一种菲律宾蛤仔抗氧化肽及其制备方法

摘要

本发明涉及一种菲律宾蛤仔抗氧化肽极其制备方法，所述菲律宾蛤仔抗氧化肽氨基酸序列为Leu-Phe-Lys-Lys-Asn-Leu-Leu-Thr-Leu，通过抗氧化肽的酶解制备、抗氧化肽的分离纯化、抗氧化肽反向色谱-Triple TOF分析及检索获得抗氧化肽。本发明所用原料为菲律宾蛤仔肉，来源广泛，价格低廉，现在将其作为原料，开发成抗氧化肽，升值幅度是相当可观的。本发明提供的抗氧化肽活性很强，不仅可以用作食品添加剂，也可以作为功能性成分，用于保健品、化妆品及护肤品中。

说明书

技术领域

本发明涉及一种菲律宾蛤仔抗氧化肽极其制备方法，属于食品生物技术领域。

背景技术

在正常的代谢途径下，机体内自由基的产生和消除处于一个动态的平衡状态，但是随着年龄的增长或者当机体处在不良的环境下时，机体内的自由基平衡会被打破，平衡一旦被打破，无法被人体消除的多余自由基就会滞留在机体内。过多的自由基会引起机体的衰老，甚至导致多种疾病的出现。

自由基清除剂也被称为抗氧化剂，它能够起到清除自由基的效果，减轻或者消除自由基对机体的损伤。合成抗氧化剂如食子酸丙酯等经过证实对人体有毒害作用和致癌作用。因此，从天然的动植物资源中寻找安全、高效的天然抗氧化剂必然能够受到人们越来越多的重视，也必然能够成为现代医药和保健行业发展的新趋势。

抗氧化肽类是指具有一定抗氧化活性的多肽物质，分子结构介于氨基酸和蛋白质之间，一般分子量小于6000道尔顿。近年来，通过蛋白酶酶解动植物蛋白来提取制备抗氧化肽已经成为国内外研究的热点。发明申请专利（申请号201110128241.0）公开了一种鲨鱼皮胶原蛋白制备的抗氧化多肽，氨基酸序列为Gly-Ala-Ile-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Arg-Ala，其分子量为866Da，该抗氧化产品消除了天然抗氧化剂所具有的缺陷并且消除了公众对人工合成抗氧化剂的忧虑。发明申请专利（申请号201210558061.0）公开了一种金枪鱼碎肉蛋白抗氧化肽及其制备方法和用途，该抗氧化肽的氨基酸序列为Tyr-Glu-Asn-Gly-Gly，制得的抗氧化肽具有安全无毒副作用、抗氧化活性强和易于消化吸收等优点。

菲律宾蛤仔（Ruditapes philippinarum），是一种高蛋白、低脂肪的经济类水产品。但我国现阶段对菲律宾蛤仔的加工主要以传统的产品为主，产品附加值低，这严重制约了菲律宾蛤仔加工产品的市场发展。因此利用菲律宾蛤仔的资源优势，制备出具有较高抗氧化活性的活性肽，解决菲律宾蛤仔加工产品附加值低的问题，是菲律宾蛤仔蛋白资源综合利用的重要环节。

发明内容

本发明目的在于提供一种具有很强抗氧化活性的菲律宾蛤仔抗氧化肽及其制备方法，该抗氧化肽的氨基酸序列为Leu-Phe-Lys-Lys-Asn-Leu-Leu-Thr-Leu，具体技术方案如下。

一种菲律宾蛤仔抗氧化肽的制备方法，包括如下步骤：

（1）抗氧化肽的酶解制备：将活菲律宾蛤仔用清水清洗后，去壳取肉，打浆。按料液比1∶3~1∶7加入pH值为7.5、浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液，加入胰蛋白酶5400~6600U/g于45~55℃下酶解3~4h，于95~100℃下灭酶5min，将得到的酶解液在8000rpm下离心10min，得到的上清液即为菲律宾蛤仔酶解液；

