慢性心力衰竭相关的血清miRNA及其应用

摘要

慢性心力衰竭相关的血清miRNA及其应用。本发明提供一类外周血miRNAs在慢性心力衰竭的作为生物标志物风险评估/诊断和预后中的用途。其中，hsa-miR-4491、hsa-miR-1285-3p、hsa-miR-665、hsa-miR-660-3p、hsa-miR-206、hsa-miR-1268b、hsa-miR-130a-3p和hsa-miR-330-3p在慢性心力衰竭患者外周血中差异性表达；证明外周血hsa-miR-665等能特异性诊断慢性心力衰竭，并且其表达水平与射血分数呈相关性，具有评估预后的作用。从而，通过检测上述miRNAs的表达水平可用来预测和协助诊断已经存在的慢性心力衰竭或评估慢性心力衰竭的预后。

说明书

技术领域

本发明涉及多种内源性的非编码小RNA的新医药用途，更具体地说涉及8种microRNAs在慢性心力衰竭疾病的诊断和预后评估中的用途，属于心血管疾病的诊断、预防和治疗领域。

背景技术

慢性心力衰竭是不同的心血管疾病发展到终末阶段的临床综合征，主要病理生理特点为心室充盈和射血能力受损，最后导致心室泵血功能低下，其预后不良，死亡率高，是威胁人类健康和导致医疗负担增加的最主要病因之一，对于人口老龄化日益加重的中国来说尤为重要。到目前为止，以利尿剂、ACEI和β受体阻滞剂为基础的治疗药物组合对部分患者无效或效果不理想，新的治疗措施亟待发掘；另一方面，慢性心力衰竭的危险因素并未完全阐明，因此需要寻找新的危险因素和采用更加有效的风险评估方法。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一类新发现的在多种生物进程中具有重要调控作用的非编码RNA，是来源于内源性发夹结构转录本的长度大约为22个核苷酸的单链RNAs。通常miRNA作为引导分子，与靶mRNA的3’UTR碱基互补结合，介导基因转录后调控。大多数情况下，miRNA与靶mRNA结合后将抑制蛋白质翻译并激活核酸外切酶降解mRNA，若miRNA与靶mRNA高度互补结合则可激活核酸内切酶活性。在复杂的病理生理过程中，miRNA或miRNAs簇协同参与多级调控是miRNA重要的生物学特征之一；也是针对miRNA的应用治疗的理论基础之一。与传统的单靶点药物治疗相比，miRNA治疗可以在单个核苷酸分子靶点治疗的情况下，从多个水平调控疾病病理生理状态，达到更有效的治疗效果。

已有研究表明miRNAs可被细胞分泌至外周血循环，并稳定存在，可作为各类疾病的新的诊断标志物。且RNA干扰技术作为具有突破性临床应用前景的生物技术，从出现开始的短短数年间就有多个产品进入临床试验，获得了巨大的成功。但是否存在一类miRNAs在慢性心力衰竭诊断和预后评估中具有生物标志物作用，通过检测这类miRNA能为慢性心力衰竭诊断和预后提供新的策略仍是对该领域科研人员的挑战。有研究者对慢性心力衰 竭患者外周血miRNAs表达谱进行过筛查(Circulation.2014；129(9):1009-21；Proc Natl Acad Sci U S A.2014；111(30):11151-6)，也有研究者对慢性心力衰竭患者治疗前后外周血miRNAs表达谱进行过检测(Eur J Heart Fail.2013；15(11):1277-88)，但没有对相同患者心肌组织和外周血的miRNAs同时进行检测和比较，且缺乏相应的流行病学随访研究。本发明中，申请人原创性的对相同患者心肌组织和外周血的miRNAs同时进行检测和比较，并对部分患者的病情发展进行了流行病学随访研究。确定了外周血miRNAs表达谱作为慢性心力衰竭疾病诊断和预后生物标志物中的作用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有理论和技术的不足，确定在慢性心力衰竭中起诊断和预后生物标志物作用的外周血miRNAs。

本发明人通过大量的实验发现，不仅获得了可以作为生物标志物用于诊断慢性心力衰竭患者外周血miRNAs表达谱，还获得了慢性心力衰竭患者心肌miRNAs表达谱。同时，本发明人发现同一慢性心力衰竭患者外周血miRNAs表达谱与其心肌中的miRNAs表达谱并不完全一致，提示单纯比较正常人和患者外周血miRNAs将得到非特异性生物标志物。另一方面，本发明人发现部分外周血miRNAs，例如hsa-miR-665或hsa-miR-660-3p，与慢性心力衰竭患者心功能呈显著相关性，不仅可用于诊断，还可作为生物标志物用于提示预后。

