一种用于霍乱弧菌实时荧光定量PCR检测的多核苷酸、方法和试剂盒

摘要

本发明公开了一种用于霍乱弧菌实时荧光定量PCR检测的多核苷酸、方法和试剂盒。具体地，本发明提供了能够用于霍乱弧菌PCR检测的多核苷酸以及与之相配合的引物对，采用合适的骨架质粒将所述多核苷酸序列制备为标准质粒分子PLW07，并配合本发明的引物对进行实时荧光PCR检测，具有极佳的特异性和灵敏度，并且稳定性良好。

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物工程技术领域的质粒分子，具体涉及一种适用于霍乱 弧菌实时荧光定量PCR检测的质粒标准分子及其构建方法、定量方法和应用。

背景技术

霍乱弧菌(Vibrio cholerae)是能引起一类以腹泻为主要症状的烈性传染病 的一种致病菌，霍乱弧菌的快速准确鉴定，对该病的预防和治疗有着重要作用。长 期以来人们发现，0l群霍乱弧菌能够引起霍乱的流行。0139群霍乱作为新发传染 病，1992年在印度和孟加拉国引起霍乱大流行。1993年以来在我国许多地区也不 同程度出现0139群霍乱弧菌引起的疫情，近几年来，0139群霍乱暴发的比例仍然 在不断上升。O1群和O139群霍乱弧菌的致病性取决于其菌株与毒素相关的编码产 物，如霍乱弧菌毒素共调菌毛(TCP)，毒素表达调控蛋白(toxR)等。霍乱的检测方 法包括生化培养、血清学试验及噬菌体分型等，这些方法存在着检出率偏低，检查 时间长的缺点，往往达不到疫情控制的需要。荧光定量PCR方法则可以快速、灵敏 地根据霍乱弧菌的特异基因序列的检出情况，在几小时内即可完成菌株的检出。质 粒DNA标准物质是一种含有检测目的基因的特异性片段的重组质粒分子，在PCR 定性检测中可以作为阳性对照，在PCR定量分析中可以作为定量分析的标准品，构 建定量分析的标准曲线。目前质粒DNA分子作为基因检测的标准物质得到了越来越 多的深入研究和应用，但是针对霍乱弧菌实时荧光PCR检测方法的质粒DNA标准物 质还是空白。在实际霍乱弧菌实时荧光PCR时，各单位使用的多是自行设计构建的 质粒DNA分子作为标准品，其中的目的基因特异性片段各不相同，同时缺乏统一的 定值方法，质粒DNA分子定值准确度差，造成各实验室之间的检测结果差异极大， 缺乏可比性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于霍乱弧菌实时荧光定量PCR检测的多核苷 酸、方法和试剂盒。

本发明的第一方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含霍乱 弧菌毒力调控子toxR的基因序列。

在另一优选例中，所述霍乱弧菌毒力调控子toxR的基因序列选自下组：

(a)序列如SEQ ID NO.:1所示的多核苷酸序列；

(b)核苷酸序列与SEQ ID NO.:1所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％) 的多核苷酸序列；

(c)序列与SEQ ID NO.:1所示多核苷酸完全匹配或完全互补并且长度为 100bp-654bp(较佳地150-645bp，更佳地200-500bp)的多核苷酸序列；

(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。

在另一优选例中，所述所述多核苷酸的序列选自下组：

(a)序列如SEQ ID NO.:2或SEQ ID NO.:1所示的多核苷酸序列；

(b)核苷酸序列与SEQ ID NO.:2或SEQ ID NO.:1所示序列的同源性≥ 95％(较佳地≥98％)的多核苷酸序列；

(c)与(a)-(b)任一所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。

本发明的第二方面，提供了一种分离的DNA构建物，所述DNA构建物中包 含本发明的第一方面所述的多核苷酸，以及任选的标签序列、酶切序列、启动 子序列和/或载体序列。在本发明的一个优选地实施方式中，在本发明第一方面 所述的多核苷酸两端设有线性酶切位点。