（2）抗氧化肽的分离纯化：采用Sephadex G-25 凝胶层析分离纯化酶解液，以纯水为洗脱剂，在280nm下检测，检测得到各组分的抗氧化活性，收集活性最高的组分，冷冻干燥后用去离子水配成溶液，进一步用Sephadex G-15 凝胶层析分离，以纯水为洗脱剂，在280nm下检测，检测各组分的抗氧化活性，收集活性最高的组分；将活性最高的组分经制备型液相色谱分离，液相色谱的色谱条件为：Kromasil C18-5色谱柱（4.6×150mm，10μm），流动相A：去离子水（含0.1%三氟乙酸），流动相B：乙腈（含0.1%三氟乙酸），梯度设置：起始梯度A95%-B5%，终止梯度A60%-B40%，流速12mL/min，分离时间50min。检测波长214nm，分1~3mL进样，收集各组分并检测各组分的抗氧化活性，收集活性最高的组分，冷冻干燥24h，放置备用。

（3）抗氧化肽反向色谱-Triple TOF分析及检索：将冻干的多肽样品重新溶解于纳升反向色谱流动相A中。在线Nano-RPLC液相色谱在Eksigent nanoLC-Ultra? 2D系统进行，溶解后的样品以2μL/min的流速上样到C18预柱上（100μm×3cm，C18，3μm，150?），然后保持流速冲洗脱盐10min。分析柱是C18反相色谱柱（75μm x 15 cm C18- 3μm 120 ?），实验所用梯度为90min内流动相B由5%升高至35%。质谱采用Triple TOF 5600系统结合纳升喷雾III离子源，喷雾电压为2.5 kV，气帘气压为30PSI，雾化气压为5PSI，加热器温度为150℃，质谱扫描方式为信息依赖的采集工作模式下（IDA，Information Dependent Analysis），一级TOF-MS单张图谱扫描时间为250ms，每次IDA循环下最多采集35个电荷为2+到5+且单秒计数大于150的二级图谱，每次循环时间固定为2.5秒，碰撞室能量设定适用于所有前体离子碰撞诱导解离（CID），动态排除设置为18秒，约等于色谱半峰宽。数据处理采用Mascot 2.3软件进行，数据库为菲律宾蛤仔数据库，酶为胰蛋白酶，允许最大漏切位点为2；固定修饰为：Carbamidomethyl（C）；可变修饰为：Acetyl（Protein-term）、Deamidated （NQ）、Dioxidation （W）、Oxidation（M）、Phospho （ST）和Phospho（Y）；MS容差为±15ppm，MSMS容差为±0.15Da，Protein score C.I.%大于95%为鉴定成功。

纳升反向色谱流动相A：0.1%甲酸，2%乙腈，纳升反向色谱流动相B：0.1%甲酸，98%乙腈。

菲律宾蛤仔数据库检索结果得到抗氧化肽的氨基酸序列为：Leu-Phe-Lys-Lys-Asn-Leu-Leu-Thr-Leu，分子量为1089.39Da。

在本发明中采用超氧阴离子自由基清除率作为抗氧化活性的检测方法。取2 mL浓度为1.6mg/mL的样品溶液和2.5 mL浓度为50 mmol/L，pH8.2的Tris-HCl缓冲液混合，于25 ℃的条件下保温2min，然后加入 0.15mL 3mmol/L的邻苯三酚溶液（含10mmol/L HCl）。4min内每30s在325nm出测一次吸光值（A），作（吸光度—时间）图，其斜率即为自氧化速率。抗坏血酸（Vc）作为阳性对照。超氧阴离子自由基清除率（Y）计算公式如下：

