一种转几丁质酶基因的粉红螺旋聚孢霉工程菌株及其应用

摘要

本发明公开了一种转几丁质酶基因的粉红螺旋聚孢霉工程菌株，命名为Cr-chi32，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的保藏登记号为CGMCC No.10027。该工程菌株Cr-chi32增强了粉红螺旋聚孢霉的抗病性能，提高了防效稳定性，同时能够有效应用于植物病害的防治，尤其是可以用来防治农作物菌核病、灰霉病，同时对枯萎病、根腐病等多种植物真菌病害也有较好的防治作用。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程和生物防治技术领域，特别是一种转几丁质酶基因的粉红螺旋聚孢霉工程菌株及其在植物病害防治中的应用。

背景技术

粉红螺旋聚孢霉Clonostachys rosea，原名：粉红粘帚霉，Gliocladium roseum，是一类重要的植病生防拮抗微生物。它可以寄生核盘菌、丝核菌、镰刀菌、灰霉病菌等多种植物病原真菌，通过产生抑菌物质、竞争、诱导植物抗性等多种作用方式抑制真菌病害。但现有技术中缺乏高致病力菌株、缺少优良菌株规模化培养关键技术、产品稳定性不足，从而制约了该类生防制剂在植物病害防治领域的广泛应用。

菌寄生菌在寄生过程中分泌一系列细胞壁降解酶，如几丁质酶、葡聚糖酶、纤维素酶和蛋白酶等。其中几丁质酶能降解真菌细胞壁的主要成分几丁质，从而破坏真菌的细胞壁，使病原菌细胞生长受阻，另外还可以破坏病原菌菌丝尖端新合成的几丁质，从而使菌丝停止生长、缢缩畸形甚至消解等。现有技术中几丁质酶基因已在植物病害防治中得到应用，但利用来源于粘帚霉的几丁质酶基因转化菌寄生菌至今还未见报导。

粉红螺旋聚孢霉HLD-1是一株高效菌寄生菌，中国微生物菌种保藏中心保藏编号为CGMCC No.1037，该菌对严重危害农作物生产的核盘菌、灰霉病菌、立枯丝核菌有明显的抑制作用，表现出良好的生防潜力。但粉红螺旋聚孢霉HLD-1在单独使用时的抗病性能有限，防效不稳定。

发明内容

本发明目的在于提供一种转几丁质酶基因的粉红螺旋聚孢霉工程菌株，解决现有粉红螺旋聚孢霉抗病性能有限和防效不稳定的问题。

一种转几丁质酶基因的粉红螺旋聚孢霉工程菌株，命名为Cr-chi32，其特征在于，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的保藏登记号为CGMCC No.10027，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2014年11月28日，分类命名为：粉红螺旋聚孢霉Clonostachys rosea。

上述工程菌株Cr-chi32中的几丁质酶基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

上述工程菌株Cr-chi32的培养特征为：该菌在PDA培养基上生长较快，26℃下培养7d 菌落直径可达7～8cm。菌落毡状，初始为白色，产孢后逐渐变成灰绿色、墨绿色。该菌适宜的生长、产孢温度为24～28℃，最适pH值为6～7，且对光照较为敏感。镜检形态为：菌丝无色、分隔，分生孢子梗直立，可产生2～3级帚状分枝，瓶梗顶端产生大量分生孢子，聚集成球状。孢子卵形或圆柱形，直径3～5μm。

上述工程菌株Cr-chi32的构建方法为：

1)对pAN7-1载体通过酶切获取线性化pAN7-1载体，将线性化pAN7-1载体与几丁质酶目的基因融合拼接，获得过表达载体；

2)将粉红螺旋聚孢霉HLD-1菌株进行培养，筛选收集幼龄菌丝，将幼龄菌丝与蜗牛酶进行混合酶解，过滤并离心，收集原生质体沉淀物，用STC溶液溶解后获取原生质体溶液；

3)将过表达载体与原生质体溶液混合静置，通过液体培养基TB3进行复苏，振荡培养，离心去除上清，通过STC溶液悬浮沉淀后，与TB3培养基混合、倒板培养，挑取转化子。

上述方法中的TB3培养基的组成为：0.7％低熔点琼脂糖、100μg/ml氨苄青霉素和300μg/ml潮霉素。

上述工程菌株Cr-chi32在植物病害防治中的应用。

上述工程菌株Cr-chi32在制备植物病害防治药物中的应用。

一种菌剂，该菌剂中包含工程菌株Cr-chi32。

上述菌剂的制备方法为：将重组菌株Cr-chi32接种于PDA平板上培养7～10d，从平板上切取菌块，接入PD培养液中，振荡培养，最后向培养液中加入悬浮剂和展着剂，获得菌剂。

