但化学农药的施用不仅会造成甘蔗农药残留及严重的环境污染，而 且易杀死蔗根锯天牛的自然天敌，并使目标害虫产生抗药性，因而不符 合害虫治理的可持续性及生态控制的要求。而生物防治措施具有生态、 持续控制的特点，因而生物防治则是蔗根锯天牛生态、持续控制的重要 途径。昆虫病原真菌因其具有自然流行性强、不染污环境、对人、畜、 植物安全，害虫极少或不产生抗性，有利于环境保护的特点，成为害虫 生物防治的重要措施。因此，研究蔗根锯天牛的生防真菌，为蔗根锯天 牛的生物防治提供依据，也为减少化学防治所带来的抗药性及环境污染 提供保障。

戴氏绿僵菌(MetarhiziumtaiiLiang&Liu)属于接合菌亚门丝孢纲丝 孢目绿僵菌属。据记载，戴氏绿僵菌的寄主为一种鳞翅目夜蛾幼虫，而 对蔗根锯天牛的侵染还未见报道。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种戴氏绿僵菌MTYJ141025及其应用，旨在 克服现有戴氏绿僵菌未发现能寄生蔗根锯天牛的不足，通过生物技术手 段防治蔗根锯天牛，避免或减少因不合理使用化学农药所带来的抗药性 问题。

本发明是这样实现的，一种戴氏绿僵菌(MetarhiziumtaiiLiang& Liu)MTYJ141025，于2014年12月4日保藏于中国微生物保藏管理委员 会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.10140，保藏地址为北京市朝阳 区北辰西路1号院3号。

本发明的进一步的目的在于提供上述戴氏绿僵菌MTYJ141025在蔗根 锯天牛防治方面的应用。本发明于2013年8月，在云南省元江县甘蔗田 间调查时发现戴氏绿僵菌在蔗根锯天牛中大量发生流行，引起大量蔗根 锯天牛感染死亡。因此，该菌株是目前国内首次发现的寄生蔗根锯天牛、 流行性很强的虫生真菌，在防治蔗根锯天牛中具有很大的开发应用前景。

本发明从罹病蔗根锯天牛幼虫上分离获得戴氏绿僵菌野生菌株，将 野生菌株回接于蔗根锯天牛幼虫上复壮得到戴氏绿僵菌菌株，对该菌株 采用按常规方法进行单孢分离、培养得到纯的、致病力强的戴氏绿僵菌。 在SDAY培养基上菌落平展，绒毛状，中部白色其外为墨绿色产孢轮带， 边缘绿豆汁黄，背面芥黄轮带。瓶梗柱状，具短尖8.4－20×1-1.5μm，单 生于气生菌丝或紧密地轮生于分生孢子梗及原瓶梗上，也可通过微循环 产孢子从次生子囊孢子产生。分生孢子柱状，中部稍缢缩，两端圆或一 端变细尖(4.8-)7.8～9.6(-14)×2.5～3μm，偶有双细胞分生孢子13×3μm。 由微循环产孢形成的分生孢子，其形状和大小基本与前者相同， 7.2-9×2.5μm。

相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：本发明 是初次从戴氏绿僵菌体上分离得到的菌株，培养比较简单，生长快速， 产孢量大。其分生孢子对蔗根锯天牛幼虫致病力强，环保无污染、不易 产生抗药性，可以广泛地用于蔗根锯天牛的防治。

具体实施方式：

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实 施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实 施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例一、病原菌的分离、鉴定