在另一优选例中，所述DNA构建物为线性DNA构建物或环状DNA构建物。

在另一优选例中，所述DNA构建物为质粒或表达载体。

在另一优选例中，所述的质粒或表达载体作为霍乱弧菌检测的标准分子(质 粒标准分子)。

在另一优选例中，所述DNA构建物为质粒或表达载体，并且所述质粒或表 达载体的骨架质粒选自下组：pUC19，pUC18，pUC118，pUC119，pBlueScript  II SK和pGEM。

在另一优选例中，所述质粒的序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明的第三方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒中包括本发明第一方 面所述的多核苷酸或者本发明第二方面所述的DNA构建物。

在另一优选例中，所述试剂盒中还包括选自下组的引物序列：

(1)SEQ ID NO.:3和SEQ ID NO.:4所示的引物序列；

(2)SEQ ID NO.:5和SEQ ID NO.:6所示的引物序列；

(3)SEQ ID NO.:7和SEQ ID NO.:8所示的引物序列；和

(4)SEQ ID NO.:9和SEQ ID NO.:10所示的引物序列。

在另一优选例中，所述试剂盒中还包括SEQ ID NO.:11所示的探针序列。

本发明的第四方面，提供了如本发明第一方面所述的多核苷酸、本发明第 二方面所述的DNA构建物或本发明第三方面所述的试剂盒的用途，用于霍乱弧 菌的检测。

在另一优选例中，所述检测为非诊断或治疗目的。

在另一优选例中，所述检测为荧光定量PCR检测。

本发明的第五方面，提供了一种霍乱弧菌实时荧光定量PCR检测方法，所 采用的标准物质是本发明第一方面所述的多核苷酸或本发明第二方面所述的 DNA构建物。

在另一优选例中，所述方法中采用的引物对选自下组：

(1)SEQ ID NO.:3和SEQ ID NO.:4所示的序列构成的引物对；

(2)SEQ ID NO.:5和SEQ ID NO.:6所示的序列构成的引物对；和

(3)SEQ ID NO.:7和SEQ ID NO.:8所示的序列构成的引物对。

在另一优选例中，所述方法中使用的探针序列如SEQ ID NO.:11所示。

本发明的第六方面，提供了一种多核苷酸产品，所述产品包括：

(i)霍乱弧菌标准品，所述的标准品选自：本发明第一方面所述的多核苷 酸和本发明第二方面所述的DNA构建物；

(ii)特异性扩增霍乱弧菌序列的引物对，所述引物对选自下组：

(1)SEQ ID NO.:3和SEQ ID NO.:4所示的序列构成的引物对；

(2)SEQ ID NO.:5和SEQ ID NO.:6所示的序列构成的引物对；和

(3)SEQ ID NO.:7和SEQ ID NO.:8所示的序列构成的引物对。

在另一优选例中，所述的产品为多核苷酸的组合(combination)，较佳地所 述组分(i)和(ii)是各自独立的。

在另一优选例中，所述的产品为试剂盒形式。

在另一优选例中，所述的产品中还包括SEQ ID NO.:11所示的探针序列。

本发明的第七方面，提供了一种霍乱弧菌的质粒标准分子的制备方法，其 特征在于，包括以下步骤：

①人工合成霍乱弧菌的毒力调控子toxR基因序列，所述毒力调控子toxR表 达基因序列如序列表中SEQ ID NO：1所示；

②将步骤①所得霍乱弧菌的毒力调控子toxR表达基因序列克隆至克隆载 体上，得到霍乱弧菌的质粒标准分子。

在另一优选例中，所述步骤②中所述克隆载体为质粒pUC19，pUC18， pUC118，pUC119，pBlueScript II SK或pGEM；优选地，步骤②所述克隆载体 为pUC19。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施 例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技 术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1是本发明质粒标准分子PLW07的图谱。

