用于检测鸡体尺性状的试剂盒及鸡的分子育种方法

摘要

本发明公开了一种用于检测鸡体尺性状的试剂盒及鸡的分子育种方法，属于分子遗传学领域。本发明采用MassARRAY系统基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱技术结合单引物延伸反应，对固始鸡和安卡鸡F

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于检测鸡体尺性状的试剂盒，同时还涉及一种基于鸡miRNA-1658 基因单核苷酸多态性的分子育种方法，属于分子遗传学领域。

背景技术

随着社会经济的迅速发展和人们生活水平的提高，市场对肉质的需求整体上从以前的 数量要求转向了对质量风味的追求。生长性状、体尺性状、肉质性状和屠体性状是当今家 禽工业最关注的经济性状。大多数的经济性状属于数量性状，主要是由为数众多的微效基 因决定的，这些基因同时具有加性效应、显性效应和上位效应，复杂性状的遗传基础是由 影响该表型的遗传因素和环境因素以及它们之间的相互作用共同决定的。国内优质地方鸡 普遍存在生长速度缓慢的问题，从而影响了经济效益。因此，多年来研究人员试图通过大 量的试验寻找与鸡的相关经济性状相关的候选基因，为家禽分子选种育种方面提供辅助标 记选择。

应用分子标记的现代育种技术是加快良种选育和提高种群遗传品质的重要途径。应用 分子标记育种首先是在DNA水平上筛查和检测与鸡经济性状密切相关的遗传标记，其次 是建立其基因多态性的快速检测方法，然后实现遗传标记辅助选择和实现早期诊断选择。

单核苷酸多态(Single nucleotide polymorphism，SNP)是指在基因组水平上由于单个 核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP可以在DNA、RNA和蛋白质水平影响基 因的功能，是人类可遗传变异最常见的一种，占已知多态性的90％以上。对基因产物有影 响的SNP的功能进行分析，其意义十分重大。SNP多样性与经济性状的关联分析一直是畜 禽遗传学研究的热点。随着miRNA的发现及其研究的深入，研究者发现miRNA不仅参与 了动物复杂性状表型形成的分子调控过程，而且其SNP变化还可能导致miRNA功能异常， 进而引起生物表型性状的变异。miRNA相关多态的形成机制包括插入、缺失、易位、扩增 以及碱基替换。miRNA的多态性是影响miRNA调节功能的重要因素。单个miRNA表达 异常时，可能影响数百种靶基因的表达，当其中某些关键蛋白表达量降低时，会导致机体 生理功能异常和疾病发生。研究发现，发生在miRNA初级产物、前体及成熟体上的多态 性会潜在的影响数以百计基因的表达和通路，从而广泛影响miRNA的功能。

SNP多态性的检测方法，最常见的有单链构象多态技术(SSCP)、PCR-RFLP和直接 测序技术等。但SSCP操作繁琐、耗时长，影响因素多，且实验过程中存在假阴性问题， 所以并非理想的SNP检测手段；直接测序技术成本较高。许多研究运用了PCR-RFLP方法 或PCR与聚丙烯酰胺电泳检测相结合的方法。

MassARRAY系统进行SNP分型的基本原理是以基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (MALDI-TOF MS)技术结合单引物延伸反应，通过对核酸片段分子量直接鉴定而实现的。 引物序列经合成、稀释后首先进行多重PCR扩增，以增加单碱基延伸反应的模板，然后再 进行单碱基延伸反应，单碱基延伸反应中所用为ddNTP，因此延伸一个碱基后反应自动终 止。最后将延伸产物利用全自动点样机加到芯片上，通过MassARRAY进行质谱分型。 MASSARRAY平台检测SNP具有以下优势：准确可靠，直接对分子量进行检测，不涉及 荧光标记、凝胶电泳等，就能检测一个碱基的差异，准确性高，机器本身出错的概率非常 低，无需再次验证，也无需设计统计学重复。通量较高，可以适用于对几个到几百个SNP 位点的检测。检测时间短，利用质谱检测在40min内就可以完成对380个样本的检测，并 且实时显示检测结果。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测鸡体尺性状的试剂盒。

同时，本发明还提供一种基于鸡miRNA-1658基因单核苷酸多态性的分子育种方法。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：

