一种可增强免疫功能的中药复方组合物及其制备方法

摘要

一种可增强免疫功能的中药复方组合物，其主要由多味中药各自的提取液经混合、浓缩后制备得到，包含以下质量分数配比的各组分：龟板25％～36％、鹿角25％～36％、石斛19％～25％、党参5％～8％和枸杞子10％～17％；制备时先将准备好的原料洗净，切制并干燥，按配比称重；将龟板、鹿角分别煎煮，将各自的合并煎煮液过滤后，分别得到浓缩液A、B；将党参、枸杞子合并煎煮，得浓缩液C；将石斛加工制备成石斛提取物；将浓缩液A、B和C与石斛提取物合并，然后继续浓缩、干燥、粉碎，制得中药复方组合物。本发明的产品具有气血兼顾、阴阳并补、且能增强机体免疫功能等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及中药组合物领域，尤其涉及一种增强机体免疫功能的中药复方组合物及其制 备方法。

背景技术

免疫力是人体自身的防御机制，是识别和消灭外来侵入异物的武器，是保护身体不受疾 病困扰或少受疾病侵扰的坚固堡垒。免疫功能过低，机体对外来物质缺乏抵抗力，病毒、细 菌等有害物质就会一涌而至，则会产生各种疾病。

中医认为，“正气存内，邪不可干；邪之所凑，其气必虚”，虚即为体虚，包含了气虚、 血虚、阴虚、阳虚多个方面。而体虚的理论与现代药理学所阐述的免疫功能密切相关。因此， 为防止疾病的发生或治疗疾病，则需根据不同的病证分别采取益气、养血、滋阴、助阳等方 法，来增强机体的免疫功能。

增强机体免疫功能的中药制剂包括单味中药和中药复方。单一的中药制剂只能控制或者 缓解某些症状，很难彻底缓解免疫力低下的复杂身体。而中药复方制剂可以通过君臣佐使的 配伍，产生协同作用，提高疗效，降低毒副作用。但是，目前中药复方制剂主要是针对一种 或两种虚证治疗的处方，如四君子汤为补气的基础方，有增强机体免疫能力，提高巨噬细胞 吞噬能力，主要用于治疗脾胃气虚，阴虚内热，脘腹胀满的患者则不宜使用；四物汤为中医 补血理血的经典方剂，尤其适用于血虚型机体的免疫调节，但该处方中偏温性，阴虚内热的 患者服用易导致上火，甚至加重病情，且肠胃不好的患者服用会引起腹泻；六味地黄丸为补 阴方，对单核巨噬细胞吞噬功能和T、B淋巴细胞增殖均具有一定增强作用，主治肾阴虚或 肝肾阴虚，也能作为气血虚引起的其他症状的辅助治疗药物使用，但因处方的药多为滋阴药， 阳虚患者不宜使用，且脾胃功能不好的患者使用会妨碍消化功能等。

综上，显然有必要制备一种气血阴阳并补，且适用于脾胃虚寒患者、且效果可靠的能够 真正作为免疫增强剂使用的中药组合物。此外，大多数增强机体免疫机能的中药制剂以传统 的散剂、汤剂、丸剂为主，虽然成本低，但是剂型落后，不符合中药现代化要求，效果也大 打折扣，并造成资源浪费。因此，需要大力发展中药组合物的新剂型。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种气血 兼顾、阴阳并补、且能增强机体免疫功能的中药组合物，还相应提供一种操作简单、环保、 经济、高效、无毒的前述中药组合物的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种增强免疫功能的中药组合物的制备 方法，所述中药复方组合物主要由多味中药各自的提取液经混合、浓缩、干燥等步骤后制备 得到，前述多味中药包含以下质量分数配比的各组分：

