流感病毒RNA聚合酶纯化或结晶的方法

摘要

本发明公开了一种流感病毒RNA聚合酶纯化或结晶的方法。本发明提供的流感病毒RNA聚合酶结晶的方法，为先将流感病毒RNA聚合酶的PB1亚基编码基因、PA亚基编码基因和PB2亚基截短体的编码基因在昆虫细胞中共表达、纯化，得到RNA聚合酶，再将所述RNA聚合酶与RNA结合形成复合体，再将所述复合体结晶，得到流感病毒RNA聚合酶晶体；所述PB2亚基截短体为PB2亚基氨基酸序列自N末端起前126位氨基酸残基形成的蛋白。本发明的实验证明，经过使用不同的PB2截短体尝试，发现含有PB2氨基端126位氨基酸片段的流感病毒聚合酶复合体表达量更高，每升昆虫细胞培养液可以纯化出10毫克蛋白，优于其它截短体表达量；纯度好，降解轻微；结晶重复性更好、晶体更好更大、衍射也更强。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种流感病毒RNA聚合酶纯化或结晶的方法。 

背景技术

流感病毒，尤其是甲型流感病毒一直是威胁人类社会的一个大问题，它具有广泛的宿主范围包括人、猪、马和禽类等，可以造成人类及动物上呼吸道感染，即流行性感冒，由于其可以借空气迅速的传播，在上个世纪造成数次世界性的大流行。流感病毒属于正黏病毒科，为负链单链RNA分节段基因组病毒，其基因组分为8段，目前发现至少可编码16个蛋白。虽然目前存在不少抗流感病毒药物和疫苗，但是这些药物和疫苗主要针对流感病毒表面蛋白，如HA，NA和M2。由于流感病毒在药物压力下可以通过突变或者基因重组改变其表面抗原，这些表面蛋白经过突变的毒株将具有抗药性，从而可能引起无法控制的流感流行。为了解决药物和疫苗的抗药性问题，人们在考虑改变思路来研发广谱性抗流感药物。 

随着对流感病毒复制机制的研究，人们逐渐将眼光集中在病毒的核糖核蛋白RNP上。流感病毒RNP是流感病毒复制的核心组分。与病毒表面蛋白不同，流感病毒的RNP更为保守，它由病毒基因组、RNA聚合酶和缠绕在病毒基因组RNA上的多个核蛋白组成，负责病毒的转录和复制。流感病毒聚合酶是流感病毒复制的核心机器，它是由PA、PB1和PB2三个亚基组成的大小约为250千道尔顿(KDa)的三元复合物，可以产生三种类型的RNA，分别是cRNA、vRNA和mRNA,该聚合酶在病毒的生命活动中既参与病毒基因组的转录复制过程，同时有文章报道该复合物也参与病毒的组装。 

尽管人们通过生物化学，遗传学，生物信息学和结构生物学对流感病毒聚合酶进行了各方面的深入研究，提出了越来越精细的模型，关于聚合酶的工作机制方面仍然有很多关键问题尚无法解决，例如：聚合酶如何调控转录和复制过程；在复制过程中，两个聚合酶分子如何协调以启动和终止复制等；此外，聚合酶还参与病毒的组装和抵御宿主免疫系统。为了解决这些问题，十分需要一个原子分辨率的聚合酶整体结构，然而由于流感病毒聚合酶是一个250KD的复合物，为了以行使其多种功能，可能具有多种构象，这给结构生物学研究、尤其是晶体结构的获得造成了极大的障碍，因此即使经过了数十年的努力，仍没有流感病毒聚合酶整体复合物的结构得到报道。 

目前，人们在重组蛋白表达纯化，晶体优化和结构解析方面积累了大量的经验，通常情况下，纯化得到足够量的稳定均一的蛋白质、并由此获得结晶仍然是大分子晶体结构分析的主要瓶颈。 

发明内容

本发明公开了一种流感病毒RNA聚合酶结晶的方法。 

本发明提供的一种流感病毒RNA聚合酶结晶的方法，包括如下步骤：为先将流感病毒RNA聚合酶的PB1亚基编码基因、PA亚基编码基因和PB2亚基截短体的编码基因在昆虫细胞中共表达、纯化，得到RNA聚合酶，再将所述RNA聚合酶与RNA结合形成复合体，再将所述复合体结晶，得到流感病毒RNA聚合酶晶体； 

所述PB2亚基截短体为PB2亚基氨基酸序列自N末端起前126位氨基酸残基形成的蛋白。 

上述方法中，所述流感病毒为A型流感病毒，所述A型流感病毒的病毒株具体为H5N1、H1N1或H3N2。 

上述方法中，所述昆虫细胞为High Five细胞。 

上述方法中，所述将流感病毒RNA聚合酶的PB1亚基编码基因、PA亚基编码基因和PB2亚基截短体的编码基因在昆虫细胞中共表达采用Bac-to-BacBac-to-Bac杆状病毒表达系统，所述Bac-to-BacBac-to-Bac杆状病毒表达系统中的供体质粒为pFastBac，大肠杆菌为DH10Bac，昆虫细胞为Sf9。 

上述方法中，所述PB1亚基的氨基酸序列为序列表中序列1所示； 

所述PA亚基的氨基酸序列为序列表中序列3所示； 

所述PB2亚基的氨基酸序列为序列表中序列2所示； 

所述PB2亚基截短体的氨基酸序列为序列表中序列2自N末端第1-126位。 

上述方法中，所述PB1亚基的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列4所示； 

所述PA亚基的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列6所示； 

所述PB2亚基截短体的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列5自5’末端第1-378位。 

上述方法中，所述纯化为将共表达得到的所述RNA聚合酶依次经亲和层析、离子交换层析和凝胶层析，得到纯化后的RNA聚合酶； 

所述结晶采用的缓冲液由终浓度为2％-30％的PEG1000-20000、终浓度为50mM-500mMNaCL和浓度为100mM、pH值为8.5的TrisHCL缓冲液组成； 