图2是本发明所得质粒标准分子PLW07稳定性检测结果图。

图3是利用本发明质粒标准分子建立的实时荧光PCR标准曲线。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，获得一段能够用于霍乱弧菌PCR检测的 多核苷酸序列以及与之相配合的引物对，实验结果表明，采用合适的骨架质粒 将所述多核苷酸序列制备为标准质粒分子，并配合本发明的引物对进行实时荧 光PCR检测，具有极佳的特异性和灵敏度，并且稳定性良好。

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有的霍乱弧菌实时荧光PCR检测 方法中缺乏阳性标准品和阳性标准品配置的问题，提供了一种适用于霍乱弧菌 实时荧光PCR检测的质粒标准分子以及该质粒标准分子的构建方法、定量方法 和应用。

实时荧光PCR检测霍乱弧菌的原理

采用实时荧光PCR技术可特异性扩增霍乱弧菌基因组DNA中毒力调控子 toxR基因序列，设计针对以上靶基因的引物和两端标记荧光的探针，扩增测试 样品DNA。实时荧光PCR可以通过检测荧光信号的增加来实时监测PCR产物。 与此同时，用相同的引物、探针和条件扩增已知浓度的阳性标准物质(或阳性 标准分子)。PCR方法中，阳性标准物质(或阳性标准分子)可以作为阳性对 照；实时荧光PCR中，阳性标准物质(或阳性标准分子)可以构建稳定的标准 曲线，根据标准曲线可分别计算出样品中对应基因的绝对含量(拷贝数或浓 度)。

标准物质

标准物质是具有一种或多种足够均匀和很好确定了的特性值，用以校准设 备，评价测量方法或给材料赋值的材料或物质。

质粒标准分子

本发明中，所述的霍乱弧菌的特异性序列是霍乱弧菌毒力调控子toxR基 因的一部分，长度为885bp。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一为：一种霍乱弧菌的质 粒标准分子，该质粒标准分子包含霍乱弧菌毒力调控子toxR基因序列，所述 霍乱弧菌毒力调控子toxR基因序列如序列表中SEQ ID NO：1所示：

本发明的质粒标准分子，较佳地分别含有霍乱弧菌的PCR检测的靶基因霍 乱弧菌毒力调控子toxR基因序列。

本发明中所述的霍乱弧菌毒力调控子toxR基因，在DNA、RNA和蛋白质的 合成中起作用，它可作为霍乱弧菌检测的一种靶基因，所述霍乱弧菌毒力调控 子toxR基因的序列较佳的如SEQ ID NO：1所示。

本发明所述的质粒标准分子的序列较佳的如SEQ ID NO：2所示，其中第 423位到第1307位为toxR基因序列：

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之二为：一种如上所述霍乱 弧菌的质粒标准分子的定量方法，其包括以下步骤：

①提取质粒标准分子；

②根据步骤①所得的质粒标准分子的碱基组成和序列长度，计算质粒标准 分子中的磷元素的含量；

③配制梯度浓度的磷标准溶液，并用此标准溶液作出高分辨电感耦合等离 子体发射质谱的标准曲线；

④高分辨电感耦合等离子体发射质谱检测质粒标准分子溶液，并根据步骤 ③所得的标准曲线得出质粒标准分子溶液的磷含量；

⑤根据步骤④所得的质粒标准分子溶液的磷含量和步骤②所得的质粒标 准分子中的磷元素的含量，计算出质粒标准分子的浓度。

其中步骤所述③高分辨电感耦合等离子体发射质谱检测的条件如下：冷却 气流量较佳地为10L/min～25L/min，最佳地为16.86L/min，辅助气流量较佳 地为0.5L/min～3.0L/min，最佳地为0.88L/min，雾化气流量为较佳地为0.5 L/min～2.43L/min，更佳地为1.123L/min，功率较佳地为1200W～1400W，最 佳地为1350W。

