一类含塞克硝唑骨架的吡唑硝基咪唑衍生物、其制备方法及应用

摘要

本发明公开了一类含塞克硝唑骨架的吡唑硝基咪唑衍生物、其制备方法及应用，所述由塞克硝唑合成的吡唑硝基咪唑衍生物的结构如式所示，

说明书

技术领域

本发明属于药物化学领域，尤其涉及含塞克硝唑骨架的吡唑硝基咪唑衍生 物、其制备方法及应用。

背景技术

表皮生长因子受体和同源HER-2/ErbB-2蛋白激酶属于I型或者ErbB/HER 受体酪氨酸激酶家族，与细胞的增值、存活、黏附、迁移和分化有密切联系。 已已为在家族四名成员中最可行的抗肿瘤分子靶点，其他的分别是HER-3and  HER-4。在乳腺、卵巢、非小细胞肺癌中经常能发现表皮生长因子受体和HER- 2过度表达或者激活突变，使得它们成为这些癌症的治疗目标。表皮生长因子 受体以及HER-2成为当前研究热点，它们的过度表达以及异常激活通常能导致 细胞恶性转化。并且它们与术后不良、放疗和化疗耐受以及肿瘤血管生成有关。 EGFR和ErbB-2的封锁已被临床验证成为肿瘤治疗的一个有吸引力的方法。

在以前的研究中，塞克硝唑，一种硝基咪唑类药物，由于它对低氧肿瘤或 者实体肿瘤低氧区的分子标记的亲和力，已被广泛研究作为放射增敏剂使用。 2-硝基咪唑衍生物，比如米索硝唑、依他硝唑，已被报道具有有效的放射增敏 作用。在机制层面，硝基咪唑类衍生物表现出在肿瘤区渗透和积累的倾向，并 可以进行还原反应产生可以破坏蛋白质和核酸的亲电物质，这引起相当大的关 注。据我们所知，一些文献报告中描述的合成和具有EGFR抑制活性的化合物 在硝基咪唑环的2位修饰已被发表。很明显，塞克硝唑羟基和硝基的代谢活化 中发挥关键作用。塞克硝唑衍生物取代的羟基可能有希望成为开发新的，有效 的和安全的导向化合物。

发明内容

本发明的目的在于提供一类作为EGFR/HER-2抑制剂的含塞克硝唑骨架的 吡唑硝基咪唑衍生物、其制备方法及其在抗癌药物中的应用。

技术方案：一类含塞克硝唑骨架的吡唑硝基咪唑衍生物，其结构如式所示，

其中，R₁选自H、CH₃、Br、CF₃、OCH₃、NO₂、OCH₂CH₃、Cl、F、I。

一种制备含塞克硝唑骨架的吡唑硝基咪唑衍生物的方法，所述含塞克硝唑 骨架的吡唑硝基咪唑衍生物的结构如式所示，

其中，R₁选自H、CH₃、Br、CF₃、OCH₃、NO₂、OCH₂CH₃、Cl、F、I。

制备方法包括如下步骤：

步骤1.室温条件下，向反应容器中依次加入结构如式A所示的化合物， 结构如式B所示的化合物以及无水乙醇反应。然后迅速加入NaOH搅拌，TLC 跟踪反应，充分反应后，得到结构如式C所示的化合物。

步骤2.依次向反应容器中加入冰醋酸，水合肼以及结构如式C所示的化 合物，120℃回流，TLC跟踪反应，充分反应后，得到结构如式D所示的化合 物。

步骤3.依次向反应容器中加入二氯甲烷溶液，结构如式D所示的化合物， 塞克硝唑，以及催化剂EDC，DMAP。TLC跟踪反应，充分反应，得到结构如 式E所示的化合物。

式A～E中，R₁选自H、CH₃、Br、CF₃、OCH₃、NO₂、OCH₂CH₃、Cl、 F、I。

含塞克硝唑骨架的吡唑硝基咪唑衍生物在制备抗癌药物中的应用，其结构 如式所示

其中，R₁选自H、CH₃、Br、CF₃、OCH₃、NO₂、OCH₂CH₃、Cl、F、I。

一种抗癌药物，包括结构如式所示的化合物及医学上可接受的载体，

其中，R₁选自H、CH₃、Br、CF₃、OCH₃、NO₂、OCH₂CH₃、Cl、F、I。

本发明对人肝癌细胞(HEPG2)，人乳腺癌细胞(MCF-7)，人宫颈癌细 胞系(HeLa细胞)以及小鼠黑色素瘤细胞(B16-F10)有明显的抑制作用，因 此本发明的含塞克硝唑骨架的吡唑硝基咪唑衍生物可以应用于制备抗肿瘤药物。