用于检测鸡体尺性状的试剂盒，包括：

上游引物F PRimer：5’-ACGTTGGATGTTCTGCCATACCAGTGTGTG-3’(如SEQ ID NO.1所示)，

下游引物R PRimer：5’-ACGTTGGATGACTCCTCCAGCTGCTGCTTC-3’(如SEQ ID NO.2所示)；

单碱基延伸引物：5’-CATCAACACCAACCCA-3’(如SEQ ID NO.3所示)。

上述试剂盒还可以包括：10×buffer、Mg²⁺、dNTP、Hotstar、iPLEX终止反应Mix、单 碱基延伸酶、SAP buffer、SAP酶、ddd H₂O及DNA Marker等。试剂盒中各组分的添加量 可适当选取，如大于10次的用量。

一种基于鸡miRNA-1658基因单核苷酸多态性的分子育种方法，包括以下步骤：

1)提取鸡总DNA，加入引物进行PCR扩增；

2)加入单碱基延伸引物进行单碱基延伸反应，得反应产物；

3)反应产物经飞行质谱检测后，选留GG基因型的公母鸡个体，建立目标鸡群。

步骤1)中引物如下：

上游引物F PRimer：5’-ACGTTGGATGTTCTGCCATACCAGTGTGTG-3’，

下游引物R PRimer：5’-ACGTTGGATGACTCCTCCAGCTGCTGCTTC-3’；

步骤2)中单碱基延伸引物为：5’-CATCAACACCAACCCA-3’。

步骤1)中PCR扩增的反应体系为：总计5.0μl；10×buffer 0.5μl，25mM Mg²⁺0.4μl， 25mM dNTP 0.1μl，5U/μl Hotstar 0.2μl，10pmol/μl F Primer/R Primer各0.5μl，100ng/μl总 DNA 1.0μl，ddd H₂O 1.8μl。

步骤1)中PCR扩增的反应程序为：预变性95℃2min；95℃30s；56℃30s；72℃60s， 45个循环；72℃5min；25℃保温。

步骤1)中PCR扩增后一般需加入虾碱性磷酸酶(SAP)去除剩余的dNTP，SAP酶 消化为本领域常规技术。在本发明中，SAP酶消化体系为：总计2.0μl；SAP buffer 0.17μl， 1.7U/μl SAP酶0.3μl，ddd H₂O 1.53μl；SAP酶消化程序为：37℃40min，85℃5min，25℃ 保温。

步骤2)中单碱基延伸反应的反应体系为：总计2.0μl；10×buffer 0.2μl，反应浓度为 1×iPLEX终止反应Mix 0.2μl，7μM单碱基延伸引物0.94μl，反应浓度为1×iPLEX单碱基 延伸酶0.041μl，ddd H₂O 0.619μl。

步骤2)中单碱基延伸反应的反应程序为：预变性94℃30s；40个循环：94℃5s，52℃ 5s，80℃5s×5个内部循环，72℃3min；25℃保温。

步骤3)中反应产物先用树脂脱盐，再点样于芯片，芯片用基质辅助激光解吸附电离 飞行时间质谱检测。

本发明的有益效果：

本发明采用MassARRAY系统基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱技术结合单引物 延伸反应，对固始鸡和安卡鸡F₂代资源群样本进行miRNA-1658(rs16681031 C/G)单个 SNP位点基因分型检测，并与F₂代资源群体尺性状进行关联分析，结果表明鸡miRNA-1658 基因SNP单核苷酸多态性与鸡体尺性状显著关联，GG基因型有利于4周龄鸡的胸宽、骨 盆宽和体斜长显著增大，将其作为4周龄鸡体尺性状的辅助选择和分子遗传育种标记，可 快速建立遗传资源优良的鸡群。

附图说明

图1为鸡miRNA-1658基因的SNP测序图；

图2为SNP位点不同基因型的特征质谱图。

具体实施方式

下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。

实施例1

本实施例中用于检测鸡体尺性状的试剂盒，包括：

10pmol/μl上游引物F PRimer：5’-ACGTTGGATGTTCTGCCATACCAGTGTGTG-3’，

10pmol/μl下游引物R PRimer：5’-ACGTTGGATGACTCCTCCAGCTGCTGCTTC-3’；

7μM单碱基延伸引物：5’-CATCAACACCAACCCA-3’。

实施例2

本实施例中用于检测鸡体尺性状的试剂盒，除包含如下引物外，还包括：10×buffer、 25mM Mg²⁺、25mM dNTP、5U/μl Hotstar、反应浓度为1×iPLEX单碱基延伸酶、SAP buffer、 1.7U/μl SAP酶、ddd H₂O及DNA Marker；

