分离纯化GABA受体的亲和层析介质及其制备方法

摘要

本发明涉及一种用于分离纯化GABA受体的亲和层析介质及其制备方法。其工艺过程为将氟虫腈进行化学修饰得到亲和配基；以琼脂糖凝胶为基质，经环氧活化剂活化后，偶联氟虫腈亲和配基，得亲和介质；将亲和介质装柱，用于分离纯化鱼类GABA受体蛋白；本发明合成的亲和层析介质具有选择性好，特异性强，机械强度高，分离效果好等优点；此外，其制备工艺简单，易于放大。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种用于分离纯化GABA受体蛋白的亲和层析介质及其制备方法。 

背景技术

γ-氨基丁酸（gama-aminobutyric acid，GABA）受体是昆虫和哺乳动物神经系统中主要的抑制性神经递质受体，不仅是氟虫腈、阿维菌素和林丹等杀虫剂的作用靶标，还与人的许多神经性疾病密切相关，包括癫痫、精神分裂症、失眠、帕金森综合症等。因此，分离纯化GABA 受体，并研究其立体结构，对于开发高效、低毒、安全农药和克服害虫的抗药性具有重要的指导意义。 

亲和层析是利用偶联亲和配基的亲和吸附介质为固定相亲和吸附目标产物，使目标产物得到分离纯化的液相层析法。亲和层析具有高选择性、高活性回收率和高纯度等特点已成为纯化蛋白质等生物大分子最有效的技术之一。 

亲和配基是亲和层析介质的核心，它决定了亲和层析分离的效率。目前亲和层析技术用于分离GABA受体的小分子配体总共有四种，分别为地洛西泮、1012-S、巴氯芬和Ro7-1986/1。氟虫腈作用于GABA受体，对GABA受体有高的亲和力，到目前为止，尚未有报道将氟虫腈作为亲和配基，分离GABA受体。 

发明内容

本发明利用氟虫腈与GABA受体的特异性相互作用，制备以氟虫腈作为配基的亲和介质，能够从受体粗提液中经过一次简单的处理便可得到所需的高纯度的GABA受体； 

因此，本发明的目的是提供一种用于分离纯化GABA受体的亲和层析介质及其制备方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现。 

用于分离纯化GABA受体的亲和层析介质及其制备方法，具体步骤为：1）将氟虫腈进行化学修饰作为亲和配基；2）以琼脂糖凝胶为基质，经环氧活化剂活化后，偶联亲和配基，得亲和介质；3）将亲和介质装柱，用于分离纯化GABA受体蛋白。一种新型GABA受体亲和层析柱介质的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤： 

上文所述的对氟虫腈进行化学修饰，是将氟虫腈与溴乙酰溴进行化学反应，得到产物A；将产物A与邻苯二甲酰亚胺钾盐在无水DMF中反应，得产物B；将产物B用85%的水合肼肼解，得到粗产物C，将粗产物C过硅胶柱，用洗脱剂洗脱得纯品C。样品A、B和C制备反应式如下：

上文所述的氟虫腈与溴乙酰溴的摩尔比为1：1～5；产物A与邻苯二甲酰亚胺钾盐的摩尔比为1：1～10；产物B与85%的水合肼的摩尔比为1：1～3。

上文所述的琼脂糖凝胶为选自琼脂糖6FF、琼脂糖4FF、琼脂糖CL-6B、琼脂糖CL-4B、琼脂糖6B、琼脂糖4B中的一种或多种。 

上文所述的环氧活化剂为环氧氯丙烷、环氧溴丙烷、乙二醇双缩水甘油醚或1,4-丁二醇-二缩水甘油醚。 

上文所述的将步骤1中所得化学修饰的氟虫腈即产物C与环氧活化的琼脂糖凝胶进行偶联，其中环氧活化的琼脂糖凝胶与产物C的质量比为10～1:1～5，在25～40℃水浴中振荡8～24小时。1,4-丁二醇-二缩水甘油醚环氧活化的琼脂糖偶联配基为例，其制备反应式如下： 