具体实施方式

在某个具体的实施例中，本发明的制备过程和相关产物的结构式如下所述：

一种制备上述含塞克硝唑骨架的吡唑硝基咪唑衍生物的方法，它包括以下步骤：

步骤1.在室温下，向圆底烧瓶中加入20ml无水乙醇，再依次加入化合物 2a-j(5mmol)，4-甲酰基苯甲酸(5mmol)和NaOH/H₂O(1∶10)(5ml)， 在室温下搅拌8小时。形成沉淀物，滴加盐酸(1M)到反应溶液后滤出。从乙 醇中重结晶，并用冰冷水(25mL)三次洗涤，得到纯产物3a-j。

步骤2.向圆底烧瓶中加入冰醋酸20ml，再加入合成的化合物3a-j (1mmol)，与水合肼(4mmol)。在120℃下搅拌反应，回流12小时，得到 化合物4a-j。

步骤3.向圆底烧瓶中加入二氯甲烷溶液10ml，再加入合成的化合物4a-j (2mmol)，塞克硝唑(2mmol)，EDC·HCl(3mmol)和DMAP(1mmol)。 搅拌溶液56℃过夜，TLC跟踪反应，反应结束后，过滤，固体用蒸馏水洗涤， 最后真空干燥，将得到的固体溶于无水乙醇重结晶提纯得到目标化合物5a-j。

实施例一：1-(2-甲基-5-硝基咪唑)-2-丙基-4-(1-乙酰基-3-苯基-4，5-二氢 吡唑)苯甲酸甲酯(5a)的制备

在室温下，向圆底烧瓶中加入20ml无水乙醇，再依次加入化合物2a (5mmol)，4-甲酰基苯甲酸(5mmol)和NaOH/H₂O(1∶10)(5ml)，在室 温下搅拌8小时。形成沉淀物，滴加盐酸(1M)到反应溶液后滤出。从乙醇中 重结晶，并用冰冷水(25mL)三次洗涤，得到化合物3a。向干净的圆底烧瓶 中加入冰醋酸20ml，再加入上述合成的化合物3a(1mmol)，与水合肼 (4mmol)。在120℃下搅拌反应，回流12小时，得到化合物4a。向干净的圆 底烧瓶中加入二氯甲烷溶液10ml，再加入合成的化合物4a(2mmol)，塞克硝 唑(2mmol)，EDC·HCl(3mmol)和DMAP(1mmol)。搅拌溶液56℃过夜， TLC跟踪反应，反应结束后，过滤，固体用蒸馏水洗涤，最后真空干燥，将得 到的固体溶于无水乙醇重结晶提纯得到目标化合物。白色固体，产率62％， m.p.87～89℃；1H NMR(DMSO-d6，300MHz)δ：8.00(s，1H，CH)，7.84～7.77(m， 4H，ArH)，7.52～7.45(m，3H，ArH)，7.34(d，J＝5.70Hz，2H，ArH)，5.64～5.58(m，1H， CH)，5.48～5.41(m，1H，CH2)，4.71～4.64(m，1H，CH)，4.61～4.52(m，1H，CH2)， 3.96～3.85(m，1H，CH2)，3.21～3.13(m，1H，CH2)，2.44(t，J＝4.68Hz，3H，CH3)， 2.33(s，3H，CH3)，1.41(d，J＝4.77Hz，3H，CH3).ESI-MS：m/z 475.5(M+).

实施例二1-(2-甲基-5-硝基咪唑)-2-丙基-4-(1-乙酰基-3-(4-溴苯基)- 4，5-二氢吡唑)苯甲酸甲酯(5b)的制备

制备方法参考实施例一。白色固体，收率65％，m.p.104～107℃；1H NMR (DMSO-d6，300MHz)δ：8.00(s，1H，CH)，7.91(d，J＝6.12Hz，1H，ArH)，7.80(d， J＝6.27Hz，1H，ArH)，7.76～7.71(m，2H，ArH)，7.68(d，J＝6.51Hz，2H，ArH)， 7.36～7.30(m，2H，ArH)，5.65～5.58(m，1H，CH)，5.49～5.41(m，1H，CH2)，4.70～4.64 (m，1H，CH)，4.61～4.52(m，1H，CH2)，3.94～3.84(m，1H，CH2)，3.21～3.13(m，1H， CH2)，2.44(t，J＝4.36Hz，3H，CH3)，2.32(s，3H，CH3)，1.41(d，J＝4.95Hz，3H，CH3). ESI-MS：m/z 554.4(M+).