所述结晶采用的温度为4℃-20℃。 

由上述的方法制备的RNA聚合酶晶体也是本发明保护的范围。 

上述的RNA聚合酶晶体在抗流感病毒药物筛选或疫苗设计和制备中的应用也是本发明保护的范围。 

本发明的实验证明，经过使用不同的PB2截短体尝试，发现含有PB2氨基端126位氨基酸片段的流感病毒聚合酶复合体表达量更高，每升昆虫细胞培养液可以纯化出2-10毫克蛋白，优于其它截短体表达量(通常为1mg/L)；纯度好，降解轻微(其它截短体存在降解、聚合等现象较多，该截短体在这些方面表现更好)；结晶重复性更好、晶体更好更大、衍射也更强。因此，优选含有PB2氨基端126位氨基酸片段的流感病毒聚合酶复合体进行表达纯化结晶。 

本发明的方法解决了长久以来的一个重要问题，即如何有效表达纯化一个含有大部分流感病毒RNA聚合酶复合体成分的复合体，特别是含有完整PB1结构的该蛋白复合物，并使之结晶，这一方法不仅为流感病毒聚合酶的结构解析奠定基础，同时，对抗流感病毒药物筛选、广谱性疫苗和药物的设计研发进程也将具有重要意义和应用价值。 

附图说明

图1为含有PB2-126截短体的流感病毒RNA聚合酶离子交换层析纯化结果 

图2为含有PB2-126截短体的流感病毒RNA聚合酶凝胶过滤层析纯化结果 

其中，图2A是未加RNA promoter的凝胶过滤层析结果，目的蛋白峰出现在约56毫升处；图2B是加入RNA promoter的凝胶过滤层析结果，目的蛋白峰出现在约53毫升处。蓝色曲线代表UV280吸收曲线；红色曲线代表UV260吸收曲线。竖粉直线是上样时刻。 

图3为含有PB2-126截短体的流感病毒RNA聚合酶SDS-PAGE电泳结果 

M孔道代表分子量标准样孔道；S孔道是纯化的目的蛋白样品孔道 

图4为含有PB2-126截短体的流感病毒RNA聚合酶晶体图片 

两个图中箭头所指为含有PB2-126片段的流感病毒RNA聚合酶复合体结晶图片，呈长方 块、立方块或柱形多边形。 

图5为含有PB2-130截短体的流感病毒RNA聚合酶复合体分子筛纯化图谱 

图6为含有PB2-130截短体的流感病毒RNA聚合酶复合体的纯化结果 

其中，图6A为含有PB2-130截短体的流感病毒RNA聚合酶复合体电泳图，1-2为镍柱层析后电泳、3为离子交换后电泳、4-5为分子筛层析后电泳 

图6B为离子交换图谱，蓝色曲线(上面的曲线)为样品在UV280的吸收情况；红色曲线(下面的曲线)代表UV260吸收；黑色曲线代表离子交换盐浓度的增加过程。 

图6C为分子筛纯化图谱，其中黑色曲线代表不加RNA时UV280和UV260吸收情况，蓝色曲线代表加入RNA后复合体洗脱UV280和UV260吸收情况。 

图7为含有不同PB2截短体的流感病毒RNA聚合酶复合体纯化后的电泳图谱 

图8为含有PB2-130截短体的流感病毒RNA聚合酶复合体电镜结果及结晶图片 

其中A和B为二体及四体的电镜结构观察结果、C为四体加入vRNA后的结晶照片、D为结晶电泳检测图 

图9为含有不同PB2截短体的流感病毒RNA聚合酶复合体的结晶图片 

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 

实验所用昆虫表达载体pFASTBAC和pFastBac-Dual及细胞培养基SF900II SFM均购自Invitrogen公司。所需RNA均由Takara公司合成，镍亲和柱购自Qiagen公司(Ni-NTA Agarose，产品目录号：30230)，SP阳离子交换柱(HITRAP SP HP，产品目录号：17-1152-01)和Superdex20016/60凝胶层析柱(HiLoad16/600Superdex200pg，产品目录号：28-9893-35)购自GE公司。检测PA、PB1和PB2所用抗体通过表达相应蛋白多肽，免疫兔获得多克隆抗体，经过实验验证特异性良好。 

昆虫细胞表达体系采用的是Invitrogen公司的Bac-to-Bac杆状病毒表达系统(Baculovirus Expression System，目录号：10359-016)，其中供体质粒为pFastBac，进行重组病毒构建的大肠杆菌为DH10Bac(该菌株含有可在细菌和昆虫之间转移和扩增的穿梭质粒Bacmid和能表达转座酶的Helper质粒)，昆虫细胞为Sf9。所用昆虫细胞培养基为Invitrogen公司的SF900II SFM。 

本发明的实施例均以流感病毒毒株Influenza virus/A/Guangdong/goose/196(H5N1)(以下简称：H5N1)为例，但其余的流感病毒尤其是A型流感病毒毒株中的流感病毒RNA聚合酶的三个亚基也可以通过本发明的方法进行结晶。 

H5N1的RNA聚合酶聚合体的三个亚基包括PB1蛋白、PA蛋白和PB2蛋白，且PB1蛋白的氨基酸序列为序列1，其编码基因的核苷酸序列为序列4；PA蛋白的氨基酸序列为序列3，其编码基因的核苷酸序列为序列6；PB2蛋白的氨基酸序列为序列2，其编码基因的核苷酸序列为序列5。 

实施例1、含有PB2-126截短体的流感病毒RNA聚合酶的结晶 

本实施例预结晶的流感病毒RNA聚合酶聚合体的三个亚基包括PB1蛋白、PA蛋白和PB2-126截短体； 

PB2-126截短体的氨基酸序列为序列2自N末端第1-126位氨基酸，其编码基因为序列5自5’末端第1-378位核苷酸。 

一、流感病毒RNA聚合酶的获得 

1、流感病毒RNA聚合酶各亚基的表达 

1)、表达流感病毒RNA聚合酶各亚基的重组载体的构建 

一般性的说，通过基因合成方法根据NCBI网站公开的基因序列分别合成H5N1，WSN，PR8，1918，H3N2基因DNA。针对各自序列，分别设计DNA引物，进行PCR扩增，获得各病毒的流感病毒RNA聚合酶各亚基的基因，按照Invitrogen的Bac-to-Bac系统使用指南手册，通过分子克隆方法，将三种亚基PB1，PB2及PA基因分别克隆到pFastBac基因表达载体上，用于在昆虫细胞表达这些基因。其中PB1及PA为全长基因，PB2为截断体基因。 