10pmol/μl上游引物F PRimer：5’-ACGTTGGATGTTCTGCCATACCAGTGTGTG-3’，

10pmol/μl下游引物R PRimer：5’-ACGTTGGATGACTCCTCCAGCTGCTGCTTC-3’；

7μM单碱基延伸引物：5’-CATCAACACCAACCCA-3’。

试验例

一、鸡miRNA-1658基因单核苷酸多态性的检测，包括以下步骤：

1、动物材料：固始鸡和安卡鸡。

固始鸡属于我国黄鸡类型的一种优良地方品种，它以固始县为中心，在非凡的生态环 境和饲养条件下，经过长期闭锁繁衍而自然形成。固始鸡是蛋肉兼用型鸡种，具有优良的 性状：一是耐粗饲，抗病力强，适宜野外放牧散养；二是肉质细嫩，肉味鲜美，汤汁醇厚， 营养丰富，具有较强的滋补功效；三是母鸡产蛋较多，蛋大，蛋清较稠，蛋黄色深，蛋壳 厚，耐贮运。

安卡肉鸡是当今世界优良的肉用鸡种之一，也是目前国内生长速度最快的红黄羽肉 鸡，具有适应性强，耐应激，长速快，饲料报酬高等特点。

2、动物的培育：

所用固始鸡-安卡鸡资源群按F-2远缘半同胞设计方案组建，试验共建立7个家系，其 中正交系4个为安卡鸡♂×固始鸡♀，反交系3个为固始鸡♂×安卡鸡♀。F₀代是从蛋肉兼用 型固始鸡和肉用型安卡鸡纯系中分别选取种鸡，按公母鸡1:6比例配组而成，要求所选公 母鸡具有本品种特征，产蛋量高，体重中等，血统纯正，以保证F₁代个体在各个位点的杂 合。从每个家系的F₁后代中选留一只公鸡，按公母1:9比例与其他家系母鸡交配产生F₂代，要求与配公母鸡之间没有亲缘关系，F₁代的种用母鸡也尽量散布在各个家系中，选种 时尽量选择外貌表现丰富，呈现杂合的个体，保证F₂代性状产生较大分离。

3、饲养方法：

鸡群饲养于河南某大学试验鸡场，后期试验在河南某大学家禽遗传改良实验室完成。 各家系混群，笼养，自由采食，充足饮水。饲喂至12周龄，采血取样。0～12周龄，每隔 一周每只鸡均进行体尺性状和生长性状的测量并记录数据。

4、基因组DNA的提取及构建混池

以固始鸡-安卡鸡资源群体F2代鸡为材料，每只鸡颈静脉抽血5mL，EDTA抗凝 (10mmol/L Tris-Cl，0.2mmol/L EDTA，PH 8.0)，置-80℃保存。采用酚氯仿抽提法从F₂代资源群个体保存血样中提取基因组DNA，首先用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，然后 使用NanoDrop2000微量分光广度计测定DNA样品的纯度与浓度，不合格的DNA样品重 新抽提。随机选取100个个体的DNA样品构建DNA混池，进行筛选。

5、SNP位点的预测与分类注释

通过查询miRNA-SNiPer(http://www.integratomics-time.com/miRNA-SNiPer/)与dbSNP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)数据库，结合http://www.mirbase.org/数据库(20.0)对 筛选到的SNP进行分类注释。并从Genebank上获取相应miRNA的前体序列，通过Blast 确定SNPs在miRNA上的位置，同时从NCBI上分析miRNA在基因组上的位置。根据SNP 在miRNA上的位置分为位于前体、成熟体和种质区的MIRSNP，根据在基因上的位置分 为宿主基因和非宿主基因。注释标准：SNP分别位于miRNA的前体、成熟体等，是否有 宿主基因。