龟板 25％～36％

鹿角 25％～36％

石斛 19％～25％

党参 5％～8％和

枸杞子 10％～17％。

本发明的增强免疫功能的中药组合物主要基于以下配方原理：

鹿角：行血，消肿，益肾；其水溶性成分有促进小鼠巨噬细胞的吞噬功能和T淋巴细胞 的增殖，改善乳腺癌MA-737小鼠T淋巴细胞的衰竭的功能；其多糖类成分能提高免疫力低 下小鼠的T细胞总数及TH、TS百分率和TH/TS比值，并能协助和促进小鼠淋巴细胞的增殖。

龟板：滋阴、养血、止血，被视为滋阴保健之要药。其水提液对阴虚小鼠体重减轻、自 主活动减少、耐缺氧能力减弱和甲状腺、胸腺、脾脏、肾上腺的萎缩都具有一定的抑制作用。

石斛：滋养阴津，增强体质，补益脾胃，护肝保胆。其多糖类成分可增强腹腔巨噬细胞 对鸡红细胞的吞噬能力；使ICR纯系小鼠脾重、胸腺重量增加，抗体细胞数明显增多，T细 胞和B细胞增殖；促进淋巴细胞有丝分裂的作用；促进淋巴细胞数目的增加，并且促进淋巴 细胞分泌某些化学物质，从而达到增强机体免疫力的目的。

党参：补中益气，健脾益肺。党参提取物能增强网状内皮系统的吞噬功能，从而提高机 体的抗病能力。

枸杞子：滋补肝肾，益精明目。其多糖类成分能增加正常小鼠脾脏总T细胞数及辅助性 T细胞亚群(Th)百分比，提高淋巴细胞转化率，而且可恢复环磷酰胺诱发的免疫功能低下， 使降低的总T细胞数、Th亚群百分比及淋巴细胞转化率恢复至正常或接近正常水平；且对植 物血凝素和佛波酯活化的人扁桃体淋巴细胞增殖反应具有明显的促进作用。

本发明上述的中药复方组合物进行复方配伍时遵循了“君臣佐使”这一重要原则，重用 温肾壮阳、益精补血之鹿角，填精补髓、滋阴养血之龟板，峻补阴阳以生气血精髓，共为君 药；配伍党参补后天脾胃之中气，枸杞子益肝肾、补精血，以增强化生气血之源；石斛滋养 阴津，补益脾胃，均为臣药，以助龟鹿之功，起到协调配合君药的疗效。这五味药合用能够 有效发挥中药间的协同增效作用，起到阴阳并补、气血兼顾、缓和免疫力下降等一系列身体 状况的作用，从而达到气血阴阳同补、固本扶元、祛邪调理的功效。

上述的制备方法中，优选的，所述龟板为龟甲、腹甲或龟甲胶；所述鹿角为马鹿角、梅 花鹿角、鹿茸、鹿角霜、鹿角胶或鹿角托盘；所述石斛为金钗石斛、霍山石斛、铁皮石斛、 马鞭石斛、鼓槌石斛、迭鞘石斛、束花石斛、流苏石斛或美花石斛。

上述的制备方法中，优选的，所述中药组合物为颗粒剂、片剂(包括普通片剂、糖果含 片、咀嚼片等)、胶囊剂(包括软胶囊、硬胶囊)、或口服液。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的中药复方组合物的制备方法，包括以 下步骤：

将准备好的原料龟板、鹿角、石斛、党参、枸杞子洗净，切制并干燥，按相应的质量分 数配比称重；

将所述龟板、鹿角分别投入提取罐中，加水煎煮，将各自的合并煎煮液过滤后，分别得 到浓缩液A和浓缩液B；

将所述党参、枸杞子合并投入提取罐中，加水煎煮，合并煎煮液后过滤，得浓缩液C；

将所述原料石斛加工制备成石斛提取物；

将上述制得的浓缩液A、浓缩液B、浓缩液C与石斛提取物合并，然后继续浓缩、干燥、 粉碎，并根据需要适当加入辅料，即制得所述中药复方组合物。

上述的制备方法中特别针对各原料药的功效及加工特性，对工艺操作步骤进行了改进， 由于龟板、鹿角均为动物药，通过久煎方可有效提取其中的活性物质；而党参、枸杞与石斛 这些植物药则通过常规煎煮即可将其有效成分溶出；而且为了更为完全地提取其中的有效成 分，我们发现鹿角的提取时间相对龟板更长，所以本发明中特别调整了不同组分的煎煮提取 方案，而且这样的方案也更加节能。