由于后期要进行镍柱纯化，因此需要在亚基PB2-126或PB1的羧基端加入HIS标签，两种都进行实验，发现在复合体表达过程中，含有组氨酸标签的蛋白只需在亚基PB2-126和PB1任一个亚基上即可，没有必要PB1及PB2亚基同时都含有组蛋白标签。 

在亚基PB2-126的羧基端加入HIS标签，扩增亚基PB2-126编码基因的羧基端引物为5’ATCTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTTTAACCTTTCAACCTTCTCAAAGTATG3’，含终止子，含6个串联的组氨酸标签； 

在亚基PB2-126的羧基端不加入HIS标签，扩增亚基PB2-126编码基因的羧基端引物为5’ATCTCGAGTTATTTTAACCTTTCAACCTTCTCAAAGTATG3’； 

在亚基PB1的羧基端加入HIS标签，扩增亚基PB1编码基因的羧基端引物为： 

5’ATCTCGAGCATGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTTTTGCCGTCTGAGCTCTTCAATGG3’，终止密码子之前加入六个连续排列的组氨酸(6HIS)； 

在亚基PB1的羧基端不加入HIS标签，扩增亚基PB1编码基因的羧基端引物为： 

5’ATCTCGAGCTATTTTTGCCGTCTGAGCTCTTCAATGG3’。 

下面的实验以均为在PB1的羧基端加入HIS标签为例。 

(1)重组载体pFastBac-PB2-126的获得 

氨基端引物序列为5’ATGGATCCATGGAGAGAATAAAAGAATTAAGAG3’；羧基端引物为：5’ATCTCGAGTTATTTTAACCTTTCAACCTTCTCAAAGTATG3’ 

以PB2蛋白的编码基因为模板，用上述氨基端引物和羧基端引物进行PCR扩增，得到PCR产物。 

将该PCR产物分别酶切后连接到载体pFastBac质粒上的克隆位点上，从而构建出表达PB2氨基端含1-126位氨基酸残基片段的重组载体。 

经过测序，该重组载体为将序列表中序列5自5’末端第1-378位核苷酸所示的PB2-126截短体蛋白的编码基因插入表达载体pFASTBAC载体的BamHI和XhoI酶切位点间，表达PB2-126截短体蛋白，得到的重组载体，命名为pFastBac-PB2-126。 

(2)重组载体pFastBac-PB1的获得 

设计DNA引物，其中5’端引物为：ATGGATCCATGTCAATCCGACTTTACTTTTCTT； 

在3’端引物上、终止密码子之前加入六个连续排列的组氨酸(6HIS)为：ATCTCGAGCATGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTTTTGCCGTCTGAGCTCTTCAATGG。 

以PB1合成的全长基因为模板，用上述引物进行PCR扩增，得到PCR产物，将PCR产物克隆到载体pFastBac上，得到重组载体。 

经过测序，该重组载体为将序列表中序列表中序列4所示的PB1亚基编码基因和在其后面加入6个his标签编码基因融合的DNA分子插入表达载体pFASTBAC中BamHI和XhoI酶切 位点得到的重组载体pFastBac-PB1，为重组供体质粒pFastBac-PB1。 

(3)重组载体pFastBac-PA的获得 

氨基端引物为：5’：ATGGATCCATGGAAGACTTTGTGCGACAATGCTT；羧基端引物为：ATCTCGAGCTATTTTAGTGCATGTGTGAGGAAGGAG。 

以PA合成的全长基因为模板，用上述引物进行PCR扩增，得到PCR产物，将PCR产物克隆到载体pFastBac上，得到重组载体。 

经过测序，该重组载体为该重组载体为将序列表中序列表中序列6所示PA亚基的编码基因插入表达载体pFASTBAC的BamHI和XhoI酶切位点间得到的重组载体，为重组供体质粒pFastBac-PA。 

2)、重组昆虫杆状病毒的制备 

(1)重组大肠杆菌和重组穿梭质粒的获得 

按照Invitrogen提供的实验手册，将上述1)制备的重组载体pFastBac-PB1、pFastBac-PA和pFastBac-PB2-126作为供体质粒分别转化大肠杆菌菌株DH10Bac，目的基因在Helper质粒表达的转座酶的协助下与穿梭质粒Bacmid重组，得到重组菌PB1、重组菌PA和重组菌PB2-126。 

提取重组菌PB1的Bacmid质粒，为重组穿梭载体Bacmid-PB1； 

提取重组菌PA的质粒，为重组穿梭载体Bacmid-PA； 

提取重组菌PB2-126的质粒，为重组穿梭载体Bacmid-PB2-126。 

(2)重组昆虫杆状病毒的制备 

流感病毒RNA聚合酶三个亚基能形成紧密的复合体。 

将重组穿梭载体Bacmid-PB2-126、Bacmid-PB1、Bacmid-PA分别转染昆虫细胞Sf9细胞系，72小时分别收集上清液，得到表达PB2-126的重组昆虫杆状病毒、表达PB1的重组昆虫杆状病毒、表达PA的重组昆虫杆状病毒，由此获得第一代(P1)各亚基表达的病毒。 

将上述产生的表达PB2-126的重组昆虫杆状病毒、表达PB1的重组昆虫杆状病毒、表达PA的重组昆虫杆状病毒分别通过两次转染昆虫细胞系Sf9细胞以进行病毒扩增，得到扩增的P3代表达PB2-126的重组昆虫杆状病毒、P3代表达PB1的重组昆虫杆状病毒、P3代表达PA的重组昆虫杆状病毒。 

检测滴度，P3代病毒滴度可以达到107pfu/mL以上，可以用于蛋白质表达纯化。若病毒滴度较低，可用P3代病毒再次感染Sf9细胞系，得到滴度较高的P4代杆状病毒用于蛋白质表达。 