实施例三：1-(2-甲基-5-硝基咪唑)-2-丙基-4-(1-乙酰基-3-(4-(三氟甲 基)苯基)-4，5-二氢吡唑)苯甲酸甲酯(5c)的制备

制备方法参考实施例一。奶油色固体，产率64％，m.p.105～107℃；1H  NMR(DMSO-d6，300MHz)δ：7.99(t，J＝3.15Hz，3H，CH and ArH)，7.86～7.77(m， 4H，ArH)，7.34(d，J＝6.18Hz，2H，ArH)，5.67～5.62(m，1H，CH)，5.48～5.39(m，1H， CH2)，4.69～4.63(m，1H，CH)，4.60～4.51(m，1H，CH2)，3.98～3.88(m，1H，CH2)， 3.26～3.18(m，1H，CH2)，2.43(d，J＝2.73Hz，3H，CH3)，2.33(s，3H，CH3)，1.40(d， J＝4.89Hz，3H，CH3).ESI-MS：m/z 543.5(M+).

实施例四：1-(2-甲基-5-硝基咪唑)-2-丙基-4-(1-乙酰基-3-(4-甲氧基苯 基)-4，5-二氢吡唑)苯甲酸甲酯(5d)的制备

制备方法参考实施例一。奶油色结晶，产率70％，m.p.92～93℃；1H NMR (DMSO-d6，300MHz)δ：8.00(s，1H，CH)，7.80(d，J＝6.36Hz，2H，ArH)，7.73(d， J＝6.15Hz，2H，ArH)，7.35～7.30(m，2H，ArH)，7.03(d，J＝6.50Hz，2H，ArH)， 5.61～5.55(m，1H，CH)，5.51～5.39(m，1H，CH2)，4.70～4.64(m，1H，CH)，4.61～4.52 (m，1H，CH2)，3.90～3.84(m，1H，CH2)，3.81(s，3H，CH3)，3.17～3.09(m，1H，CH2)， 2.44(d，J＝3.09Hz，3H，CH3)，2.30(s，3H，CH3)，1.41(d，J＝4.83Hz，3H，CH3).ESI- MS：m/z 505.5(M+).

实施例五：1-(2-甲基-5-硝基咪唑)-2-丙基-4-(1-乙酰基-3-(4-硝基苯基) -4，5-二氢吡唑)苯甲酸甲酯(5e)的制备

制备方法参考实施例一。奶油色固体，产率68％，m.p.197～199℃；1H  NMR(DMSO-d6，300MHz)δ：8.32(d，J＝6.45Hz，2H，ArH)，8.07～7.99(m，3H，CH  and ArH)，7.81(d，J＝6.24Hz，2H，ArH)，7.36(d，J＝6.12Hz，2H，ArH)，5.72～5.63(m， 1H，CH)，5.49～5.41(m，1H，CH2)，4.70～4.64(m，1H，CH)，4.61～4.52(m，1H，CH)， 4.01～3.92(m，1H，CH2)，3.29～3.22(m，1H，CH2)，2.44(t，J＝4.2Hz，3H，CH3)，2.36 (s，3H，CH3)，1.41(d，J＝4.77Hz，3H，CH3)..ESI-MS：m/z 520.5(M+).

实施例六：1-(2-甲基-5-硝基咪唑)-2-丙基-4-(1-乙酰基-3-对甲苯基-4，5- 二氢吡唑)苯甲酸甲酯(5f)的制备

制备方法参考实施例一。白色固体，产率68％，m.p.102～103℃；1H NMR (DMSO-d6，300MHz)δ：8.00(s，1H，CH)，7.80(d，J＝6.27Hz，2H，ArH)，7.68(d， J＝6.12Hz，2H，ArH)，7.33(d，J＝6.32Hz，2H，ArH)，7.29(d，J＝6.57Hz，2H，ArH)， 5.63～5.56(m，1H，CH)，5.48～5.39(m，1H，CH2)，4.70～4.64(m，1H，CH)，4.61～4.52 (m，1H，CH2)，3.92～3.82(m，1H，CH2)，3.17～3.10(m，1H，CH2)，2.44(d，J＝3.10Hz， 3H，CH3)，2.36(s，3H，CH3)，2.31(s，3H，CH3)，1.41(d，J＝4.89Hz，3H，CH3).ESI- MS：m/z 489.5(M+).