上述的制备方法中，优选的，所述步骤中的加水煎煮为2-4次，当煎煮龟板或鹿角时， 每次煎煮的时间为16-34h；当煎煮党参、枸杞子时，每次煎煮的时间为1.0-2.5h。更优选的， 本步骤中，煎煮鹿角时，加水煎煮的次数为3次，每次煎煮的时间分别为26-34h、26-34h、 16-24h；煎煮龟板时，加水煎煮的次数为3次，每次煎煮的时间均为16-24h；煎煮党参和枸 杞子时，加水煎煮的次数为3次，每次煎煮的时间分别为1.5-2.5h、1.5-2.5h、1.0-2.0h。

上述的制备方法中，优选的，所述浓缩液A、浓缩液B、浓缩液C的相对密度均控制在 1.1-1.2。

上述的制备方法中，优选的，所述石斛提取物包括石斛提取液、石斛浆汁或石斛超微粉。

更优选的，所述石斛提取液的制备包括以下步骤：将所述石斛加水煎煮2次，每次1.5-2h， 合并煎煮液，过滤，滤液浓缩至相对密度为1.1-1.2，得到所述石斛提取液。

更优选的，所述石斛浆汁的制备包括以下步骤：将所述石斛软化后放入打浆机中打浆， 再置于胶体磨中细磨至渣均匀一致，过80目筛滤机，得到所述石斛浆汁。

更优选的，所述石斛超微粉的制备包括以下步骤：将所述石斛在50℃-60℃下干燥处理， 使其含水量为2％-3％，置于超微粉碎机中粉碎10～30min，得到所述石斛超微粉。

以上的石斛提取物更优选石斛超微粉，因为该方法不仅简便易行，且能增大有效成分、 甚至是脂溶性成分(如生物碱类、黄酮类等有效成分)的溶出率，提高生物利用度，增强药 物疗效。

上述的制备方法中，优选的，所述步骤中继续浓缩至提取液的相对密度为1.3～1.4；所述 干燥为真空干燥，温度为50～70℃。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1.本发明采用鹿角、龟板、党参、枸杞子、石斛进行配伍，这些成分均含有丰富的多糖 类、苷类化合物，此类成分均具有增强免疫、抗氧化、抗衰老等作用，能够激活不同层面的 免疫系统发挥药效。

2.本发明为龟板、鹿角、石斛、党参、枸杞子共同制得的具有增强机体免疫功能的中药 组合物。我们通过血清药理学实验方法对本发明的中药组合物和配方中的5味单味药材提取 物的免疫调节作用进行了比较研究，研究发现本发明的中药组合物的免疫增强作用最好，优 于单味中药提取物，这可能与5味中药配伍具有协同作用或配伍后生成新的化合物发挥免疫 增强作用有关。

3.本发明的中药组合物具有滋补脾胃、阴阳并补、气血兼顾、固本扶元、祛邪调理的作 用，且增强免疫力的功能明显，安全性高。

4.本发明以中医药理论为基础，合理地采用现代化提取分离技术优化制剂工艺，将具有 免疫增强功能的重要组方制备成新型的多种复方制剂，提高了药物活性；且本发明的制备方 法操作简单、环保、经济、高效、无毒，具有广阔的应用前景。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下文将结合较佳的实施例对本发明作更全面、细致地描述，但本 发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。 本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范 围。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购 买得到或者可通过现有方法制备得到。