注：V₀为蒸馏水代替酶解液组的自氧化率，V1为酶解液组的自氧化速率。

本发明与现有技术相比，具有如下优点和技术效果：

（1）本发明所用原料为菲律宾蛤仔肉，来源广泛，价格低廉，现在将其作为原料，开发成抗氧化肽，升值幅度是相当可观的；

（2）本发明采用酶解法酶解制备菲律宾蛤仔酶解液，然后利用色谱分离技术制备出了一种抗氧化肽；

（3）本发明提供的抗氧化肽活性很强，，不仅可以用作食品添加剂，也可以作为功能性成分，用于保健品、化妆品及护肤品中；

（4）本发明提供的抗氧化肽是一种九肽，分子量小，易于人体的吸收。

附图说明

图1为Sephadex G-25凝胶层析分离纯化抗氧化肽图谱，其中图1a为色谱分离洗脱曲线，图1b为抗氧化活性测定图。

图2为Sephadex G-15凝胶层析分离纯化抗氧化肽图谱，其中图2a为色谱分离洗脱曲线，图2b为抗氧化活性测定图。

图3为制备型高效液相色谱分离纯化抗氧化肽图谱，其中图3a为色谱分离洗脱曲线，图3b为抗氧化活性测定图。

图4为抗氧化肽的离子流图。

图5为抗氧化肽的二级质谱图。

图6为抗氧化肽的拟合生成的质谱图。

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明的实施，但本发明的实施和保护不限于此。

实施例1

（1）抗氧化肽的酶解制备：将活菲律宾蛤仔用清水清洗后，去壳取肉，打浆。按料液比1∶5加入pH值为7.5，浓度为0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液，加入胰蛋白酶6000U/g于50℃下酶解3.5小时，于100℃下灭酶5min，将得到的酶解液在8000rpm下离心10min，得到的上清液即为菲律宾蛤仔酶解液；

（2）抗氧化肽的分离纯化：将酶解液用Sephadex G-25凝胶层析分离，以纯水为洗脱剂，于280nm下检测，流速为2mL/min，检测各组分的抗氧化活性，收集活性最高的RPTE2组分，冷冻干燥后用去离子水配成50mg/mL溶液，用Sephadex G-15凝胶层析进一步分离，以纯水为洗脱剂，在280nm下检测，流速为1.25mL/min，检测各组分的抗氧化活性，收集活性最高的RPTE2-2组分；将RPTE2-2组分经制备型液相色谱分离，液相色谱的色谱条件为：Kromasil C18-5色谱柱（4.6×150mm，10μm），流动相A：去离子水（含0.1%三氟乙酸），流动相B：乙腈（含0.1%三氟乙酸），梯度设置：起始梯度A95%-B5%，终止梯度A60%-B40%，流速12mL/min，分离时间50min。检测波长214nm，分2mL进样，检测各组分的抗氧化活性，收集活性最高的RPTE2-2-4组分，冷冻干燥24h，放置备用。

（3）抗氧化肽反向色谱-Triple TOF分析及检索：将冻干的RPTE2-2-4组分重新溶解于Nano-RPLC Buffer A中。在线Nano-RPLC液相色谱在Eksigent nanoLC-Ultra? 2D系统中进行，溶解后的样品以2μL/min的流速上样到C18预柱上（100μm×3cm，C18，3μm，150?），然后保持流速冲洗脱盐10min。分析柱是C18反相色谱柱（75μm x 15 cm C18- 3μm 120 ?），实验所用梯度为90min内流动相B由5%升高至35%。质谱采用Triple TOF 5600系统结合纳升喷雾III离子源，喷雾电压为2.5 kV，气帘气压为30PSI，雾化气压为5PSI，加热器温度为150℃，质谱扫描方式为信息依赖的采集工作模式下（IDA，Information Dependent Analysis），一级TOF-MS单张图谱扫描时间为250ms，每次IDA循环下最多采集35个电荷为2+到5+且单秒计数大于150的二级图谱，每次循环时间固定为2.5秒，碰撞室能量设定适用于所有前体离子碰撞诱导解离（CID），动态排除设置为18秒，约等于色谱半峰宽。数据处理采用Mascot 2.3软件进行，数据库为菲律宾蛤仔数据库，酶为胰蛋白酶，允许最大漏切位点为2；固定修饰为：Carbamidomethyl（C）；可变修饰为：Acetyl（Protein-term）、Deamidated （NQ）、Dioxidation（W）、Oxidation（M）、Phospho（ST）和Phospho（Y）；MS容差为±15ppm，MSMS容差为±0.15Da，Protein score C.I.%大于95%为鉴定成功。菲律宾蛤仔数据库检索结果得到抗氧化肽的氨基酸序列为：Leu-Phe-Lys-Lys-Asn-Leu-Leu-Thr-Leu。