3)、流感病毒RNA聚合酶的表达 

将上述2)得到P3代表达PB2-126的重组昆虫杆状病毒、P3代表达PB1的重组昆虫杆状病毒、P3代表达PA的重组昆虫杆状病毒等滴度量(滴度均为108pfu/mL)混合后按10viruspaticles/Cell(MOI＝10；MOI:multiplicity of infection)转染昆虫细胞High Five，48小时后收集培养液，500×g4℃离心10分钟收集细胞。将上述收获的细胞按照1:10(质量:体积)溶解于裂解缓冲液中(25mM Tris,250mM NaCl，pH8.0)，使用超声破碎细胞，具体在0℃冰液中保温放置装有细胞悬液的容器，在30w功率/50mL细胞溶液比率下，按照超声3秒停6秒方式总计超声破碎30分钟的方式充分裂解，之后,40,000×g4℃离心30分钟，收集细胞裂解液上清液，即为含有PB2-126截短体流感病毒RNA聚合酶的上清液。可以反复离心2次以便尽可能除去杂质。 

上述裂解缓冲液按照如下方法制备：将如下溶质按照如下终浓度溶解在水中得到的溶液:250mM NaCl、25mM Tris，调节裂解缓冲液的pH值为8.0。 

2、流感病毒RNA聚合酶的镍柱亲和层析纯化 

将上述1得到的含有PB2-126截短体流感病毒RNA聚合酶的上清液吸取到预冷的烧杯中，加入适量用裂解缓冲液清洗过的镍柱磁珠(Nickel Beads)，4℃结合1小时。500×g4℃离心3分钟收集Beads，用裂解缓冲液清洗Beads5次。加入洗脱缓冲液洗脱Beads，收集洗脱液；30,000×g4℃离心30分钟，取上清液，即为纯化的PB2-126截短体流感病毒RNA聚合酶。 

用截留分子量为30,000道尔顿的超滤管浓缩纯化的PB2-126截短体流感病毒RNA聚合酶至1mL。 

上述洗脱缓冲液按照如下方法制备：将如下溶质按照如下终浓度溶解在水中得到的溶液:25mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸、200mM NaCl、250mM咪唑，10％丙三醇；调节洗脱缓冲液的pH值为7.8。 

将上述纯化的PB2-126截短体流感病毒RNA聚合酶用SDS-PAGE检测。 

得到分子量约为80KD的PB1亚基条带、稍小于80KD的PA条带以及含有126个氨基酸残基的PB2条带(14KD)，表明，得到PB2-126截短体流感病毒RNA聚合酶。 

分别回收每个亚基的条带，送去进行蛋白N端测序，验证得确得到H5N1流感病毒RNA聚合酶的三个亚基，表明电泳检测的目的大小的条带得确为H5N1流感病毒RNA聚合酶的三个亚基。 

计算含量，每升培养液可获得10mg的纯化RNA聚合酶(PA-PB1-PB2-126)。 

二、流感病毒RNA聚合酶的大规模表达、纯化 

1、流感病毒RNA聚合酶大规模表达 

使用波式反应器或锥形瓶或其它类型的细胞培养瓶，使用SF900II SFM培养基悬浮培养20L High Five细胞，待细胞密度生长至2×106cells/mL时，将上述一得到的P3代表达PB2-126的重组昆虫杆状病毒、P3代表达PB1的重组昆虫杆状病毒、P3代表达PA的重组昆虫杆状病毒等滴度量(滴度均为108pfu/mL)混合后按1％(体积/体积)加入，27℃培养60小时，使用离心机在4℃、离心力4000g下离心10分钟收集细胞。 

在培养过程中，开启波式反应器的给氧系统给培养袋不断补充氧气。如使用锥形瓶或其它类型细胞培养瓶则只需保持通气即可，不需要特别补氧方式。 

将上述收集细胞按照1:10(质量:体积)溶解于裂解缓冲液中，超声破碎方法破碎细胞，使用超声破碎细胞是在0℃冰液中保温放置装有细胞悬液的容器，在30w功率/50mL细胞溶液比率下，按照超声3秒停6秒方式总计超声破碎10-30分钟的方式充分裂解，之后,40,000×g4℃离心60分钟，收集细胞裂解液上清液，即为含有PB2-126截短体流感病毒RNA聚合酶的上清液。 

上述裂解缓冲液按照如下方法制备：将如下溶质按照如下终浓度溶解在水中得到的溶液:250mM NaCl、25mM Tris，调节裂解缓冲液的pH值为8.0。 

2、流感病毒RNA聚合酶的纯化 

A：亲和层析 

将上述1得到的含有PB2-126截短体流感病毒RNA聚合酶的上清液吸取到预冷的烧杯中，加入适量用裂解缓冲液清洗过的镍柱磁珠(Nickel Beads)，4℃结合3小时。500×g4℃离心3分钟收集Beads，用裂解缓冲液清洗Beads5次。此时可将Beads加入一个相应大小的空的 层析柱中，进一步用清洗液清洗。(该步骤也可将离心获得的上清液直接加入含有镍柱磁珠的柱子中进行结合，然后在柱上进行冲洗及洗脱过程以便亲和纯化目的复合体)清洗充分后，加入洗脱缓冲液冲洗Beads，此时蛋白复合体从beads上被洗脱下来，通常需要用2倍-5倍Beads体积洗脱目的蛋白，收集洗脱液，得亲和层析纯化PB2-126截短体流感病毒RNA聚合酶(电泳检测，说明得到目的蛋白)。 

上述洗脱缓冲液按照如下方法制备：将如下溶质按照如下终浓度溶解在水中得到的溶液:25mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸、200mM NaCl、250mM咪唑，10％丙三醇；调节洗脱缓冲液的pH值为7.8。 

用截留分子量为30,000道尔顿的超滤管浓缩至5mL，得到亲和层析后浓缩样品。 

将浓缩样品16,000×g4℃离心30分钟，收集上清液(浓缩后蛋白聚合沉淀，收集在上清液中存在的蛋白进行下述实验)。 

B、离子交换层析 

通过亲和层析初步纯化的目的蛋白需要进一步纯化，首选阳离子交换层析的方法。 

过程如下：在AKTA FPLC或AKTA Purifier等层析设备上用低盐缓冲液平衡阳离子交换柱HiTrap S HP(含有介质beads5mL，来自于GE Healthcare，层析柱直径约为1厘米，长约为3厘米)，用购自GE公司的FPLC系统Purifier10的上样环将上述A得到的浓缩样品离心后的上清液)注入层析系统，使上述A获得的亲和层析后浓缩样品缓缓流过离子交换柱，目的蛋白将结合在离子交换柱上。为了保险起见，收集未结合到离子交换柱的样品，可以再次将此流穿样品上样，以便获得进一步的结合，之后继续用低盐缓冲液清洗离子交换柱，直至紫外吸收值没有明显变化为止。调整缓冲液洗脱方式，用200mM至500mM盐浓度线性梯度洗脱样品。 