实施例1

一种本发明的增强免疫功能的中药组合物的制备方法，包括以下步骤：将马鹿角、龟甲、 党参、枸杞子和金钗石斛洗净、切制并干燥，取500g鹿角净料投入提取罐中，加水提取3 次，提取时间分别为：30h、30h、20h，合并3次提取液，过滤，滤液浓缩至相对密度为1.1， 得浓缩液B；取600g龟甲净料投入提取罐中，加水提取3次，每次24h，合并三次提取液， 过滤，滤液浓缩至相对密度为1.1，得浓缩液A；取114g党参、226g枸杞子净药材，加水 煎煮3次，煎煮时间分别为2h、2h、1.5h，合并三次提取液，过滤，滤液浓缩至相对密度 为1.1，得浓缩液C；取480g石斛加水煎煮两次，每次1.5h，合并煎液，过滤，滤液浓缩至 相对密度为1.1，得石斛提取物浓缩液；合并上述各浓缩液，混匀，继续浓缩至相对密度为 1.3稠膏，50℃下干燥，粉碎成细粉，即为本发明的提取干药粉；或取上述浓缩液合并，醇沉 24h，过滤，滤液即为本发明的提取药液。

实施例2：

一种本发明的增强免疫功能的中药组合物的制备方法，包括以下步骤：将梅花鹿角、龟 甲、党参、枸杞子和霍山石斛洗净、切制并干燥，取600g梅花鹿角净料投入提取罐中，加 水提取3次，提取时间分别为：26h、26h、16h，合并3次提取液，过滤，滤液浓缩至相对 密度为1.2，得浓缩液B；取700g龟甲净料投入提取罐中，加水提取3次，每次16h，合并 三次提取液，过滤，滤液浓缩至相对密度为1.2，得浓缩液A；取160g党参、210g枸杞子 净药材，加水煎煮3次，煎煮时间分别为1.5h、1.5h、1.0h，合并三次提取液，过滤，滤液 浓缩至相对密度为1.2，得浓缩液C；取420g石斛加水煎煮两次，每次1.5h，合并煎液，过 滤，滤液浓缩至相对密度为1.2，得石斛提取物浓缩液；合并上述各浓缩液，混匀，继续浓缩 至相对密度为1.3稠膏，70℃下干燥，粉碎成细粉，即为本发明的提取干药粉；或取上述浓 缩液合并，醇沉24h，过滤，滤液即为本发明的提取药液。

实施例3：

一种本发明的增强免疫功能的中药组合物的制备方法，包括以下步骤：将鹿茸、龟甲、 党参、枸杞子和马鞭石斛洗净、切制并干燥，取650g鹿茸净料投入提取罐中，加水提取3 次，提取时间分别为：34h、34h、24h，合并3次提取液，过滤，滤液浓缩至相对密度为1.2， 得浓缩液B；取500g龟甲净料投入提取罐中，加水提取3次，每次20h，合并三次提取液， 过滤，滤液浓缩至相对密度为1.2，得浓缩液A；取100g党参、300g枸杞子净药材，加水 煎煮3次，煎煮时间分别为2.5h、2.5h、2.0h，合并三次提取液，过滤，滤液浓缩至相对密 度为1.2，得浓缩液C；取400g石斛加水煎煮两次，每次2.0h，合并煎液，过滤，滤液浓缩 至相对密度为1.2，得石斛提取物浓缩液；合并上述各浓缩液，混匀，继续浓缩至相对密度为 1.3稠膏，60℃下干燥，粉碎成细粉，即为本发明的提取干药粉；或取上述浓缩液合并，醇沉 24h，过滤，滤液即为本发明的提取药液。