实施例2

（1）抗氧化肽的酶解制备：将活菲律宾蛤仔用清水清洗后，去壳取肉，打浆。按料液比1∶4加入pH值为7.5，浓度为0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液，加入胰蛋白酶5400U/g于55℃下酶解3小时，然后再在95℃下灭酶5min，将得到的酶解液在8000rpm下离心10min，得到的上清液即为菲律宾蛤仔酶解液；

抗氧化肽的分离纯化：将酶解液用Sephadex G-25凝胶层析分离，以纯水为洗脱剂，在280nm下检测，流速为3mL/min，检测各组分的抗氧化活性，收集活性最高的RPTE2组分，冷冻干燥后用去离子水配成80mg/mL溶液，用Sephadex G-15凝胶层析进一步分离，以纯水为洗脱剂，在280nm下检测，流速为1.5mL/min，检测各组分的抗氧化活性，收集活性最高的RPTE2-2组分；其余步骤按照实施例1同样的实施方式进行，菲律宾蛤仔数据库检索结果得到抗氧化肽的氨基酸序列为：Leu-Phe-Lys-Lys-Asn-Leu-Leu-Thr-Leu。

实施例3

（1）抗氧化肽的酶解制备：将活菲律宾蛤仔用清水清洗后，去壳取肉，打浆。按料液比1∶6加入pH值为7.5，浓度为0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液，加入胰蛋白酶6600U/g于45℃下酶解4小时，于97℃下灭酶5min，将得到的酶解液在8000rpm下离心10min，得到的上清液即为菲律宾蛤仔酶解液；

抗氧化肽的分离纯化：将酶解液用Sephadex G-25凝胶层析分离，以纯水为洗脱剂，在280nm下检测，流速为1.5mL/min，检测各组分的抗氧化活性，收集活性最高的RPTE2组分，冷冻干燥后用去离子水配成65mg/mL溶液，用Sephadex G-15凝胶层析进一步分离，以纯水为洗脱剂，在280nm下检测，流速为1mL/min，检测各组分的抗氧化活性，收集活性最高的RPTE2-2组分；其余步骤按照实施例1同样的实施方式进行，菲律宾蛤仔数据库检索结果得到抗氧化肽的氨基酸序列为：Leu-Phe-Lys-Lys-Asn-Leu-Leu-Thr-Leu。

图1为Sephadex G-25凝胶过滤色谱分离纯化抗氧化肽图谱，其中图1a为色谱分离洗脱曲线，图1b为抗氧化活性测定图。由图1可知，组分RPTE2活性最高。图2为Sephadex G-15凝胶过滤色谱分离纯化抗氧化肽图谱，其中图2a为色谱分离洗脱曲线，图2b为抗氧化活性测定图。由图2可知，组分RPTE2-2活性最高。图3为制备型高效液相色谱分离纯化抗氧化肽图谱，其中图3a为色谱分离洗脱曲线，图3b为抗氧化活性测定图。由图3可知，组分RPTE2-2-4活性最高。图4为抗氧化肽的离子流图。图5为抗氧化肽二级质谱图。图6为抗氧化肽Leu-Phe-Lys-Lys-Asn-Leu-Leu-Thr-Leu的拟合生成的质谱图。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  福建农林大学

 

<120>  一种菲律宾蛤仔抗氧化肽及其制备方法

 

<130>  1

 

<160>  1    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  9

<212>  PRT

<213>  氨基酸序列

 

<400>  1

 

Leu Phe Lys Lys Asn Leu Leu Thr Leu

1               5