实施例七：1-(2-甲基-5-硝基咪唑)-2-丙基-4-(1-乙酰基-3-(4-氯苯基)- 4，5-二氢吡唑)苯甲酸甲酯(5g)的制备

制备方法参考实施例一。白色固体，收率72％，d，J＝6.27Hz，2H，ArH)， 7.34(d，J＝6.06Hz，2H，ArH)，5.65～5.58(m，1H，CH)，5.49～5.40(m，1H，CH2)， 4.71～4.63(m，1H，CH)，4.62～4.52(m，1H，CH2)，3.93～3.84(m，1H，CH2)，3.21～3.13 (m，1H，CH2)，2.44(d，J＝2.43Hz，3H，CH3)，2.32(s，3H，CH3)，1.41(d，J＝4.77Hz， 3H，CH3).ESI-MS：m/z 509.9(M+).

实施例八：1-(2-甲基-5-硝基咪唑)-2-丙基-4-(1-乙酰基-3-(4-氟苯基)- 4，5-二氢吡唑)苯甲酸甲酯(5h)的制备

制备方法参考实施例一。白色固体，产率70％，m.p.88～90℃；1H NMR (DMSO-d6，300MHz)δ：7.99(s，1H，CH)，7.87～7.82(m，2H，ArH)，7.80(d，J＝6.24 Hz，2H，ArH)，7.32(t，J＝6.72Hz，4H，ArH)，5.64～5.58(m，1H，CH)，5.50～5.40(m， 1H，CH2)，4.71～4.63(m，1H，CH)，4.61～4.52(m，1H，CH2)，3.95～3.83(m，1H，CH2)， 3.21～3.13(m，1H，CH2)，2.44(d，J＝2.88Hz，3H，CH3)，2.32(s，3H，CH3)，1.41(d， J＝4.95Hz，3H，CH3).ESI-MS：m/z 493.5(M+).

实施例九：1-(2-甲基-5-硝基咪唑)-2-丙基-4-(1-乙酰基-3-(4-碘苯基)- 4，5-二氢吡唑)苯甲酸甲酯(5i)的制备

制备方法参考实施例一。白色固体，产率58％，m.p.117～119℃；1H NMR (DMSO-d6，300MHz)δ：7.99(s，1H，CH)，7.84(d，J＝6.12Hz，2H，ArH)，7.79(d， J＝6.24Hz，2H，ArH)，7.55(d，J＝6.18Hz，2H，ArH)，7.32(d，J＝5.86Hz，2H，ArH)， 5.63～5.56(m，1H，CH)，5.49～5.39(m，1H，CH2)，4.71～4.62(m，1H，CH)，4.60～4.51 (m，1H，CH2)，3.91～3.81(m，1H，CH2)，3.17～3.09(m，1H，CH2)，2.42(d，J＝2.64Hz， 3H，CH3)，2.30(s，3H，CH3)，1.40(d，J＝4.83Hz，3H，CH3).ESI-MS：m/z 601.4 (M+).

实施例十：1-(2-甲基-5-硝基咪唑)-2-丙基-4-(1-乙酰基-3-(4-乙氧基苯 基)-4，5-二氢吡唑)苯甲酸甲酯(5j)的制备

制备方法参考实施例一。淡黄色固体，产率59％，m.p.92～94℃；1H NMR (DMSO-d6，300MHz)δ：8.00(s，1H，CH)，7.80(d，J＝6.21Hz，2H，ArH)，7.71(d， J＝6.60Hz，2H，ArH)，7.32(d，J＝6.42Hz，2H，ArH)，7.00(d，J＝6.55Hz，2H，ArH)， 5.61～5.55(m，1H，CH)，5.49～5.41(m，1H，CH2)，4.70～4.64(m，1H，CH)，4.60～4.52 (m，1H，CH2)，4.08(q，J＝5.25Hz，2H，CH2)，3.90～3.79(m，1H，CH2)，3.17～3.08(m， 1H，CH2)，2.44(t，J＝4.79Hz，3H，CH3)，2.30(s，3H，CH3)，1.41(d，J＝4.74Hz，3H， CH3)，1.34(t，J＝5.24Hz，3H，CH3).ESI-MS：m/z 519.5(M+).