上述菌剂在植物病害防治中的应用。

本技术通过构建全新的转几丁质酶基因的粉红螺旋聚孢霉工程菌株，增强了粉红螺旋聚孢霉的抗病性能，提高了防效稳定性，该工程菌株能够有效应用于植物病害的防治，尤其是可以用来防治农作物菌核病、灰霉病，同时对枯萎病、根腐病等多种植物真菌病害也有较好的防治作用。

具体实施方式

实施例1

几丁质酶目的基因的分离与鉴定

将粉红螺旋聚孢霉HLD-1菌株转接至PDA培养基，PDA培养基的组成为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，放置在恒温培养箱下26℃培养7d，使用刮铲收集菌丝，分别用CTAB法提取DNA、Trizol法提取RNA。以RNA为模板，采用cDNA反转录试剂盒得到cDNA。

以DNA和cDNA序列为模板，设计几丁质酶目的基因两端引物，chiF(5′-3′)：TTCAGAGTAGGCTTTTGGATTGGT，chiR：ACCCCATATTTGCTCATAATCACA，PCR分别扩增几丁质酶DNA和cDNA。PCR条件为：94℃预变性4min，按以下步骤进行30个循环：94℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸2min。最后在72℃下保持10min，结束扩增反应。

将扩增产物送至上海生工生物工程有限公司进行测序，并将测序结果在NCBI库Blast中进行比对分析，确定扩增序列为几丁质酶目的基因。

其中粉红螺旋聚孢霉HLD-1几丁质酶目的基因DNA序列为SEQ ID NO：1，cDNA序列为SEQ ID NO：2，CDS序列为SEQ ID NO：3。

实施例2

几丁质酶过表达载体的构建与验证

从目标pAN7-1载体中扩增启动子和终止子片段，琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收。采用pEASY Uni Seamless Cloning and Assemby Kit将线性化pAN7-1载体与几丁质酶目的基因片段融合拼接，构建过表达载体。将构建的载体转入大肠杆菌感受态细胞中，37℃过夜培养，随机挑选克隆提取质粒，HindIII酶切验证。

实施例3

工程菌株Cr-chi32的制备与筛选 

将粉红螺旋聚孢霉HLD-1接种到PDA培养基上培养7d至产孢，用无菌双蒸水洗脱孢子，取1ml接种于PD液体培养基中，26℃下培养12h。将菌液过500目网筛，收集菌丝，用无菌水洗涤3次，然后用0.7M氯化钠渗透压稳定剂冲洗使其平衡，收集菌丝。

使用无菌Tip头将菌丝挑入含有40mg/ml蜗牛酶的酶解液中，充分涡旋振荡，28℃摇床中100r/min酶解3h，每隔1h检查原生质体释放量。酶解结束后加入等体积渗透压稳定剂稀释以免酶解过度。使用micracloth过滤细胞碎片，将滤液转移至50ml离心管中，4000r/min离心10min，弃去上清，沉淀悬浮于10ml STC中，STC组成为：蔗糖200g/L、1M Tris-HCl 50ml/L和氯化钙5.55g/L，同样转速和时间，弃去上清悬浮于2ml STC中，并用STC调整浓度至10⁷原生质体/ml。

20μg过表达载体加入100μl原生质体中混合冰浴20min，加入1.25ml PTC溶液，PTC溶液组成为：PEG4000 400g/L、1M Tris-HCl 10ml/L和2.5M氯化钙20ml/L，室温静止20min。将原生质体转入15ml离心管，并加入5ml TB3液体培养基和终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素，其中TB3液体培养基组成为：酵母浸粉3g/L、酸水解酪素3g/L和蔗糖200g/L，28℃，100r/min摇床振荡培养16h。

将原生质体再生物5000r/min离心10min，弃上清并用200μl STC重悬沉淀。将重悬液加入10ml的含低熔点琼脂糖的TB3培养基中，加入终浓度为300μg/ml的潮霉素和终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素，混匀后倒板，28℃培养过夜。表面覆盖10ml含低熔点琼脂糖和终浓度300μg/ml的潮霉素的TB3培养基。26℃培养箱避光培养3～5d，将得到的转化子转接到含终浓度为300μg/ml的潮霉素的PDA培养基上，连续转接三代，获得稳定遗传的转化子。