具体的，本发明提供一种可用于诊断慢性心力衰竭患者的miRNAs生物标志物。

优选的，所述外周血miRNAs生物标志物为hsa-miR-4491、hsa-miR-1285-3p、hsa-miR-665、hsa-miR-660-3p、hsa-miR-206、hsa-miR-1268b、hsa-miR-130a-3p和/或hsa-miR-330-3p，其序列结构分别如SEQ ID No.1-8所示。

本发明还提供一种可用于评估慢性心力衰竭预后的外周血miRNAs生物标志物。

优选的，所述miRNAs生物标志物为miR-1285-3p、hsa-miR-665和/或hsa-miR-660-3p，其序列结构如SEQ ID No.2、3和4所示。

本发明还提供一种上述miRNAs生物标志物用于评估慢性心力衰竭预后的用途。

本发明还提供一种用于检测上述miRNAs序列的试剂，其中，所述序列包括SEQ ID No.1，2，3，4，5，6，7和/或8。

优选的，所述miRNAs序列为SEQ ID No.2、3和/或4。

优选的，所述的试剂为所述miRNAs序列的逆转录引物和扩增引物。

更优选的，所述引物根据下列引物设计原则获得：1)基于茎凸环结构设计的的特异性逆转录引物与miRNA 3’端序列结合，在逆转录酶作用下进行针对特定miRNA的特异性逆转录反应；2)基于逆转录引物序列设计的特异性正向PCR引物、通用反向引物。

本发明还提供一种上述试剂在制备诊断或者评估慢性心力衰竭患者预后的试剂盒中的用途。

优选的，所述的慢性心力衰竭包括先天性心脏病、冠心病、急性心肌梗死、风心病、高血压、心律失常、各种病因导致的心肌炎、心肌病等病因导致的慢性心力衰竭。

本发明还提供一种诊断或者评估慢性心力衰竭患者预后的试剂盒，其特征在于，其中，所述试剂盒包括上述任一所述的试剂。

优选的，所述的慢性心力衰竭包括先天性心脏病、冠心病、急性心肌梗死、风心病、高血压、心律失常、各种病因导致的心肌炎、心肌病等病因导致的慢性心力衰竭。

附图说明

图1.慢性心力衰竭患者外周血miRNAs芯片表达谱及心肌miRNAs芯片表达谱分析；图1A为心肌组织miRNAs芯片表达谱散点图；图1B为外周血miRNAs芯片表达谱散点图；图1C为心肌组织miRNAs芯片表达谱火山图；图1D为外周血miRNAs芯片表达谱火山图。

图2.外周血miRNAs芯片表达谱与心肌组织miRNAs芯片表达谱比较结果；图2A为心力衰竭时心肌组织芯片中均表达升高的miRNAs的变化值，及其在外周血芯片中的表达改变情况；图2B为心力衰竭时心肌组织芯片中均表达下降的miRNAs的变化值，及其在外周血芯片中的表达改变情况。

图3.采用Real-time PCR法验证芯片筛查结果，其中为八种微小RNA(microRNA,miRNA)在慢性心力衰竭和正常对照人群血浆中的相对水平(*表示与对照组相比，p<0.05；**表示与对照组相比，p<0.01)。

图4. 8种miRNAs诊断慢性心力衰竭的灵敏度。图4A为ROC值，血浆miRNAs诊断慢性心力衰竭的灵敏度；图4B为与超声检测心功能比较的结果，血浆miRNAs含量与心脏超声射血分数相关性。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为 清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1.慢性心力衰竭患者外周血及心肌组织miRNAs筛查结果

1.收集10例慢性心力衰竭(取自2007-2014年在心血管内科住院患者，每个病例均由两个或以上临床医师确诊分类)及10例正常对照者外周血样本。取材后，室温3,500rpm离心6min，取上层血浆，保存于-80℃冰箱。每0.25ml外周血血浆中加入1ml TRIZOL LS(Invitrogen公司)，提取RNA，RNasey Mini Kit(Qiagen)处理样品。使用ND-1000检测RNA质量。miRCURY^TM Array Power labeling kit(Exqion)标记后，在杂交工作站进行杂交实验。Axon GenePix 4000B microarray scanner扫描获得芯片图像。GenePix pro V6.0软件分析获得数据，利用microarray技术高通量筛选出在中差异性表达的miRNA谱。该芯片检测miRNAs共3100种，筛选出差异性表达miRNAs 599个，其中347个miRNAs在心力衰竭患者外周血中表达升高，252个miRNAs在心力衰竭患者外周血中表达下降。