实施例4：

一种本发明的增强免疫功能的中药组合物的制备方法，包括以下步骤：将鹿角托盘、腹 甲、党参、枸杞子和铁皮石斛洗净、切制并干燥，取700g鹿角托盘净料投入提取罐中，加 水提取3次，提取时间分别为：30h、30h、20h，合并3次提取液，过滤，滤液浓缩至相对 密度为1.1，得浓缩液B；取680g腹甲净料投入提取罐中，加水提取3次，每次24h，合并 三次提取液，过滤，滤液浓缩至相对密度为1.1，得浓缩液A；取126g党参、226g枸杞子净 药材，加水煎煮3次，煎煮时间分别为2h、2h、1.5h，合并三次提取液，过滤，滤液浓缩 至相对密度为1.1，得浓缩液C；取460g石斛加水煎煮两次，每次1.5h，合并煎液，过滤， 滤液浓缩至相对密度为1.1，得石斛提取物浓缩液；合并上述各浓缩液，混匀，继续浓缩至相 对密度为1.3稠膏，70℃下干燥，粉碎成细粉，即为本发明的提取干药粉；或取上述浓缩液 合并，醇沉24h，过滤，滤液即为本发明的提取药液。

实施例5：

一种本发明的增强免疫功能的中药组合物的制备方法，包括以下步骤：将鹿角霜、龟甲、 党参、枸杞子和迭鞘石斛洗净、切制并干燥，取600g鹿角霜净料投入提取罐中，加水提取3 次，每次煎煮的时间分别为：30h、30h、20h，合并3次提取液，过滤，滤液浓缩至相对密 度为1.1，得浓缩液B；取600g龟甲净料投入提取罐中，加水提取3次，每次24h，合并三 次提取液，过滤，滤液浓缩至相对密度为1.1，得浓缩液A；取114g党参、226g枸杞子净药 材，加水煎煮3次，煎煮时间分别为2h、2h、1.5h，合并三次提取液，过滤，滤液浓缩至 相对密度为1.1，得浓缩液C；取400g石斛在60℃干燥处理使含水量为2％，置超微粉碎机 中粉碎30min，得石斛超微粉；合并上述各浓缩液，混匀，继续浓缩至相对密度为1.3稠膏， 加入石斛超微粉，70℃下干燥，粉碎成细粉，即为本发明的提取干药粉；或取上述浓缩液合 并，醇沉24h，过滤，滤液即为本发明的提取药液。

实施例6：

一种本发明的增强免疫功能的中药组合物的制备方法，包括以下步骤：将马鹿角、龟板、 党参、枸杞子和束花石斛洗净、切制并干燥，取600g鹿角净料投入提取罐中，加水提取3 次，提取时间分别为：30h、30h、20h，合并3次提取液，过滤，滤液浓缩至相对密度为1.2， 得浓缩液B；取600g龟板净料投入提取罐中，加水提取3次，每次24h，合并三次提取液， 过滤，滤液浓缩至相对密度为1.2，得浓缩液A；取114g党参、226g枸杞子净药材，加水煎 煮3次，煎煮时间分别为2h、2h、1.5h，合并三次提取液，过滤，滤液浓缩至相对密度为 1.2，得浓缩液C；取400g石斛鲜条，软化后放入打浆机中打浆，再置胶体磨中细磨至渣均 匀一致，过80目筛滤机，滤液与上述各浓缩液合并，混匀，继续浓缩至相对密度为1.3稠膏， 60℃下干燥，粉碎成细粉，即为本发明的提取干药粉；或取上述浓缩液合并，醇沉24h，过 滤，滤液即为本发明的提取药液。

实施例7：

将上述各实施例中任何一提取干药粉中加入140g淀粉，混匀，制粒，过筛，装1000粒 胶囊，即为本发明的增强免疫功能的中药组合物的胶囊剂。

实施例8：

将上述各实施例中任何一提取干药粉中加入乳糖100g，糊精500g，制粒，整粒，过筛， 制成1000g颗粒，即为本发明的增强免疫功能的中药组合物的颗粒剂。

实施例9：

将上述各实施例中任何一提取干药粉中加入淀粉510g、糊精102g、微粉硅胶34g，以 90％的乙醇为润湿剂制软材，制粒，干燥，整粒，加羧甲基纤维素钠50g，硬脂酸镁4g，总 混，压片，制成0.3g/片规格的片剂，即为本发明的增强免疫功能的中药组合物的片剂。