1.1材料与方法

1.1.1材料

在云南省元江县采集到被一种虫生真菌侵染后的罹病蔗根锯天牛幼 虫。

萨氏培养基(SDAY)：1％蛋白胨+1％酵母粉+4％葡萄糖+1.5-2％琼脂粉 +1000ml水。

无菌操作条件：所有的器皿和用具均经高温灭菌锅(121℃，30min)， 接种等操作均在超净工作台内进行。

培养条件：置于28℃光照(12L：12D)恒温箱中培养，待菌落形成 后，转移到试管SDAY斜面，培养2-3天，转入4℃冰箱储存。

1.1.2病原菌的分离和纯化

分离：从罹病蔗根锯天牛幼虫尸体上分离病原菌。将蔗根锯天牛幼 虫罹病虫体带回实验室，将罹病蔗根锯天牛幼虫尸按顺序依次经过70％ 酒精浸泡30秒、再经过0.1％升汞溶液浸泡3分钟(彻底消毒)、最后用 无菌水冲洗三次，再用接种针取处理好的蔗根锯天牛幼虫组织接种于 SDAY培养基上。在温度为28℃条件下培养，长出菌丝后按常规方法进行 单孢分离、培养得到纯的、产孢能力强的菌株戴氏绿僵菌Metarhizium taiiLiang&Liu，转移到SDAY斜面上生长3-4天，在4℃冰箱储存。

复壮：将分离到的菌株在SDAY上培养2-3天后，产生大量分生孢子， 再将该分生孢子挑入含1％吐温-80的无菌水，用玻璃棒搅拌均匀，得到 适当浓度(10⁸孢子/ml)的孢子悬浮液，用小型喷雾器均匀喷于家蝇成虫 体表(以虫体表面湿润为度)，保持相对湿度80％以上。收集死虫并保湿， 得到的幼虫虫尸再按以上方法分离得到致病力更强的菌株。

纯化：挑取培养基上分生孢子粉，再次接种在新的培养基上。如此 培养2～3代，菌株就被纯化。

1.1.3病原菌的鉴定

根据病原菌的培养性状、菌丝和分生孢子的形态进行鉴定。利用 40×10倍显光学微镜，镜检菌丝、分生孢子和分生孢子梗的形态。

1.2结果

从被虫生真菌自然侵染的蔗根锯天牛幼虫体上分离获得野生菌株， 在萨氏琼脂培养基(SDAY)上培养，并回接于蔗根锯天牛幼虫复壮获得 一菌株，对该菌株进行单菌丝分离获得纯化的菌株，即戴氏绿僵菌 MetarhiziumtaiiLiang&LiuMTYJ141025。

在SDAY培养基上菌落平展，绒毛状，中部白色其外为墨绿色产孢轮 带，边缘绿豆汁黄，背面芥黄轮带。瓶梗柱状，具短尖8.4－20×1-1.5μm， 单生于气生菌丝或紧密地轮生于分生孢子梗及原瓶梗上，也可通过微循 环产孢子从次生子囊孢子产生。分生孢子柱状，中部稍缢缩，两端圆或 一端变细尖(4.8-)7.8-9.6(－14)×2.5-3μm，偶有双细胞分生孢子13×3μm。 由微循环产孢形成的分生孢子，其形状和大小基本与前者相同， 7.2-9×2.5μm。

根据田间感染症状、采集罹病虫体室内分离观察，并根据《昆虫真 菌学》(蒲蜇龙，李增智，1996)有关戴氏绿僵菌感染症状、分生孢子及 菌丝的形态特征进行鉴定，确定为戴氏绿僵菌。

实施例二、戴氏绿僵菌纯化菌株生物学特性

2.1材料与方法

2.1.1供试菌株

选择纯化后生长旺盛、生长均匀的一皿作为供试菌株。取菌丝再次 接种到SDAY上，于28℃的恒温光照(12L:12D)培养箱中培养。

2.1.2菌落生长速率和产孢量的测定

将事先培养好的戴氏绿僵菌取一皿用8mm的打孔器打孔，接种于另 外一个培养基上，做3个重复，置于28℃的恒温光照(12L:12D)培养箱 中培养，每天定时测定其直径并记录，直到菌落长满培养基为止。用直 径为8mm的打孔器在培养基相同的位置取菌饼，再接入SDAY培养基表 面，恒温箱中培养7天，每天测量和记录一次菌落直径，以测定菌落生 长情况。