2.收集1中慢性心力衰竭患者(取自2007-2014年在心血管内科住院患者，每个病例均由两个或以上临床医师确诊分类)的心肌组织，及10例正常对照者外周血样本。取材后，室温3,500rpm离心6min，取上层血浆，保存于-80℃冰箱。每0.25ml外周血血浆中加入1ml TRIZOL(Invitrogen公司)，提取RNA，RNasey Mini Kit(Qiagen)处理样品。使用ND-1000检测RNA质量。miRCURY^TM Array Power labeling kit(Exqion)标记后，在杂交工作站进行杂交实验。Axon GenePix 4000B microarray scanner扫描获得芯片图像。GenePix pro V6.0软件分析获得数据，利用microarray技术高通量筛选出在中差异性表达的miRNA谱。该芯片检测miRNAs共3100种，筛选出差异性表达miRNAs 74个，其中51个miRNAs在心力衰竭患者心肌组织中表达升高，23个miRNAs在心力衰竭患者心肌组织中表达下降。

结果表明慢性心力衰竭时心肌组织中miRNAs表达发生改变。

实施例2.慢性心力衰竭患者外周血miRNAs芯片表达谱及心肌miRNAs芯片表达谱分析

采用生物信息学分析方法对获得的芯片数据进行分析和处理。

1.散点图反应了芯片间或者组间的重复性，重复性越好越靠近对角线。另外使用Pearson相关系数衡量重复性，相关系数越接近1重复性越好。图1A和1B结果表明：芯片完成质量可靠，重复性好。

2.组间比较的情况见图1C和1D。以-log(Pvalue)为纵坐标，log2(Fold change)为横坐标对每一个miRNA作图，可以直观地看到显著性差异的miRNAs(灰色点代表通过Fold change和P-value筛选的miRNAs)。图1C和1D结果表明：miRNAs可作为一类慢性心力衰竭诊断的候选生物标志物。

实施例3.外周血miRNAs表达谱与心肌组织miRNAs表达谱比较结果

将外周血芯片和心肌组织芯片筛查获得的差异性表达的作为慢性心力衰竭诊断的候选生物标志物的所有miRNAs的变化趋势进行分类。结果表明：在心肌组织中表达出现显著性差异(包括升高或者降低)的有74个miRNAs，而在外周血中表达出现显著性差异(包括升高或者降低)的有599个miRNAs，有25个miRNAs在两种芯片中的表达均发生改变，其中表达均升高的有6种(图2A)(hsa-miR-4491、hsa-miR-1285-3p、hsa-miR-665、hsa-miR-660-3p、hsa-miR-206和hsa-miR-1268b)，表达均下降的有2种(图2B)(hsa-miR-130a-3p和hsa-miR-330-3p)，提示这8种miRNAs均可作为候选生物学标志物用于慢性心力衰竭的诊断。由于循环miRNAs与组织miRNAs之间的表达分布受多种因素影响，包括：组织生成、组织降解、组织摄取和组织分泌等，因此可能出现循环miRNAs和组织miRNAs表达改变不一致的情况(Oncotarget.2015 Mar 10.[Epub ahead of print]，PMID:25860935)。并且由于慢性心力衰竭是由多种原因导致的全身多器官受累的疾病，其他脏器功能也不同程度发生变化，循环miRNAs表达量不仅与心肌miRNAs表达量密切相关，其他脏器功能也可能影响外周血miRNAs的表达(Clin Chem.2013Dec；59(12):1742-52；J Hum Hypertens.2014 May；28(5):288-91)。因此只有这8种miRNAs是最可能和慢性心力衰竭特异性相关的。