上文所述的在步骤2中还包括封闭步骤：将偶联氟虫腈的琼脂糖凝胶过滤，去离子水洗涤，加入pH 11.0的0.5～2mol/L的乙醇胺，在25～40℃水浴中振荡4～10小时，过滤，依次用去离子水、0.1 M pH 4.0含0.5 M NaCl的乙酸-乙酸钠缓冲液、去离子水和0.1 M pH 8.0 NaAc含0.5 M NaCl的硼酸-四硼酸钠缓冲液洗涤洗涤，水洗后抽干。

上文所述的将亲和介质装柱，用于分离纯化GABA受体蛋白包括以下步骤： 

1）鱼脑GABA受体粗提物提取并浓缩；

2）利用氟虫腈亲和介质孵育步骤1）中得到的样品；

3）洗脱步骤2）中亲和介质吸附的GABA受体蛋白；优选地，所述的洗脱条件为含Triton X-100和氟西泮的pH 7.5的磷酸缓冲液；

上文所述的还包括使用超滤、离子交换层析进一步纯化步骤3）中所洗脱的分离纯化GABA受体蛋白。

本发明的优点： 

1、制备亲和配基的所有原料容易获得，价格低廉；

2、制备工艺具有操作简单、提纯方法稳定可靠、容易控制及对设备要求低的特点；

3、提供了一个新的分离纯化GABA受体蛋白亲和配基的制备工艺，具有很大的应用前景和良好经济、社会效益。

附图说明

图1、氟虫腈亲和介质XPS图谱 

图2、氟虫腈亲和柱分离受体SDS-PAGE图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细、完整地说明。 

实施例1  氟虫腈亲和配基的制备方法 

产物A的合成：向100mL三口烧瓶中加入4.40 g（10 mmol）氟虫腈和30 mL CH₂Cl₂，在冰浴及氮气保护下加入2g 4-二甲氨基吡啶（DMAP）和4 mL三乙胺，搅拌30min后，滴加溴乙酰溴4 mL（约46 mmol），在室温下反应8h。将反应液倒入40 mL冰水中，用CH₂Cl₂（20 mL×3）萃取，合并有机相，无水MgSO₄干燥过夜，减压脱溶，经硅胶层析分离 [V_石油醚：V_乙酸乙酯=8:1] 得黄色固体A，产率70%，m.p. 167-169℃。

产物B的合成：向100mL三口烧瓶中加入2.32g（0.004mol）产物A、邻苯二甲酰亚胺钾盐7.4g（0.04mol）、四丁基溴化铵（TBAB）0.8g及40mL DMF，80℃下反应6h。将反应液倒入40 mL冰水中, 用CH₂Cl₂（20 mL×3）萃取，合并有机相，无水MgSO₄干燥过夜，减压脱溶，得产物B，产率65%。 

产物C（亲和配基）的合成：向100mL三口烧瓶中加入产物B 6.23g（0.01mol）和30ml乙醇，70℃，滴加1.18 g（0.02mol）85%水合肼，70℃下反应5h，溶液中有粉红色絮状物出现。 将反应液降温至室温，用乙醚（30 mL×3）萃取，合并有机相，用饱和食盐水洗至中性，无水Na₂SO₄干燥，减压脱溶，经硅胶层析分离 [V_石油醚：V_乙酸乙酯=6:1] 得浅黄色固体C，产率40%，m.p. 197-199℃。 

实施例2  氟虫腈亲和配基的制备方法 

产物A的合成：向100mL三口烧瓶中加入4.40 g（10 mmol）氟虫腈和30 mL CH₂Cl₂，在冰浴及氮气保护下加入2g 4-二甲氨基吡啶（DMAP）和4 mL三乙胺，搅拌30min后，滴加溴乙酰溴2.6 mL（约30 mmol），在室温下反应12h。将反应液倒入40 mL冰水中，用CH₂Cl₂（20 mL×3）萃取，合并有机相，无水MgSO₄干燥过夜，减压脱溶，经硅胶层析分离 [V_石油醚：V_乙酸乙酯=8:1] 得黄色固体A，产率70%，m.p. 167-169℃。