2.2结果

在SDAY培养上于28℃条件下生长良好，表1结果表明，戴氏绿僵菌 MTYJ141025在培养基上生长较快，培养1-2d时，其菌落平均直径增加 速度较低,培养至第5d时，其菌落平均直径增加速度为0.95cm/d,培 养至第7d时，其菌落平均直径增加速度0.75cm/d。由表2可以看出， 从第6天开始产孢量就可以达到1×10⁸孢子/mL,产孢速度快，产孢量较 高。由表3可以看出，24小时孢子的萌发率可以达到81.51％。表明该菌 株的生物学特性较好，生长情况较好。

表1菌落生长速度

表2产孢量测定结果

表3分生孢子萌发率(24小时)

实施例三、戴氏绿僵菌MTYJ141025对蔗根锯天牛的室内毒力测定

3.1、材料与方法

3.1.1供试虫源

蔗根锯天牛[Dorysthenesgranulosus(Thomson)]幼虫，由本实验室，温 度(28±1)℃，湿度(80±5)％，光周期0L﹕24D光照培养箱中，用甘 蔗饲养。获得健康、大小一致的二龄幼虫作为试虫。

3.1.2孢子悬浮液的制备

取长势良好的纯化戴氏绿僵菌用无菌水将分生孢子洗下并过滤配置 成10⁸孢子/ml分生孢子菌悬液，用无菌毛细滴管取滤液一滴滴于血细胞 计数板上，在显微镜下数孢子并记录数据，用含0.5％吐温80的无菌水依 次稀释为10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴五个浓度梯度的孢子悬浮液，以含0.5％ 吐温80的无菌水为空白对照，用于毒力测定。

3.1.3浸渍法

采用浸渍法对蔗根锯天牛2龄幼虫进行处理。即将试虫分别浸泡在 浓度为1.0×10⁸孢子/mL的孢子悬浮液中，轻轻摇动，30s后将试虫 取出晾干，选取活力较高的试虫进行试验。将试虫置于八角瓶 (4.5cm×4.5cm×19.5cm)中，并在八角瓶底铺一层厚1cm灭菌灭菌土， 用甘蔗作为饲料，用小喷壶喷水对幼虫进行保湿，(28±1)℃恒温培养 箱中饲养。以0.05％吐温-80的无菌水处理的蔗根锯天牛2龄幼虫为对照， 每个处理设3个重复，每个重复30头试虫，连续观察10d。每天记录试 虫的死亡数及虫体表面出现绿色绿僵菌孢子的僵虫数量，计算平均死亡 率和僵虫率。数据用DPS14.0软件进行线性回归统计分析。

3.2、结果

对蔗根锯天牛二龄幼虫进行了毒力测定，戴氏绿僵菌MTYJ141025 分生孢子侵染蔗根锯天牛幼虫的生活史过程。实验结果表明：戴氏绿僵 菌MTYJ141025菌株对蔗根锯天牛2龄幼虫具有较高的毒力，接种处理 后第10天时累积校正死亡率达86.50％，毒力回归方程为 Y＝2.25+0.45X(r＝0.98)，其中Y为死亡率机率值，X为孢子浓度的对数值。 LC₅₀(孢子/mL)为1.29×10⁶孢子/mL，LT₅₀＝5.69天。表明戴氏绿僵菌 MTYJ141025具有开发为控制蔗根锯天牛的微生物农药的潜力。

该菌株是我们首次从蔗根锯天牛幼虫上分离纯化获得的戴氏绿僵菌 MTYJ141025，CGMCCNo.10140，该菌株在温度为28℃、相对湿度80％以 上在SDAY培养基上生长快速，产孢量大，孢子萌发率高。其孢子悬浮液 对蔗根锯天牛幼虫致病力较好，可以广泛地用于蔗根锯天牛幼虫的防治。 同时，该菌株培养原料来源广泛，价格便宜，培养方法简单，易大量进 行生产，具有较大的开发应用潜力，用该菌株防治蔗根锯天牛，即为典 型的生物防治，可避免化学农药所带来的抗药及环境污染等问题，将为 蔗根锯天牛绿色防控提供依据。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡 在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应 包含在本发明的保护范围之内。