实施例4.芯片结果Real-time PCR验证

在第二个独立人群中，另外分别收集200例慢性心力衰竭患者和200例正常对照人群外周血，按照上述方式提取RNA。

采用广州锐博公司miRNA检测试剂盒对上述芯片初筛的在两种芯片中的表达均发生改变的8种miRNAs的表达在第二个独立人群中进行real-time PCR检测：

miRNAs逆转录：

逆转录引物(RT Primer Mix)配置：

miRNA RT Primer 1μl

U6RT Primer 1μl

RNase free H₂O 78μl

逆转录反应体系：

RNA template 2μg

RT Primer Mix 4μl

RNase free H₂O up to 19μl

以上体系混匀后，瞬时离心，70℃孵育10min后，冰育2min，再加入以下试剂：

2×TS reaction buffer 25μl

TS enzyme 2.5μl

RNase free H₂O 3.5μl

逆转录反应程序：

42℃60min，70℃10min；停止后4℃备用，产物保存于-20℃。

miRNAs real-time PCR：

反应体系：2×SYBR Green Mix 9μl

RT product 2μl

miRNA Forward Primer 2μl

miRNA Reverse Primer 2μl

RNase-free H₂O 5μl

反应程序： 

95℃30sec--(95℃10sec--60℃20sec--70℃1sec)×40 cycles--Melting Curve 

结果显示：其中8种miRNAs，即miR-4491、miR-1285-3p、miR-665、miR-660-3p、miR-206、miR-1268b、miR-130a-3p和miR-330-3p表达的结果与芯片检测结果一致，两个慢性心力衰竭患者人群的外周血中miRNAs变化趋势结果相同(图3)。表明8种miRNAs可作为一类慢性心力衰竭诊断的候选生物标志物，real-time PCR检测方法结果可靠。

实施例5.差异性表达miRNAs诊断慢性心力衰竭的灵敏度

收集200例慢性心力衰竭患者(取自2007-2014年武汉市医院住院患者，每个病例均由两个或以上临床医师确诊分类)和200例正常对照人群外周血。按照前述方法提取RNA，并检测实施例4中筛选出的8种miRNAs的表达，并进行ROC分析。

结果显示：患者外周血中miR-4491、miR-1285-3p、miR-665、miR-660-3p、miR-206 和miR-1268b分别升高至对照组人群的约50倍、40倍、100倍、800倍、45倍和50倍，而miR-130a-3p和miR-330-3p分别下降至对照组人群的50％左右(图3)。且miR-4491、miR-1285-3p、miR-665、miR-660-3p、miR-206和miR-1268b对诊断慢性心力衰竭具有高灵敏度(AUC>0.9)(图4A)，其中心肌高丰度的miR-1285-3p，miR-665和miR-660-3p的表达量与射血分数显著相关(P<0.05)(图4B)。

目前，心脏射血分数是临床上最常用的用于评估心脏功能指标，心脏射血分数越低提示患者预后越差。表明miR-1285-3p，miR-665和miR-660-3p可作为一种诊断和评估慢性心力衰竭预后的生物标志物。

实施例6.制备检测慢性心力衰竭风险评估的试剂盒

试剂盒成分：检测试剂盒包括用于扩增8种miRNAs(miR-4491、miR-1285-3p、miR-665、miR-660-3p、miR-206、miR-1268b、miR-130a-3p和miR-330-3p)的特异性逆转录引物及real-time PCR引物对各一套；用于扩增对照RNA(U6)的特异性逆转录引物及real-time PCR引物对一套及相关试剂，成分和含量如下(100次)，保存于-20度。所述引物根据下列引物设计原则获得：1)基于茎凸环结构设计的的特异性逆转录引物与miRNA 3’端序列结合，在逆转录酶作用下进行针对特定miRNA的特异性逆转录反应；2)基于逆转录引物序列设计的特异性正向PCR引物、通用反向引物。

以上试剂均由各来源公司提供，已经商品化。具体检测方法及相关反应参数参照实施例1。

序列表：

miR-4491、miR-1285-3p、miR-665、miR-660-3p、miR-206、miR-1268b、miR-130a-3p和miR-330-3p

hsa-miR-4491核酸序列： 

Sequence ID No.1:5`AAUGUGGACUGGUGUGACCAAA 3`

hsa-miR-1285-3p核酸序列：

Sequence ID No.2:5`UCUGGGCAACAAAGUGAGACCU 3`

hsa-miR-665核酸序列： 

Sequence ID No.3:5`ACCAGGAGGCUGAGGCCCCU 3`

hsa-miR-660-3p核酸序列：

Sequence ID No.4:5`ACCUCCUGUGUGCAUGGAUUA 3`

hsa-miR-206核酸序列： 

Sequence ID No.5:5`UGGAAUGUAAGGAAGUGUGUGG 3`

hsa-miR-1268b核酸序列： 

Sequence ID No.65`CGGGCGUGGUGGUGGGGGUG 3`

hsa-miR-130a-3p核酸序列：

Sequence ID No.7:5`CAGUGCAAUGUUAAAAGGGCAU 3`

hsa-miR-330-3p核酸序列：

Sequence ID No.8:5`GCAAAGCACACGGCCUGCAGAGA 3` 。