本发明所述质粒标准分子的定量方法较佳地包括紫外分光光度法和高分 辨电感耦合等离子体质谱(HR-ICP-MS)。

具体实施说明：

本发明所述质粒标准分子的定量方法较佳地包括紫外分光光度法和高分 辨电感耦合等离子体质谱(HR-ICP-MS)。

其中紫外分光光度法对质粒标准分子定量方法较佳地包括以下步骤：

①提取质粒标准分子；

②用TE缓冲液使紫外分光光度计校正为零点；

③取适量DNA(根据仪器的需要)至比色杯中(nanodrop直接点在检测区 域)，记录仪器读数。

④若可直接读出DNA浓度则直接记录；若不可，则记录样品在260nm和 280nm的光密度，DNA样品的浓度为OD260×核酸稀释倍数×50，浓度单位为 ng/μL。

(2)HR-ICP-MS对质粒标准分子定量方法较佳地包括以下步骤：

①提取质粒标准分子；

②根据质粒标准分子的碱基组成和序列长度，分别计算各质粒标准分子的 磷元素的含量；

③配制梯度浓度的磷标准溶液，并用此标准溶液作出HR-ICP-MS的标准曲 线。

④HR-ICP-MS检测质粒标准分子，并根据标准曲线得出质粒标准分子的磷 含量。

⑤根据质粒标准分子的磷含量计算出质粒标准分子的浓度。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之三为：一种霍乱弧菌实时 荧光定量PCR检测方法，其所采用的标准物质是如上所述的质粒标准分子。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之四为：一种如上所述的霍 乱弧菌的质粒标准分子的制备方法，包括以下步骤：

①人工合成霍乱弧菌的毒力调控子toxR基因序列，所述毒力调控子toxR 基因序列如序列表中SEQ ID NO：1所示；

②将步骤①所得霍乱弧菌的毒力调控子toxR基因序列克隆至克隆载体上， 得到霍乱弧菌的质粒标准分子。

其中步骤①所述的人工合成的方法较佳地为：全基因合成或者PCR引物扩 增的方法获得该序列。

本发明所述质粒标准分子构建方法较佳地包括以下步骤：

①NCBI(美国国立生物技术信息中心)的Genbank中查询霍乱弧菌的毒力 调控子toxR基因；

②对上述序列进行分析，选择合适的序列和合适的酶切位点，并将酶切位 点加至所选择序列的5’端和3’端。

③将处理后的序列进行全基因人工合成服务，包括单链Oligo DNA的合成、 DNA片段拼接等工作，并将全长基因克隆至质粒载体中，获得质粒标准分子。

所述的质粒载体可以是任何常规载体，较佳的是克隆载体，更佳的是能够 在大肠杆菌中增殖的克隆载体，所述克隆载体较佳地为：pUC19，pUC18，pUC118， pUC119，pBlueScript II SK或pGEM系列载体，优选地为pUC19克隆载体。

④测序验证质粒标准分子的序列。

⑤质粒标准分子的实时荧光PCR检测方法验证。

所述的实时荧光PCR检测方法验证，是指检测质粒标准分子在进行实时荧 光PCR分析时的特异性和构建标准曲线能力等特性，以鉴定该质粒标准分子作 为实时荧光PCR方法检测霍乱弧菌的标准物质的能力。

本发明还提供了用于上述方法的试剂盒，该试剂盒中包含了本发明的多核 苷酸或者DNA构建物，以及选自下组的引物序列：

(1)SEQ ID NO.:3和SEQ ID NO.:4所示的引物序列；

(2)SEQ ID NO.:5和SEQ ID NO.:6所示的引物序列；

(3)SEQ ID NO.:7和SEQ ID NO.:8所示的引物序列；

(4)SEQ ID NO.:9和SEQ ID NO.:10所示的引物序列；以及任选地SEQ ID  NO.:11所示的探针序列。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明 各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的主要优点在于：

(1)包含本发明多核苷酸序列的质粒标准分子具有均匀性强，稳定性高的 优点，同时本发明解决了霍乱弧菌实时荧光PCR检测中标准物质缺乏的难题， 保证霍乱弧菌实时荧光PCR方法检测结果的可比性，为霍乱弧菌实时荧光PCR 方法检测提供质量控制；