6、SNP的筛选引物

在NCBI下载目的miRNA(包括前体序列在内的前后500bp)，设计4对引物。在F₂代资源群体中随机选取100个个体构建混合DNA池，以DNA池为模版，用上述引物对进 行PCR扩增。PCR反应体系为：总计25.0μl；2×Taq PCR Master Mix(MBI)12.0μl、正向 引物(10pmol/l)1.0μl、反向引物(10pmol/l)1.0μl、DNA模板(100ng/μl)0.5μl、ddH₂O 10.5μl。PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，60.2℃退火30s，72℃延伸30s， 35个循环；72℃延伸10min。

PCR产物直接测序(上海生工)，根据测序峰是否有套叠峰判断是否为SNP。

引物对1：

上游引物：5’-CACTGCTGTTTACAAATCTATTACACTG-3’(如SEQ ID NO.4所示)，

下游引物：5’-TGACAAAGCTGCTTATAACTGCTTATAG-3’(如SEQ ID NO.5所示)；

引物对2：

上游引物：5’-CTTGTGAAGTTGCTCAGAGATTAAGTCAG-3’(如SEQ ID NO.6所示)，

下游引物：5’-CAGCTGGCCTCACAGGATTTACTATG-3’(如SEQ ID NO.7所示)；

引物对3：

上游引物：5’-TGTGACAAAGCTGCTTATAACTGCTTATAG-3’(如SEQ ID NO.8所示)，

下游引物：5’-TGTTTTTAATCTCGCCATTATACGCGCTGC-3’(如SEQ ID NO.9所示)；

引物对4：

上游引物：5’-GAGAGATCTTGGATTACAAG-3’(如SEQ ID NO.10所示)，

下游引物：5’-GTTCGTAGATACAAAGTAAG-3’(如SEQ ID NO.11所示)。

7、生物信息学分析鸡miRNA SNP

利用在线软件对http://www.mirbase.org/中鸡成熟的miRNA上的SNP进行分析，利 用miRNA-SNiPer(http://www.integratomics-time.com/miRNA-SNiPer/)与dbSNP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)数据库，鉴定到SNP ID为rs16681031，miR-1658的 SNP位点在前体区，第9条染色体(Chr9)。结合http://www.mirbase.org/数据库(20.0)， miR-1658SNP位点有宿主基因，宿主基因的名称为ENSGALT00000016730，GMPS-201 和intron 13。

8、固始鸡-安卡鸡群体中存在的SNP验证

采用混合DNA池法，固始鸡-安卡鸡F2的个体100个混为一个池，利用合成的4对 引物扩增，将产物直接测序，测序结果使用DNA STAR、BioXM(2.0)和primer 5.0进行 SNP分析。测序结果中有套叠峰的为存在突变位点，通过DNA池验证真实存在的鸡 miRNASNP，检测到miRNA-1658前体区+60C/G突变，测序图上的位置为133bp(见图1)。

二、miRNA SNP与经济性状的关联分析

1、试验动物

同试验一。

2、引物的设计与合成

针对miRNA-1658基因成熟体互补区上的突变位点(即rs16681031C/G)，设计与合 成的引物如下：

上游引物F PRimer：5’-ACGTTGGATGTTCTGCCATACCAGTGTGTG-3’，

下游引物R PRimer：5’-ACGTTGGATGACTCCTCCAGCTGCTGCTTC-3’；

单碱基延伸引物：5’-CATCAACACCAACCCA-3’；

退火温度Tm：46.7℃。

3、基因型分析

采用Sequenom MassARRay时间飞行质谱技术，对F₂代资源群不同个体进行基因分型， 应用MassARRay TypeR软件分析质谱图。该过程由北京海斯特临床研究所有限公司完成。

将纯化后的基因组DNA样品定量稀释为100ng/μl，每孔加1μl样品于384孔板上，然 后按照下面的反应体系和程序扩增，反应结束加入虾碱性磷酸酶(SAP)去除剩余的dNTP， 然后进行单碱基延伸反应，反应产物用树脂脱盐后，经自动点样仪点样于芯片，点样后的 芯片用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱检测。