对获得的转化子提取RNA，并通过反转录试剂盒获得cDNA，以转化子cDNA为模板，以hphF和hphR为上下游引物进行PCR扩增，扩增到潮霉素片段的为阳性转化子。hphF：(5′-3′)ATGCCTGAACTCACCGCGACGTCTG，hphR：CTATTCCTTTGCCCTCGGACGAGTG。PCR条件为：95℃预变性5min，按以下步骤进行30个循环：95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min。最后在72℃下保持10min。随后进行琼脂糖凝胶电泳检测，得到阳性转化子。

实施例4

工程菌株Cr-chi32中的几丁质酶活性测定

首先制备胶体几丁质：取几丁质10g，缓慢加入预冷的200ml浓盐酸中，搅拌至几丁质溶解，4℃下放置24h，加入到2L4℃预冷的50％乙醇中搅拌成胶体状，4000r/min离心10min取沉淀，沉淀用无菌水反复洗涤至中性，离心去多余水分，调整浓度至1％。

将阳性转化子和野生株接种于含有1％菌核粉的PD液体培养基中，28℃下摇床振荡培养4d。发酵液4℃，6000r/min离心20min，上清液作为粗酶液。分别取0.4ml粗酶液、pH 5.8的磷酸缓冲液和1％胶体几丁质混合均匀，置于37℃水浴锅中水浴2h。然后1000r/min下离心10min，取0.4ml上清，加入40μl 30％的蜗牛酶溶液，37℃水浴30min，加入饱和硼砂溶液0.2ml，100℃沸水浴7min，冷却后加入1ml 1％DMAB(对二甲氨基苯甲醛)溶液和0.2ml冰醋酸，37℃水浴15min等待显色，使用分光光度计在585nm波长下测定吸光值。结果显 示Cr-chi32菌株几丁质酶量是野生菌株HLD-1的1.9倍。

实施例5

工程菌株Cr-chi32中的几丁质酶基因表达量的测定

采用实时荧光定量PCR法测定转化工程菌株Cr-chi32和野生株HLD-1中几丁质酶基因的表达量，以延伸因子作为内参基因。使用Primer5软件分别设计延伸因子和几丁质酶荧光定量引物。EFF：TCGATGTCGCTCCTGACT，EFR：AGCGTGACCGTTTATTTGA，chiYF：GTTGTGGTTTGCCTGGTG，chiYR：CCGATACTCTGCTGCTCAT。将各样品cDNA浓度稀释10倍后，使用SYBR Green法进行荧光定量PCR。PCR反应体系为：SYBR Premix 12.5μl，cDNA模板2μl，上下游引物各1μl，以及ddH₂O 8.5μl。反应条件为：95℃变性2min，按以下反应40个循环：95℃变性10s和60℃退火30s。从55℃到85℃每隔0.5℃采集一次荧光，相对表达量的计算采用2^-ΔΔCt法。每个反应3次重复。通过表达量计算表明，工程菌株Cr-chi32几丁质酶基因表达量是野生菌株的90倍。

实施例6

工程菌株Cr-chi32对大豆核盘菌菌核的寄生性测定

胡萝卜切片、灭菌，接种培养好的核盘菌菌块。26℃下培养10d后，将培养物倒于10目的筛网中，自来水反复冲洗，去除残留培养基，收集菌核。挑取大小一致的菌核，分别用75％乙醇和1％NaClO消毒，在重组工程菌株Cr-chi32孢子悬液中浸泡15min，然后置于无菌滤纸上保湿培养。解剖镜下观察，8h时菌核上开始有Cr-chi32菌丝长出，到12h，有一半的菌核被侵染，16h菌核寄生率达到100％。野生菌株培养12h开始寄生，16h寄生率达到43.3％，24h后观察到全部供试菌核长出寄生菌菌丝。

实施例7

工程菌株Cr-chi32温室防治大豆菌核病试验

日光温室播种大豆种子，每盆4粒。出苗后间苗至每盆2株。待长至9片复叶，叶子正、背面均匀涂抹Cr-chi32菌株孢子悬液，浓度5×10⁶CFU/ml。2h后，喷雾接种浓度为3×10⁶/ml的菌核病菌发酵液。保湿培养，日间温度26℃，夜晚15℃。7d后按9级分级标准调查大豆叶片发病情况，计算病情指数和防效，以清水和98％多菌灵1000倍稀释液为对照。对大豆菌核病防效，Cr-chi32工程菌株达到81.4％，比野生菌株和多菌灵处理分别提高31.7％和28.7％。