(2)使用本发明的质粒标准分子配合本发明的引物对制备的产品，用于实 时荧光PCR检测霍乱弧菌时，特异性强，灵敏度高，线性稳定。

下面结合具体实施例，进一步陈述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方 法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold  Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建 议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1质粒标准分子的构建

实验试剂和实验仪器：

质粒大量提取试剂盒(OMEGA)，其它生化试剂均为进口分装或国产分析 纯生化试剂；实验仪器包括离心机、恒温水浴锅、恒温培养摇床、移液枪等。

实验方法包括以下步骤：

1、在GenBank中搜索霍乱弧菌的基因毒力调控子toxR基因序列，

2、对上述序列进行分析，选择合适的序列和合适的酶切位点，基因毒力 调控子toxR基因序列长度为885bp，两端加上BamHI酶切位点；

3、将处理后的序列送至宝生物工程(大连)有限公司，由其负责进行全 基因人工合成服务，包括单链Oligo DNA的合成、DNA片段拼接等工作，所得 基因毒力调控子toxR基因的序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，将所得全长 基因克隆至质粒载体pUC19(购自TAKARA公司)中，构建获得包含toxR基因序 列的质粒标准分子PLW07(其序列如序列表中SEQ ID NO:2所示)，构建所得 质粒标准分子PLW07的质粒图谱如图1所示。

4、大量培养含有包含所得质粒标准分子PLW07的重组大肠杆菌，利用质 粒大量提取试剂盒(OMEGA)提取质粒，获得高纯度的质粒标准分子PLW07。经 过紫外分光光度计以及电泳进行纯度分析，之后质粒DNA标准分子置于-20℃ 保存，抽提质粒的方法包括以下步骤：

a、将100－200mL过夜培养的细菌于室温5000×g离心10分钟，弃去上 清；

b、加入12mL SolutionⅠ(含有RNase A)，振荡充分混匀；

c、加入12mL SolutionⅡ，上下颠倒温和混匀，室温放置2分钟以使菌体 充分裂解；

d、加入16mL SolutionⅢ，立即上下充分颠倒混匀数次，直至形成均匀的 白色沉淀；

e、≥12000×g，4℃离心10分钟；

f、吸取20mL上清小心地移至一个干净的HiBind Maxi吸附柱中(置于50mL 收集管中)，5000×g室温离心5分钟；

g、弃去收集管中的液体，加入10mL Buffer HB清洗吸附柱，5000×g室 温离心5分钟；

h、弃去收集管中的液体，加入15mL DNA Wash Buffer(无水乙醇稀释) 清洗吸附柱；

i、重复上述清洗步骤；

j、6000×g离心15分钟以干燥吸附柱；

k、将吸附柱置于一个干净的50mL管中，加入2mL～3Ml TE缓冲液，室 温放置1～2分钟，8000×g离心2分钟以洗脱DNA，所得DNA溶液即为提取的 质粒标准分子溶液，保存在-20℃。

5、测序验证质粒标准分子PLW07

将提取的质粒标准分子送至八家测序公司进行序列验证，八家测序公司分 别为北京六合华大基因科技股份有限公司、上海博尚生物技术有限公司、英潍 捷基(上海)贸易有限公司、上海杰李生物技术有限公司、上海美吉生物技术 有限公司、上海生工生物技术有限公司、苏州金唯智生物科技有限公司、宝生 物生物工程有限公司。对于质粒DNA标准物质来说，序列长度与定量有直接关 系，8家不同的测序公司进行序列测定是标准物质研制中对于定值的要求。详 见ISO导则35，标准物质定值部分的具体要求。

序列考察公式：序列正确率＝正确碱基数目/碱基总数

测序结果证明，所有参与序列验证的单位得到的序列正确率为100％，该质 粒序列中的第423位到第1307位为基因毒力调控子toxR基因。

实验结果为：经过序列选择步骤、全基因人工合成步骤以及质粒大量提取 等步骤得到高纯度的质粒标准分子PLW07经测序验证，该质粒标准分子插入片 段序列与设计完全相符。