结果如图1所示，图中Peak1及Peak2为含有目的蛋白的洗脱峰，蛋白的洗脱盐浓度约为200-500mM区间，峰位置约为250mM及400mM盐浓度NaCL。蓝色曲线代表UV280吸收曲线；红色曲线代表UV260吸收曲线；棕色曲线代表电导值；绿色曲线代表盐浓度变化曲线。Loading箭头指示上样时刻，收集200mM至400mM洗脱得到的洗脱液(对应的Peak1峰和Peak2峰)为离子交换层析纯化后PB2-126截短体流感病毒RNA聚合酶。 

将离子交换层析纯化后流感病毒RNA聚合酶用截留分子量为30,000道尔顿的超滤管浓缩至1mL，得到离子交换层析后浓缩样品。 

将浓缩样品16,000×g4℃离心30分钟，收集上清液。 

上述低盐缓冲液按照如下方法制备：将如下溶质按照如下终浓度溶解在水中得到的溶液:25mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸、200mM NaCl；pH值为7.8； 

上述高盐缓冲液按照如下方法制备：将如下溶质按照如下终浓度溶解在水中得到的溶液:25mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸、1M NaCl；pH7.8。 

C、凝胶层析 

用凝胶层析缓冲液平衡凝胶层析柱Superdex20016/60分子筛(GE healthcare，柱径1.6厘米，柱长60厘米)将上述B获得的离子交换层析后浓缩样品上清液注入凝胶层析系统，按每分钟1mL的流速用凝胶层析洗脱缓冲液洗脱样品。 

观察紫外吸收值，根据出现紫外吸收峰对应的位置收集样品。 

结果如图2A，收集280nM或260nM下56±2mL处出峰对应的洗脱液，为纯化PB2-126截短体流感病毒RNA聚合酶。 

上述凝胶层析洗脱缓冲液按照如下方法制备：将如下溶质按照如下终浓度溶解在水中得到的溶液:25mM HEPES、200mM NaCl、1mM EDTA，调节凝胶层析缓冲液的pH值为7.8。 

纯化PB2-126截短体流感病毒RNA聚合酶进行SDS-PAGE电泳检测，结果如图3所示，可以看出，得到分子量约为80KD的PB1亚基条带、稍小于80KD的PA条带以及含有126个氨基酸残基的PB2条带(14KD)，表明，得到PB2-126截短体流感病毒RNA聚合酶。 

用截留分子量为30,000-道尔顿的超滤管浓缩纯化PB2-126截短体流感病毒RNA聚合酶至1mL，得到浓缩PB2-126截短体流感病毒RNA聚合酶。 

三、流感病毒RNA聚合酶与流感病毒的核酸promoter双链RNA结合 

为了结晶，必须将流感病毒RNA聚合酶结合核酸，通常在病毒中通常流感病毒RNA聚合酶与其promoter核酸(RNA)结合，具体如下： 

1、promoter核酸(RNA)的获得 

首先，合成流感病毒的cRNA或vRNA promoter的两条链，共四条RNA，序列分别为：第一条：5'-AGUAGAAACAAGGGUG-3'含有16个核苷酸；第二条：5'-CACCCUGCUUUUGCU-3'，含有15个核苷酸；第三条：5'-AGCAAAAGCAGGGUG-3'，含有15个核苷酸；第四条：5'-CACCCUUGUUUCUACU-3'，含有16个核苷酸。其中，第一与第二条RNA为vRNA promoter的两条配对链，它们按1:1摩尔比混合，构成vRNA promoter。 

第三与第四条RNA为cRNA promoter的两条配对链，它们按1:1摩尔比混合，构成cRNApromoter。 

将vRNA promoter的两条链按1:1混合，进行退火(Annealing)操作(95℃5分钟后，迅速转移到0℃保温)，得到vRNA promoter。 

同样，将cRNA promoter的两条链按1:1混合，进行退火(Annealing)操作(95℃5分钟后，迅速转移到0℃保温)，得到cRNA promoter。 

2、流感病毒RNA聚合酶与promoter双链RNA结合 

在上述二的C方法凝胶层析所获得的浓缩样品上清液中加入vRNA promoter，在0℃中保温0.5小时，得到结合vRNA promoter的PB2-126截短体流感病毒RNA聚合酶。 

将上述结合vRNA promoter的PB2-126截短体流感病毒RNA聚合酶按照上述二的C方法凝胶层析纯化，结果图2B所示，收集280nM或260nM下53±4mL处出峰对应的洗脱液，为纯化结合vRNA promoter的流感病毒RNA聚合酶，说明加入RNA promoter之后蛋白质复合体出峰位置仍然为53±4mL，说明结合vRNA promoter的PB2-126截短体流感病毒RNA聚合酶为单体。 

采用同样的方法将vRNA promoter结合PB2-126截短体流感病毒RNA聚合酶，结果与上述一致。 

四、流感病毒RNA聚合酶的结晶 

由三得到的结合vRNA promoter的PB2-126截短体流感病毒RNA聚合酶和结合cRNApromoter的PB2-126截短体流感病毒RNA聚合酶，经浓缩后，达到20mg/mL浓度，可以用于进行结晶实验。 

采用商购的结晶试剂盒(hampton reaserch company)，将上述浓缩后结合vRNA promoter的PB2-126截短体流感病毒RNA聚合酶和结合cRNA promoter的PB2-126截短体流感病毒RNA聚合酶，均在结晶缓冲液条件为5％PEG20000、100mMTrisHCL(pH8.5)、250mMNaCL以及16℃温度环境下结晶。 

结合vRNA promoter的PB2-126截短体流感病毒RNA聚合酶结晶图如图4所示，可以看出，均获得类似于长方形外观的流感病毒RNA聚合酶晶体。 

结合vRNA promoter的PB2-126截短体流感病毒RNA聚合酶的晶体和结合cRNA promoter的PB2-126截短体流感病毒RNA聚合酶晶体结果无显著差异。 