实施例十一：含塞克硝唑骨架的吡唑硝基咪唑衍生物的体外抗癌活性研究 进展

采用MTT[3-(4，5)-双甲基-2-噻唑-(2，5)-苯基溴化四氮唑蓝]法来测定含塞克 硝唑骨架的吡唑硝基咪唑衍生物对人肝癌细胞(HEPG2)，人乳腺癌细胞 (MCF-7)，人宫颈癌细胞系(HeLa细胞)以及小鼠黑色素瘤细胞(B16-F10) 的抑制率达到50％时的药物浓度(half maximal inhibitory concentration，IC₅₀)。

(1)培养液的配制：DMEM(基础培养基)89％，胎牛血清10％，青霉素链 霉素溶液(10000IU/mL，10000μg/mL)1％。

(2)四种贴壁癌细胞的培养：利用上述培养液(培养液体积约为培养瓶容 量的1/10)，在37℃，5％CO₂培养箱中培养，根据癌细胞的生长状态判断传 代时间。

(3)不同浓度药物的配制：利用三蒸水(少量DMSO助溶)配制储备液， 加药后的每孔细胞悬液中DMSO的终浓度一般不超过0.05％-0.1％；用三蒸水把 储备液稀释至六个浓度梯度(10μg/mL，2μg/mL，0.4μg/mL，0.08μg/mL， 0.016μg/mL，0.003μg/mL)；保存于-20℃冰箱中备用。

(4)细胞孵育：取对数生长期肿瘤细胞，调细胞悬液浓度为1-1.5×105 /mL，混匀后加入96孔培养板中(100μL/孔)，在37℃，5％CO₂培养箱中 培养24h。

(5)加药：将稀释好的不同浓度梯度的药物分别加入到96孔培养板中， 每个浓度梯度设3个平孔，继续培养48h。实验分为实验组(培养液、细胞、 药物)、对照组(培养液和细胞)和空白组(只有培养液)。

(6)存活细胞检测：在培养了48h后的96孔板中，加MTT(5mg/mL) 10μL/孔；在37℃放置4h后，移除上清液，加DMSO 150μL/孔，振荡至 formazan结晶全部溶解；利用自动酶标仪在570nm波长处检测各孔的光密度 (OD值)。

抑制率的计算：

生长抑制率＝(1-存活率)×100％＝[1-(OD实验-OD空白)/(OD对照- OD空白)]×100％(OD实验表示实验组的平均光密度，OD对照表示对照组的 平均光密度，OD空白表示空白组的平均光密度)。

根据药物浓度-细胞生长抑制率的标准曲线，求其IC₅₀。

本发明所列含塞克硝唑骨架的吡唑硝基咪唑衍生物对肿瘤细胞的抑制IC₅₀值(μmol/mL)见下表

从上述实验可知：本发明对人肝癌细胞(HEPG2)，人乳腺癌细胞(MCF- 7)，人宫颈癌细胞系(HeLa细胞)以及小鼠黑色素瘤细胞(B16-F10)有明显 的抑制作用，与对照组相比，活性明显提高。

实施例十二：含塞克硝唑骨架的吡唑硝基咪唑衍生物体外抗肿瘤活性关于 细胞毒性的研究

本发明测试了新合成化合物5c，5e对人肾上皮细胞(293T)的细胞毒性， 细胞毒性结果如下表，每个化合物的毒性用抑制T细胞存活率到50％时的浓度 (CC₅₀)来表示。

实验方法：

(1)培养人肾上皮细胞(293T)直至达到其对数生长期末细胞趋于融合，用 细胞消化液消化分散细胞，用细胞培养液配制成1×104个/mL的细胞悬液。取 96孔培养板，每孔中加入100μL的细胞悬液。轻轻水平转动培养板使细胞均 匀地分散在皿孔的表面。

(2)置于含5％CO₂细胞培养箱中，在37±2℃温度下培养24h。弃去原培 养液，每孔加入100μL的空白对照液，阴性对照液，阳性对照液，100％和50％ 浓度的试验样品浸提液。每组至少设8孔。注：浸提原液或以培养基作稀释剂 的系列浸提稀释液。采用0.9％氯化钠注射液浸提时，在稀释浸提时使用浓缩的 2倍培养基。

(3)置于含5％CO₂培养箱中，在37±2℃温度下进行培养。培养48h。

(4)每个培养间期后，每孔加入MTT溶液20μL，置于含5％CO₂培养箱中， 在37±2℃温度下培养5h。

(5)弃去孔内液体，每孔分别加入200μL DMSO，将培养板放置10min， 水平摇晃使孔内溶液颜色均匀。

(6)用酶标仪测定吸光度，波长采用570nm。

测得的CC₅₀见下表所示。

从上述实验可知：本发明对人肾上皮细胞(293T)表现出了相当或者优于 阳性对照药物的细胞毒性，可以用于制取抗肿瘤药物。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施 方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进 行多种等同变换，这些等同变换均属于本发明的保护范围。另外需要说明的是， 在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以 通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的 组合方式不再另行说明。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行 任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。