实施例2质粒标准分子PLW07的均匀性检验

均匀性是表征物质中一种或多种特性相关的结构或组成的一致性状态。通 过测量取自不同包装单元(如瓶、包等)或取自同一包装单元不同位置的规定 大小的样品，测量结果落在规定不确定度范围内，则可认为该标准物质对指定 的特性量是均匀的。均匀性是标准物质的基本属性，用于描述标准物质特性的 空间分布特征。在标准物质的研制(生产)过程中必须进行均匀性评估，以证 明其具有良好的均匀性。均匀性良好的质粒标准分子，其量值不会受到分装等 因素的影响，各瓶间的量值差异不大，因此保证了检测结果的可靠性。

实验试剂TE缓冲液(pH7.5)。实验仪器Nanodrops ND-2000。

实验方法：

1、按照《JJG 1006-1994一级标准物质技术规范》均匀性抽取样品要求， 从各质粒DNA标准物质中随机抽取15瓶。

2、对所取每个样品取样3次，每次取样量为1μL。每个取样量用紫外分 光光度重复测定3次，取平均值。

3、对测定结果用F检验法进行统计，判断均匀性检验结果。具体方法为： 抽取m个样本，在相同条件下测得m组等精度测量数据，如果测定方差无显著 性差异，则应满足下式的统计要求。

$F=\frac{\frac{Q_1}{v_1}}{\frac{Q_2}{v_2}}\le F_{\alpha }(v_1,v_2)$

其中组间差方和计算公式为：

$Q_1=\underset{i=1}{\overset{m}{\Sigma }}{n}_i{({\bar{x}}_i-\stackrel{=}{x})}^2$

组内差方和计算见公式为：

$Q_2=\underset{i=1}{\overset{m}{\Sigma }}\underset{j=1}{\overset{\mathrm{nj}}{\Sigma }}{(x_{\mathrm{ij}}-{\bar{x}}_i)}^2$

ν₁＝m-1(组间自由度)

ν₂＝N-m(组内自由度)。

实验结果：

1、质粒标准分子PLW07均匀性检验结果如表1所示

表1 质粒标准分子pLW07均匀性检验数据(单位：ng/μL)

样品 重复1 重复2 重复3 平均值 1 94.9 95.4 94.4 94.90 2 94.9 95 94.1 94.67 4 94.1 95.4 93.1 94.20 5 93.3 95.1 93 93.80 6 93.5 93.7 93.9 93.70 7 93.3 94.9 93.2 93.80 8 93.6 92.3 95.8 93.90 9 92.6 94 92.9 93.17 10 93.8 94 93.6 93.80 11 92.6 93 92.4 92.67 12 92.7 95.4 92.7 93.60 13 93.5 94.4 92.2 93.37 14 93.3 94 93.8 93.70 15 94.1 93.7 91.8 93.20

表2 质粒标准分子pLW07的均匀性统计结果

质粒DNA标准物质 Q₁Q₂F值 F_0.05(14，30) pLW07 13.72 27.31 1.08 2.04

均匀性统计结果见表2，在95％置信水平下，F值小于F_0.05(14，30)，证明 该质粒标准分子PLW07是均匀的，符合《JJG1006-94一级标准物质技术规范》 均匀检验合格要求。

实施例3质粒标准分子PLW07的稳定性考察

稳定性是指在特定的时间间隔和贮存条件下，标准物质的特性值保持在规 定范围内的能力。稳定性是标准物质的基本属性，用于描述标准物质的特性随 时间变化的性质，即描述标准物质特性的时间分布特征。在标准物质的研制过 程中必须进行稳定性评估。稳定性评估不但能评估与材料稳定性相关的测量不 确定度，而且能明确合适的保存和运输条件。稳定性良好的质粒标准分子，其 特性值在合适的保存和运输条件下不会随着时间的推移而改变，检测结果不会 受其不稳定性的影响，保证了检测结果的可靠性。