实施例2、含有PB2-130截短体的流感病毒RNA聚合酶的结晶(对比例) 

本实施例预结晶的流感病毒RNA聚合酶聚合体的三个亚基包括PB1蛋白、PA蛋白和PB2-130截短体； 

PB2-130截短体的氨基酸序列为序列2自5’末端第1-130位氨基酸，对应的核苷酸序列为序列5自5’末端第1-390位核苷酸。 

一、流感病毒RNA聚合酶的获得 

1、流感病毒RNA聚合酶各亚基的表达 

1)、表达流感病毒RNA聚合酶各亚基的重组载体的构建 

由于后期要进行镍柱纯化，因此需要在亚基PB2-130或PB1的羧基端加入HIS标签，两种都进行实验，发现在复合体表达过程中，含有组氨酸标签的蛋白只需在亚基PB2-130和PB1任一个亚基上即可，没有必要PB1及PB2亚基同时都含有组蛋白标签。 

在亚基PB2-130的羧基端加入HIS标签，扩增亚基PB2-130编码基因的羧基端引物为5’ATCTCGAGCTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGAAGGTTCCATGTTTTAACCTTTCAACC3’含终止子，含6个串联的组氨酸标签； 

在亚基PB2-130的羧基端不加入HIS标签，扩增亚基PB2-130编码基因的羧基端引物为：5’ATCTCGAGCTAGAAGGTTCCATGTTTTAACCTTTCAACC3’； 

下面的实验以均为在PB1的羧基端加入HIS标签为例。 

(1)重组载体pFastBac-PB2-130的获得 

氨基端引物序列为：5’ATGGATCCATGGAGAGAATAAAAGAATTAAGAG3’；羧基端引物为：5’ATCTCGAGCTAGAAGGTTCCATGTTTTAACCTTTCAACC3’(含终止子，不含组氨酸标签)。 

以PB2蛋白的编码基因为模板，用上述氨基端引物和羧基端引物进行PCR扩增，得到PCR产物。 

将该PCR产物分别酶切后连接到载体pFastBac质粒上的克隆位点上，从而构建出表达PB2氨基端含1-130位氨基酸残基片段的重组载体。 

经过测序，该重组载体为将序列表中序列5自5’末端第1-390位核苷酸所示的PB2-130截短体蛋白的编码基因插入表达载体pFASTBAC载体的BamHI和XhoI酶切位点间，表达PB2-130截短体蛋白，得到的重组载体，命名为pFastBac-PB2-130。 

(2)重组载体pFastBac-PB1的获得：与实施例1方法相同。 

(3)重组载体pFastBac-PA的获得：与实施例1方法相同。 

2)重组昆虫杆状病毒的制备：与实施例1方法基本相同，不同的是将pFastBac-PB2-126替换为pFastBac-PB2-130，得到P3代表达PB2-130的重组昆虫杆状病毒、P3代表达PB1的重组昆虫杆状病毒、P3代表达PA的重组昆虫杆状病毒。 

3)、流感病毒RNA聚合酶的表达 

按照实施例1的方法，将上述2)得到P3代表达PB2-130的重组昆虫杆状病毒、P3代表达PB1的重组昆虫杆状病毒、P3代表达PA的重组昆虫杆状病毒等滴度量(滴度均为108pfu/mL)混合后转入细胞High Five，裂解，得到含有PB2-130截短体流感病毒RNA聚合 酶的上清液。 

2、流感病毒RNA聚合酶的镍亲和层析纯化 

将上述1得到的含有PB2-130截短体流感病毒RNA聚合酶的上清液按照上述实施例1的方法进行镍柱亲和层析纯化，得到纯化的PB2-130截短体流感病毒RNA聚合酶。 

将上述纯化的PB2-130截短体流感病毒RNA聚合酶用SDS-PAGE检测。 

结果如图7所示，1-130为纯化的PB2-130截短体流感病毒RNA聚合酶，可以看出，得到分子量约为80KD的PB1亚基条带、稍小于80KD的PA条带以及14KD PB2的130个氨基酸残基条带，表明，得到PB2-130截短体流感病毒RNA聚合酶。 

分别回收每个亚基的条带，送去进行蛋白N端测序，验证得确得到H5N1流感病毒RNA聚合酶的三个亚基，表明电泳检测的目的大小的条带得确为H5N1流感病毒RNA聚合酶的三个亚基。 

计算含量，每升培养液可获得0.8mg的纯化RNA聚合酶(PA-PB1-PB2-130)。 

二、流感病毒RNA聚合酶的大规模表达、纯化 

1、流感病毒RNA聚合酶大规模表达 

按照实施例1的方法将P3代表达PB2-130的重组昆虫杆状病毒、P3代表达PB1的重组昆虫杆状病毒、P3代表达PA的重组昆虫杆状病毒等滴度量(滴度均为108pfu/mL)混合后按1％(体积/体积)加入High Five细胞、培养、裂解，收集上清液，得到含有PB2-130截短体流感病毒RNA聚合酶的上清液。 

2、流感病毒RNA聚合酶的纯化 

A：亲和层析 

按照实施例1的方法将上述1得到的含有PB2-130截短体流感病毒RNA聚合酶的上清液进行镍柱亲和层析，用2倍-5倍Beads体积洗脱目的蛋白，收集洗脱液，得亲和层析纯化PB2-130截短体流感病毒RNA聚合酶。 

电泳检测，结果如图6A的泳道1和2所示，可以看出，得到分子量约为80KD的PB1亚基条带、稍小于80KD的PA条带以及14KD PB2的130个氨基酸残基条带，表明，得到PB2-130截短体流感病毒RNA聚合酶。 

B、离子交换层析 

按照实施例1的方法将上述A纯化后的PB2-130截短体流感病毒RNA聚合酶进行离子交换层析，用200mM至400mM盐浓度线性梯度洗脱样品。 

结果如图6B所示，收集200mM至400mM洗脱得到的洗脱液(对应的主峰)为离子交换层析纯化后PB2-130截短体流感病毒RNA聚合酶. 