a.PCR反应体系及反应程序设置

PCR反应体系如下表1所示：

表1 PCR总反应体系

PCR扩增反应程序如下：

预变性95℃2min；95℃30s；56℃30s；72℃60s，45个循环；72℃5min；25℃保 温。

b.SAP酶消化反应

SAP酶消化反应体系如下表2所示：

表2 SAP酶消化反应

在PCR仪中进行SAP酶消化，消化反应程序：37℃40min；85℃5min；25℃保温。

c.单碱基延伸反应

单碱基延伸反应体系如下表3所示：

表3 单碱基延伸反应体系

在PCR仪中进行单碱基延伸反应，反应程序：预变性94℃30s；40个循环：94℃5s， 52℃5s，80℃5s×5个内部循环，72℃3min；25℃保温。

d.树脂脱盐

反应产物用树脂脱盐20min，脱盐操作为：加入16μl水到延伸反应产物的对应孔内， 将清洁的松香树脂6mg加入到反应产物中，封膜，低速垂直旋转20min，使树脂与反应产 物充分接触，再3200r/min离心5min，使树脂沉入孔底部。利用全自动点样机将脱盐后的 样品从384孔板转移到sequenom公司的芯片上，完成点样操作。

e.反应产物的飞行质谱检测

利用飞行质谱仪器直接分析数据，进行miRNA-1658基因(rs16681031C/G)SNP位点 基因分型，得到GG、GC、CC三种基因型，不同基因型的特征质谱图见图2。

4、鸡miRNA-1658基因SNP位点的多态性频率统计分析

群体遗传多态性的分析：根据群体基因型数据通过Excel分析群体的遗传结构，估计 基因的多态信息含量(PIC)，群体杂合度(He)及有效等位基因数(Ne)。

等位基因频率是指一个群体中某一基因对其等位基因的相对比率，取值在0～1之间， 即：

等位基因频率＝某基因个数/群体中同一位点基因总数。

基因型频率是指群体中某一基因型个体数占群体总数的比率，即：

基因型频率＝某一基因型个体总数/该测定群体总数。

对F₂资源群体中miRNA-1658的位点C>G的基因型频率统计分析结果见下表4。结 果显示，在F₂资源群体中355只为CC基因型，298只为GC基因型，23只为GG基因型。 CC、GC和GG基因型频率分别为0.525、0.441和0.034。C和G等位基因的频率分别为 0.746和0.254。

鸡miRNA-1658(+60bpC>G)突变位点处于中度多态0.25<PIC<0.5，且有三种基因型， 突变位点的群体遗传多态信息参数统计结果为多态信息含量PIC(0.3072)，杂合度He (0.379)，有效等位基因数Ne(1.6104)，因此与资源群体的相关经济性状进行关联分析。

表4 miRNA-1658基因在F₂代资源群中基因型频率和基因频率

5、miRNA-1658SNP位点对miRNA二级结构的影响

使用Mfold在线软件，对miR-1658(+60bp C>G)等位基因的二级结构进行预测，SNP 引起能值改变。野生型能值(-34.6)，突变后能值(-36.1)，能值改变(1.5)，二级结构改 变。位于miR-1658(+60bpC>G)上的突变，在其miRNA的二级结构中产生新的膨大结 构，引起二级结构最低自由能的改变，导致二级结构稳定性的改变，预示这些SNP位点可 能影响其miRNA的加工过程。

6、鸡miRNA-1658基因SNP位点的多态性与鸡体尺性状的关联分析

关联分析模型：利用SPSS(20.0)软件分析基因SNP位点与鸡4周龄体尺性状的相 关性。确保每个性状数据呈正态分布，再利用最小二乘法分析对数据校正；根据数据特征， 利用一般线性模型，多变量分析基因型效应和LSD多重比较法比较各基因型间的差异，结 果见下表5。模型I为该位点多态性与4周龄体尺性状的关联分析模型，即：

Model I：y_ijlnkm＝μ+G_i+S_j+R_l+P_n+H_k+e_ijlnkm；

其中，y_ijlnkm为个体表型值；μ为总体均值；G_i为基因型固定效应；S_j为性别效应；R_l为正反交效应；P_l为家系效应；H_k为批次效应；e_ijlnkm为随机误差。

表5 鸡miRNA-1658基因SNP位点与鸡4周龄体尺性状之间的方差分析

注：具有相同字母表示差异不显著(P>0.05)，字母不同表示差异显著(P<0.05)。

由表5可知，4周龄鸡miRNA-1658SNP单核苷酸多态性与胸宽、体斜长和骨盆宽显 著关联，并且均表现为GG与GC、GG与CC差异显著，GG基因型有利于其胸宽、骨盆 宽和体斜长显著增大(P<0.05)。因此，选取鸡miRNA-1658基因SNP单核苷酸多态性中 的GG基因型作为4周龄鸡体尺性状的辅助选择和分子遗传育种标记。