实验试剂TE缓冲液(pH7.5)。实验仪器Nanodrops ND-2000。

实验方法：

采用经典稳定性研究对质粒标准分子的稳定性进行考察，即同时制备的样 品在相同条件下随着时间的推移进行测量。

1、在质粒标准分子制备完成后的第0个月、0.5个月、1个月、2个月、4 个月、6个月对制备的质粒标准分子(-20℃保存)随机抽取3瓶，每个样品重 复测定3次，取平均值，进行长期稳定性考察。本研究采用了紫外分光光度法 对质粒标准分子进行了跟踪考察。

2、对稳定性检测数据进行评估，判断稳定性考察结果。具体考察方法如 下：

直线斜率可用下式计算：

${\beta }_1=\frac{\underset{i=1}{\overset{n}{\Sigma }}(X_i-\bar{X})(Y_i-\bar{Y})}{\underset{i=1}{\overset{n}{\Sigma }}{(X_i-\bar{X})}^2}$

式中：X_i——第i个时间点；Y_i——第i个时间点的观测值；——所有 时间点的平均值；——所有观测值的平均值。

截距可由下式计算：

${\beta }_0=\bar{Y}-{\beta }_1\bar{X}$

直线上每点的标准偏差可用下式计算：

$s^2=\frac{\underset{i=1}{\overset{n}{\Sigma }}{(Y_i-{\beta }_0-{\beta }_1{X}_i)}^2}{n-2}$

式中：X_i——第i个时间点；Y_i——第i个时间点的观测值；β₁，β₀—— 回归系数；n——测量系数。

β₁的标准偏差由下式给出：

$s\left({\beta }_1\right)=\frac{s}{\sqrt{\underset{i=1}{\overset{n}{\Sigma }}{(X_i-\bar{X})}^2}}$

基于β₁的标准偏差，可用t-检测进行以下判断：即若 |β₁|＜t_0.95,n-2·s(β₁)，则表明斜率不显著，没有观察到不稳定性。

实验结果：

1、质粒标准分子PLW07稳定性考察结果如表3和图2所示，：

表3 质粒标准分子PLW07的稳定性监测数据(单位：ng/μL)

时间(月) 重复1 重复2 重复3 平均值 SD 0 91.25 91.1 92.45 91.60 0.74 0.5 92.3 91.2 93.3 92.27 1.05 1 90.9 91.2 89.7 90.6 0.80 2 90.7 89.1 89.5 89.77 0.83 4 90.5 89 89.9 89.80 0.75 6 91.3 89.5 92.1 90.97 1.33

统计结果如表4所示。

表4 质粒标准分子PLW07的稳定性统计结果

质粒DNA标准物质 β₁β₀s(β₁) t_0.95,n-2·s(β₁) PLW07 0.17 91.26 0.19 0.52

由统计结果可知，质粒标准分子PLW07在-20℃条件下保存6个月是稳定 的。

实验例4用紫外分光光度法对质粒标准分子PLW07进行定量

实验试剂TE缓冲液(pH7.5)。实验仪器Nanodrops ND-2000。

实验方法包括以下步骤：

1、用TE缓冲液使紫外分光光度计校正为零点；

2、取实施例制备所得DNA溶液1μL，直接点在检测区域，记录仪器读数；

3、直接读出DNA浓度，浓度单位为ng/μL。

4、每个样品测试八次，取平均值。

实验结果为：经过紫外分光光度法定值，质粒标准分子PLW07的浓度如表 5所示：

表5 紫外分光光度法定值结果(单位：ng/μL)

质粒 重复1 2 3 4 5 6 7 8 平均值 SD PLW07 94.9 94.9 94.1 93.3 93.5 93.3 93.6 92.6 93.78 0.81