电泳检测，结果如图6A的泳道3所示，说明得到目的蛋白。 

C、凝胶层析 

按照实施例1的方法将上述B纯化后的PB2-130截短体流感病毒RNA聚合酶的上清液进行凝胶层析，结果如图5所示，收集280nM或260nM下大约为58毫升处出峰对应的洗脱液，对应分子量为复合体二体大小，这与纯化表达的含有PB2-126的流感病毒RNA聚合酶复合体样品出峰位置不同，为纯化PB2-130截短体流感病毒RNA聚合酶。 

电泳检测，结果如图6A的泳道5和6所示，说明得到目的蛋白。 

三、流感病毒RNA聚合酶与流感病毒的核酸promoter双链RNA结合 

1、promoter核酸(RNA)的获得：与实施例1相同。 

2、流感病毒RNA聚合酶与promoter双链RNA结合 

与实施例1基本相同，不同的是替换为纯化PB2-130截短体流感病毒RNA聚合酶，得到结合vRNA promoter的PB2-130截短体流感病毒RNA聚合酶和结合cRNA promoter的PB2-130截短体流感病毒RNA聚合酶。 

将结合vRNA promoter的PB2-130截短体流感病毒RNA聚合酶和未结合RNA的PB2-130截短体流感病毒RNA聚合酶凝胶层析纯化。 

结果图6C所示，收集280nM下53毫升处出峰对应的洗脱液，为结合vRNA promoter的PB2-130截短体流感病毒RNA聚合酶(四体形式，分子量约为720KD)，收集280nM下68毫升出峰对应的洗脱液，为PB2-130截短体流感病毒RNA聚合酶(单体形式，分子量约为180KD)，58毫升处出峰对应的洗脱液，为结合vRNA promoter的PB2-130截短体流感病毒RNA聚合酶(二体形式，分子量约为360KD)，表明PB2-130截短体流感病毒RNA聚合酶主要以二体(未加RNA启动子时)和四体(加入RNA启动子后)形式存在，而不是PB2-126截短体流感病毒RNA聚合酶的单体存在形式。 

结合vRNA promoter的PB2-130截短体流感病毒RNA聚合酶和结合cRNA promoter的PB2-130截短体流感病毒RNA聚合酶结果无显著差异。 

将PB2-130截短体流感病毒RNA聚合酶二体和四体进行电镜结构观察，结果如图8A和8B所示，8A为二体，8B为四体。 

四、流感病毒RNA聚合酶的结晶 

采用商购的结晶试剂盒(hampton reaserch company)，将上述浓缩后结合vRNA promoter的PB2-130截短体流感病毒RNA聚合酶和结合cRNA promoter的PB2-130截短体流感病毒RNA聚合酶，均在结晶缓冲液条件为2％PEG10000、100mMTrisHCL(pH8.5)、50mMNaCL以及4℃温度环境下结晶。 

结合vRNA promoter的PB2-130截短体流感病毒RNA聚合酶结晶图如图8C和9C所示，结合cRNA promoter的PB2-130截短体流感病毒RNA聚合酶结晶图如图9D所示，可以看出，均获得类似于长方形外观的流感病毒RNA聚合酶晶体。 

为了确定此为目的蛋白结晶是否为流感病毒RNA聚合酶晶体，取出晶体后，使用沉淀剂反复洗涤，除去粘在晶体上的蛋白溶液，洗净的晶体进行SDS-PAGE电泳分析，结果如图8D所示，说明该晶体为PB2-130截短体流感病毒RNA聚合酶晶体。 

PB2-130截短体流感病毒RNA聚合酶晶体与PB2-126截短体流感病毒RNA聚合酶晶体相比，晶体较小、衍射也较弱。 

实施例3、含有PB2-103截短体的流感病毒RNA聚合酶的结晶(对比例) 

本实施例预结晶的流感病毒RNA聚合酶聚合体的三个亚基包括PB1蛋白、PA蛋白和PB2-103截短体； 

PB2-103截短体的氨基酸序列为序列2自5’末端第1-103位氨基酸，对应的核苷酸序列为序列5自5’末端第1-309位核苷酸。 

一、流感病毒RNA聚合酶的获得 

1、流感病毒RNA聚合酶各亚基的表达 

1)、表达流感病毒RNA聚合酶各亚基的重组载体的构建 

由于后期要进行镍柱纯化，因此需要在亚基PB2-130或PB1的羧基端加入HIS标签，两种都进行实验，发现在复合体表达过程中，含有组氨酸标签的蛋白只需在亚基PB2-103和PB1 任一个亚基上即可，没有必要PB1及PB2亚基同时都含有组蛋白标签。 

在亚基PB2-103的羧基端加入HIS标签，扩增亚基PB2-103编码基因的羧基端引物为5’ATCTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCCCATTCCTGTTCCACCAACTTAC3’含终止子，含6个串联的组氨酸标签； 

在亚基PB2-103的羧基端不加入HIS标签，扩增亚基PB2-103编码基因的羧基端引物为：5’ATCTCGAGTTACCCATTCCTGTTCCACCAACTTAC3’； 

下面的实验以均为在PB1的羧基端加入HIS标签为例。 

(1)重组载体pFastBac-PB2-130的获得 

以PB2蛋白的编码基因为模板，用上述氨基端引物和羧基端引物进行PCR扩增，得到PCR产物。 

将该PCR产物分别酶切后连接到载体pFastBac质粒上的克隆位点上，从而构建出表达PB2氨基端含1-103位氨基酸残基片段的重组载体。 

经过测序，该重组载体为将序列表中序列5自5’末端第1-309位核苷酸所示的PB2-103截短体蛋白的编码基因插入表达载体pFASTBAC载体的BamHI和XhoI酶切位点间，表达PB2-103截短体蛋白，得到的重组载体，命名为pFastBac-PB2-103。 

(2)重组载体pFastBac-PB1的获得：与实施例1方法相同。 

(3)重组载体pFastBac-PA的获得：与实施例1方法相同。 

2)重组昆虫杆状病毒的制备：与实施例1方法基本相同，不同的是将pFastBac-PB2-126替换为pFastBac-PB2-103，得到P3代表达PB2-103的重组昆虫杆状病毒、P3代表达PB1的重组昆虫杆状病毒、P3代表达PA的重组昆虫杆状病毒。 