本试验例首先进行miRNASNP位点的筛选及验证，以鸡全基因组DNA为模板，设计 引物扩增miRNA-1658前体在内的目的片段，纯化测序后获知鸡miRNA-1658基因第60 位存在C或G的碱基多态性；然后设计特定引物扩增含多态性位点的基因片段，并利用 MassARRAY系统基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱技术结合单引物延伸反应，对固 始鸡和安卡鸡F₂代资源群大量样本进行miRNA-1658(rs16681031C/G)单个SNP位点基 因分型检测，并与F₂代资源群体尺性状进行关联分析，结果表明鸡miRNA-1658基因SNP 单核苷酸多态性与鸡体尺性状显著关联，GG基因型有利于4周龄鸡的胸宽、骨盆宽和体 斜长显著增大(P<0.05)，将其作为鸡体尺性状的辅助选择和分子遗传育种标记，可快速 建立遗传资源优良的鸡群。该检测方法具有准确可靠、快速灵敏、节约成本等特点，可用 于鸡的辅助选择和分子育种，对提高鸡的体尺性状具有重要的作用。

实施例3

本实施例中基于鸡miRNA-1658基因单核苷酸多态性的分子育种方法，包括以下步骤：

1)总DNA的提取及PCR扩增

采用酚氯仿异戊醇法提取4周龄鸡外周血DNA，溶于适量TE(pH8.0)中，-20℃保 存备用，利用引物F Primer/R PRimer进行PCR扩增，得扩增产物；

上游引物F PRimer：5’-ACGTTGGATGTTCTGCCATACCAGTGTGTG-3’，

下游引物R PRimer：5’-ACGTTGGATGACTCCTCCAGCTGCTGCTTC-3’；

PCR扩增的反应体系为：总计5.0μl；10×buffer 0.5μl，25mM Mg²⁺0.4μl，25mM dNTP  0.1μl，5U/μl Hotstar 0.2μl，10pmol/μl F Primer/R Primer各0.5μl，100ng/μl总DNA 1.0μl， ddd H₂O 1.8μl；

PCR扩增的反应程序为：预变性95℃2min；95℃30s；56℃30s；72℃60s，45个 循环；72℃5min；25℃保温；

2)SAP酶消化

在扩增产物中加入SAP酶，消化去除剩余的dNTP；

SAP酶消化体系为：总计2.0μl；SAP buffer 0.17μl，1.7U/μl SAP酶0.3μl，ddd H₂O  1.53μl；

SAP酶消化程序为：37℃40min，85℃5min，25℃保温；

3)单碱基延伸反应

在SAP酶消化后的产物中加入单碱基延伸引物，得反应产物；

单碱基延伸引物：5’-CATCAACACCAACCCA-3’；

单碱基延伸反应的反应体系为：总计2.0μl；10×buffer 0.2μl，反应浓度为1×iPLEX终 止反应Mix 0.2μl，7μM单碱基延伸引物0.94μl，反应浓度为1×iPLEX单碱基延伸酶0.041μl， ddd H₂O 0.619μl；

单碱基延伸反应的反应程序为：预变性94℃30s；40个循环：94℃5s，52℃5s，80℃ 5s×5个内部循环，72℃3min；25℃保温；

4)飞行质谱检测

反应产物用树脂脱盐20min后，再用全自动点样机将其转移到芯片上，利用飞行质谱 仪器直接分析数据，进行miRNA-1658基因(rs16681031C/G)SNP位点基因分型，得到 GG、GC、CC三种基因型；

5)选定基因型鸡的育种

选留GG基因型的公母鸡个体，建立目标鸡群。

通过在DNA水平上筛查和检测与鸡体尺性状密切相关的分子遗传标记，可用于固始 鸡和安卡鸡的体尺性状的分子标记辅助选择，进而快速建立遗传资源优良的固始鸡和安卡 鸡种群。选择GG基因型的公母鸡个体留种，可增加鸡体尺性状选择的准确性，加快肉鸡 新品种育种进程，有效提高鸡的生产性能，获得显著的经济效益。