实施例10：

将上述各实施例中任何一提取干药液中加入0.3％苯甲酸钠，400ml蒸馏水，灌装，灭菌， 制成1000ml口服液，即为本发明的增强免疫功能的中药组合物的口服液。

增强免疫功能的实验研究

1)对小鼠免疫器官脏器指数的影响

取上述实施例1～6中任何一提取药液，加水稀释一倍，经胃灌药给小鼠，每日一次，连 续21d，处死动物，立即解剖并分离脾脏、胸腺，用滤纸吸去表面水分后，电子分析天平称 量湿重，按下列公式计算免疫器官指数：脾重指数＝脾质量(mg)/体质量×100％，胸腺重指 数＝胸腺质量(mg)/体质量×100％，与对照组比较其差异性。试验数据采用SPSS 12.0软件 进行分析，结果如表1所示：

表1对小鼠免疫器官脏器指数的影响

注：与空白对照比较，有显著性差异(P<0.05)

由表1可知，灌胃给本发明的提取药液0.2ml/10g.d，21d后，与生理盐水组比较，本发 明的提取药液对小鼠的免疫器官脾脏、胸腺的生长发育和免疫活性细胞的增值有明显促进作 用。

2)对小鼠单核巨噬细胞吞噬功能的影响

取上述实施例1～6中任何一提取药液，加水稀释一倍，经胃灌药给小鼠，每日一次，连 续21d，每次给药后1h，小鼠尾静脉注射25％印度墨水20ml/kg，于注射后1min、5min 分别从小鼠的眼眶静脉丛中采血20μl，溶于3ml的0.1％NaCO₃溶液中摇匀，静置20min 后于紫外分光光度计上680nm下测定OD值，以0.1％NaCO₃溶液为空白对照；将小鼠脱颈 椎处死后取小鼠肝、脾，用滤纸吸干血后称重，按下述计算公式计算单位时间的廓清指数和 吞噬指数(α)：廓清指数＝(lgOD₁－lgOD₅)/(t₅－t₁)，吞噬指数(α)＝K×体重/(肝重+脾重)， 统计药物组与对照组的K、α值，并进行t值测验。试验数据采用SPSS 12.0软件进行分析， 结果如表2所示：

表2对小鼠单核巨噬细胞吞噬功能的影响

注：与空白对照比较，有显著性差异(P<0.05)

由表2可知，灌胃给本发明提取药液0.2ml/10g.d，21d后，小鼠的廓清指数和吞噬指数 (α)相对于对照组，差异性显著(P<0.05)，即本发明的提取药液能显著的提高单核－巨噬 细胞的吞噬能力，从而增强机体免疫力。

比较中药复方组合物与方中的5味单味药材提取物的免疫调节作用

(1)提取物的制备

鹿角提取物的制备：取500g鹿角净料投入提取罐中，加水提取3次，提取时间分别为： 30h、30h、20h，合并3次提取液，过滤，滤液浓缩至相对密度为1.1，即得鹿角提取物。

龟板提取物的制备：取500g龟板净料投入提取罐中，加水提取3次，每次24h，合并 三次提取液，过滤，滤液浓缩至相对密度为1.1，即得龟板提取物。

党参提取物的制备：取114g党参净药材，加水煎煮3次，煎煮时间分别为2h、2h、 1.5h，合并三次提取液，过滤，滤液浓缩至相对密度为1.1，即得党参提取物。

枸杞提取物的制备：取226g枸杞子净药材，加水煎煮3次，煎煮时间分别为2h、2h、 1.5h，合并三次提取液，过滤，滤液浓缩至相对密度为1.1，即得枸杞提取物。

石斛提取物的制备：取500g石斛加水煎煮两次，每次90min，合并煎液，过滤，滤液 浓缩至相对密度为1.1，即得石斛提取物。

中药复方组合物的制备：按上述提取方法，合并5味药的提取液，混匀，浓缩至相对密 度为1.1，即得中药复方组合物。

(2)含药血清的制备

小鼠随机分为6组，每组10只，实验组分别灌服中药复方组合物、龟甲提取物、鹿角提 取物、党参提取物、枸杞提取物、石斛提取物，对照组灌服生理盐水，每天灌1次(0.5ml/ 只/次)，连续7天，小鼠于末次灌1h后摘除眼球取血，无菌分离血清，同组血清混合后经 56℃、30min灭活处理，再用0.45um微孔滤膜过滤除菌，置-20℃保存备用。