产物B的合成：向100mL三口烧瓶中加入2.32g（0.004mol）产物A、邻苯二甲酰亚胺钾盐3.7g（0.02mol）、四丁基溴化铵（TBAB）0.8g及40mL DMF，80℃下反应10 h。将反应液倒入40 mL冰水中, 用CH₂Cl₂（20 mL×3）萃取，合并有机相，无水MgSO₄干燥过夜，减压脱溶，得产物B，产率65%。 

产物C（亲和配基）的合成：向100mL三口烧瓶中加入产物B 6.23g（0.01mol）和30ml乙醇，70℃，滴加1.77 g（0.03mol）85%水合肼，70℃下反应3h，溶液中有粉红色絮状物出现。 将反应液降温至室温，用乙醚（30 mL×3）萃取，合并有机相，用饱和食盐水洗至中性，无水Na₂SO₄干燥，减压脱溶，经硅胶层析分离 [V_石油醚：V_乙酸乙酯=6:1] 得浅黄色固体C，产率41%，m.p. 197-199℃。 

实施例3 亲和层析介质的制备 

取洗净抽干的环氧基活化的Sepharose CL-6B凝胶5g，加入50mL圆底烧瓶中。将500 mg氟虫腈亲和配基，20 mL 0.1 mol/L碳酸钠缓冲液（pH 9.0）和5 mL DMSO加入反应瓶中，37℃水浴中振荡反应12 h（附图1）。将料液转移到砂芯漏斗中抽干，去离子水洗涤，加入1 mol/L 乙醇胺37℃振荡反应4 h；凝胶依次用去离子水、0.1 M pH 4.0含0.5 M NaCl的乙酸-乙酸钠缓冲液、去离子水和0.1 M pH 8.0 NaAc含0.5 M NaCl的硼酸-四硼酸钠缓冲液洗涤洗涤，水洗后抽干，即得到本发明的氟虫腈配基亲和层析介质，将制备好的凝胶于4℃储存在20%的乙醇中备用。 

实施例4亲和层析介质的制备 

取洗净抽干的环氧基活化的Sepharose CL-6B凝胶5g，加入50mL圆底烧瓶中。将1g氟虫腈亲和配基，20 mL 0.1 mol/L碳酸钠缓冲液（pH 9.0）和5 mL DMSO加入反应瓶中，25℃水浴中振荡反应24 h（ 附图1）。将料液转移到砂芯漏斗中抽干，去离子水洗涤，加入2 mol/L 乙醇胺25℃振荡反应10 h；凝胶依次用去离子水、0.1 M pH 4.0含0.5 M NaCl的乙酸-乙酸钠缓冲液、去离子水和0.1 M pH 8.0 NaAc含0.5 M NaCl的硼酸-四硼酸钠缓冲液洗涤洗涤，水洗后抽干，即得到本发明的氟虫腈配基亲和层析介质，将制备好的凝胶于4℃储存在20%的乙醇中备用。

实施例5  GABA受体的亲和层析分离纯化 

   取实施例2制备好的氟虫腈亲和层析介质10ml装入层析柱（Φ1.0 cm×10 cm）中，用100ml Buffer A（pH 7.5的10mM K₃PO₄，2 mM 醋酸镁，50 mM KCl，11% (w/v) 蔗糖，1 mM EGTA，0.3% (w/v) Triton X-100）平衡后，将含GABA受体蛋白浓缩液加入柱中孵育10 min后，使用Buffer B （pH 7.5的0.02M K₃PO₄，11% (w/v)蔗糖，2 mM 醋酸镁，0.3% (w/v)Triton X-100）冲洗，设定流速为40ml/h，洗出杂蛋白。再使用Buffer C (pH 7.5的0.01M K₃PO₄，10mM氟西泮，11% (w/v)蔗糖，2mM 醋酸镁，0.3% (w/v)Triton X-100)洗脱，流速为20ml/h，洗出目的蛋白（附图2）。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。