3)、流感病毒RNA聚合酶的表达 

按照实施例1的方法，将上述2)得到P3代表达PB2-103的重组昆虫杆状病毒、P3代表达PB1的重组昆虫杆状病毒、P3代表达PA的重组昆虫杆状病毒等滴度量(滴度均为108pfu/mL)混合后转入细胞High Five，裂解，得到含有PB2-103截短体流感病毒RNA聚合酶的上清液。 

2、流感病毒RNA聚合酶的镍亲和层析纯化 

将上述1得到的含有PB2-103截短体流感病毒RNA聚合酶的上清液按照上述实施例1的方法进行镍柱亲和层析纯化，得到纯化的PB2-103截短体流感病毒RNA聚合酶。 

将上述纯化的PB2-103截短体流感病毒RNA聚合酶用SDS-PAGE检测。 

结果如图7所示，1-103为纯化的PB2-103截短体流感病毒RNA聚合酶，可以看出，得到分子量约为80KD的PB1亚基条带、稍小于80KD的PA条带以及11KD PB2的103个氨基酸残基条带，表明，得到PB2-103截短体流感病毒RNA聚合酶。 

分别回收每个亚基的条带，送去进行蛋白N端测序，验证得确得到H5N1流感病毒RNA聚合酶的三个亚基，表明电泳检测的目的大小的条带得确为H5N1流感病毒RNA聚合酶的三个亚基。 

计算含量，每升培养液可获得5mg的纯化RNA聚合酶(PA-PB1-PB2-103)。 

二、流感病毒RNA聚合酶的大规模表达、纯化 

1、流感病毒RNA聚合酶大规模表达 

按照实施例1的方法将P3代表达PB2-103的重组昆虫杆状病毒、P3代表达PB1的重组昆虫杆状病毒、P3代表达PA的重组昆虫杆状病毒等滴度量(滴度均为108pfu/mL)混合后按 1％(体积/体积)加入High Five细胞、培养、裂解，收集上清液，得到含有PB2-103截短体流感病毒RNA聚合酶的上清液。 

2、流感病毒RNA聚合酶的纯化 

A：亲和层析 

按照实施例1的方法将上述1得到的含有PB2-103截短体流感病毒RNA聚合酶的上清液进行镍柱亲和层析，用2倍-5倍Beads体积洗脱目的蛋白，收集洗脱液，得亲和层析纯化PB2-103截短体流感病毒RNA聚合酶。 

电泳检测，与图7的1-103大小一致。表明，得到PB2-103截短体流感病毒RNA聚合酶。 

B、离子交换层析 

按照实施例1的方法将上述A纯化后的PB2-103截短体流感病毒RNA聚合酶进行离子交换层析，用200mM至400mM盐浓度线性梯度洗脱样品，结果与图6B一致，收集200mM至400mM洗脱得到的洗脱液(对应的主峰)为离子交换层析纯化后PB2-103截短体流感病毒RNA聚合酶。 

电泳检测，结果图7的1-103大小一致，说明得到目的蛋白。 

C、凝胶层析 

按照实施例1的方法将实施例1的方法将上述B纯化后的PB2-103截短体流感病毒RNA聚合酶的上清液进行凝胶层析，结果与图5一致。 

电泳检测，结果图7的1-103大小一致，说明得到目的蛋白。 

三、流感病毒RNA聚合酶与流感病毒的核酸promoter双链RNA结合 

1、promoter核酸(RNA)的获得：与实施例1相同。 

2、流感病毒RNA聚合酶与promoter双链RNA结合 

与实施例1基本相同，不同的是替换为纯化PB2-103截短体流感病毒RNA聚合酶，得到结合vRNA promoter的PB2-103截短体流感病毒RNA聚合酶和结合cRNA promoter的PB2-103截短体流感病毒RNA聚合酶。 

将结合vRNA promoter的PB2-103截短体流感病毒RNA聚合酶和未结合RNA的PB2-103截短体流感病毒RNA聚合酶凝胶层析纯化。 

结果与图6C一致所示，收集280nM下53毫升处出峰对应的洗脱液，为结合vRNA promoter的PB2-103截短体流感病毒RNA聚合酶(四体形式，分子量为720KD)；收集280nM下68毫升出峰对应的洗脱液，为PB2-103截短体流感病毒RNA聚合酶(二体形式，分子量为360KD)，收集280nM下58毫升出峰对应的洗脱液，为PB2-103截短体流感病毒RNA聚合酶(单体形式，分子量为180KD)；表明PB2-103截短体流感病毒RNA聚合酶主要以二体(未加RNA启动子时)和四体(加入RNA启动子后)形式存在，而不是PB2-126截短体流感病毒RNA聚合酶的单体存在形式。 

结合vRNA promoter的PB2-103截短体流感病毒RNA聚合酶和结合cRNA promoter的PB2-103截短体流感病毒RNA聚合酶结果无显著差异。 

四、流感病毒RNA聚合酶的结晶 

采用商购的结晶试剂盒(hampton reaserch company)，将上述浓缩后结合vRNA promoter的PB2-103截短体流感病毒RNA聚合酶和结合cRNA promoter的PB2-103截短体流感病毒RNA聚合酶，均在结晶缓冲液条件为30％PEG20000、100mMTrisHCL(pH8.5)、500mMNaCL以及20℃温度环境下结晶。 

结合vRNA promoter的PB2-103截短体流感病毒RNA聚合酶结晶图如图9E所示，结合cRNA promoter的PB2-103截短体流感病毒RNA聚合酶结晶图如图9F所示，可以看出，均获得类似于长方形外观的流感病毒RNA聚合酶晶体。 

为了确定此为目的蛋白结晶是否为流感病毒RNA聚合酶晶体，取出晶体后，使用沉淀剂反复洗涤，除去粘在晶体上的蛋白溶液，洗净的晶体进行SDS-PAGE电泳分析，结果与图7的1-103一致，说明该晶体为PB2-103截短体流感病毒RNA聚合酶晶体。 

PB2-103截短体流感病毒RNA聚合酶晶体与PB2-126截短体流感病毒RNA聚合酶晶体相比，晶体较小、衍射也较弱。