(3)试验分组

含药血清组分为7组，即复方组合物血清组、龟甲提取物血清组、鹿角提取物血清组、 党参提取物血清组、枸杞提取物血清组、石斛提取物血清组、空白血清对照组。

(4)淋巴细胞增殖试验

颈椎脱臼处死小鼠，置75％酒精中浸泡2～3min，在经紫外灯照射过的超净工作台上无 菌取出小鼠脾脏。剔除脾脏表面脂肪及结缔组织，用含抗生素的Hanks液洗净表面血迹。将 脾脏剪成小块，继续用含抗生素的Hanks液冲洗至清亮。将脾脏小块置于200目滤网上，用 灭菌注射器针芯轻轻将其捻碎，同时用RPMI-1640液冲洗，收集含脾细胞的1640冲洗液， 1500r/min离心5min。去上清后加入预冷的0.83％Tris-NH₄Cl裂解红细胞1min，重复裂解 一次，再用1640液洗2～3次，弃上清，混匀。经0.1％台盼蓝染色，检查死细胞数少于5％， 再用含10％小牛血清的RPMI-1640完全培养液(含100U/ml青霉素，100U/ml链霉素)将脾 细胞稀释为6×10⁶个/ml的细胞悬液。于96孔平底培养板中每孔加入100ul细胞悬液，试 验组加待测药物或含药血清100ul，对照组加培养液或灌服生理盐水后制备的血清100ul， 每孔做3个重复孔。将培养板放入37℃、5％CO₂的培养箱中培养72h，于终止培养前4h， 每孔加入10mg/ml MTT溶液10ul，继续培养4h，培养结束后仔细弃去上清，每孔加酸化 异丙醇100ul，充分振荡吹打后静置20min，用检测波长570nm参考波长630nm比色分 析，用OD值表示结果。

(5)试验结果与分析

采用SPSS16.0统计学软件处理，组间差异比较采用单因素方差(one way ANOVA)分析。 结果如表3所示：

表3：7个含药血清组对小鼠淋巴细胞增殖的影响

注:表内数字右侧*表示组间比较差异显著(P<0.05)，**表示组间比较差极异显著 (P<0.01)。

上述实验方法是给予动物灌服中药或复方制剂后，在一定时间内采血，分离血清进行体 外药理实验的方法，其克服了以往中药体外实验的不利因素，能较客观和真实地阐明中药的 药效和作用机制，从而有助于研究中药复方配伍规律和促进中药复方药代动力学研究的深入 开展。

由表3的结果显示：7个药物血清组中，党参枸杞提取物药物血清对小鼠淋巴细胞增殖 的促进作用较弱，与对照组没有差异，其它5个药物血清组对小鼠淋巴细胞的增殖均具有不 同程度的增强作用，均与对照组产生极显著性差异；7个药物血清组对小鼠淋巴细胞的增殖 的促进作用强弱顺序依次为：中药复方组合物血清组>龟甲提取物血清组>鹿角提取物血清组> 党参提取物血清组>石斛提取物血清组>枸杞提取物血清组>空白血清对照组；与5个含单味药 材提取物的药物血清组比较，含中药复方组合物的药物血清组能显著促进小鼠淋巴细胞增殖， 显著强于其它药物血清组，且均具有显著性差异(P<0.01)。

(6)结论

本研究结果表明，本发明中药复方组合物的药物血清对小鼠淋巴细胞体外增殖反应具有 显著的增强作用，且其效果分别优于单味药材提取物的药物血清，这可能与5味中药配伍具 有协同作用或配伍后生成新的化合物发挥免疫增强作用有关。