实施例5用HR-ICP-MS对质粒标准分子PLW07进行定量

实验试剂为P标准溶液(NIST，SRM3139a)。实验仪器为：电感耦合等离 子体发射质谱仪(Thermofi sher element2)。

实验方法包括以下步骤：

1、根据质粒标准分子PLW07的碱基组成和序列长度，分别计算其中磷元 素的含量；

2、HR-ICP-MS实验参数为：冷却气流量16.86L/min，雾化气流量为 1.123L/min，辅助气流量为0.99L/min，功率1350W。

3、配制梯度浓度的磷标准溶液(0、1、2、3、4、5g/L)，并用此标 准溶液作出HR-ICP-MS的标准曲线；

4、将质粒标准分子PLW07稀释3000倍，HR-ICP-MS检测稀释后的质粒标 准分子，并根据标准曲线得出稀释后的质粒标准分子的磷含量；

5、根据测得的磷含量和稀释倍数计算出质粒标准分子PLW07的浓度；

6、每个样品测试八次，取平均值。

实验结果为：经计算，质粒标准分子PLW07的磷元素的含量为10.22％。经 过HR-ICP-MS定值得到质粒标准分子磷元素含量数据如表6所示，稀释倍数为 3000，换算得到质粒分子的质量浓度，如表7所示。

表6 质粒标准分子PLW07的磷元素含量(单位：μg/L)

质粒 重复1 2 3 4 5 6 7 8 平均值 SD PLW07 2.38 2.28 2.20 2.24 2.39 2.33 2.34 2.36 2.32 0.07

表7 质粒标准分子PLW07的质量浓度结果(单位：ng/μL)

实施例6研制的质粒标准分子PLW07在实时荧光PCR检测中的应用

实验试剂：本发明人采用常规方法设计了数十对引物，将设计的引物和探 针交由由宝生物工程(大连)有限公司合成后进行检测，Master Mix购自Life  technology公司。实验仪器包括：实时荧光定量PCR扩增仪(Life technology) 离心机、恒温水浴锅、培养箱、天平等。

质粒标准分子PLW07在实时荧光PCR检测中的应用：

引物、探针、PCR检测体系

PCR加样体系：

反应条件PCR程序：

95℃  10分钟；

95℃  15秒，60℃1分钟，40个循环。

将实施例1制备所得的质粒标准分子PLW07稀释为不同浓度的质粒标准分 子PLW07(2.6×10⁶copies/μL、2.6×10⁵copies/μL、2.6×10⁴copies/μL、 2.6×10³copies/μL、2.6×10²copies/μL、2.6×10¹copies/μL、 2.6×10⁰copies/μL)将不同浓度的质粒标准分子PLW07分别作为模板，按照 文献中的方法进行实时荧光PCR扩增。每个反应重复三次，根据不同浓度模板 扩增的Ct值与浓度之间的关系，建立标准曲线。

实验结果

1、从数十对引物中筛选出了4对能够有效扩增出目标序列的引物对，具 体如表8所示，其中引物对1的扩增效果最好，

实验中采用的引物和探针序列详见表8。

表8 实验中采用的引物和探针序列

引物对1的检测效果最好，特异性强，扩增后没有非特异性的条带出现， 检测灵敏度最高，最低可检测2.6copies/μL的目标序列；引物对2和3的灵 敏度较低，能够检测到2.6×10²copies/μL的目标序列；引物对4的能够检测 到2.6×10¹copies/μL的目标序列，但是特异性较差，有非特异性条带出现。

2、采用质粒标准分子PLW07和引物对1组合实时荧光PCR检测

采用上述PCR检测体系及反应条件，分别以不同浓度的质粒标准分子PLW07 (如：2.6×10⁶copies/μL、2.6×10⁵copies/μL、2.6×10⁴copies/μL、 2.6×10³copies/μL、2.6×10²copies/μL、2.6×10¹copies/μL、 2.6×10⁰copies/μL)作为标准品建立实时荧光PCR的标准曲线。建立的标准 曲线见图3，相关系数达到0.9927，线性良好，空白对照无扩增峰，最低可检 测2.6copies/μL的目标序列，表明质粒标准分子PLW07适合应用于实时荧光 PCR检测，可作为实时荧光PCR扩增霍乱弧菌的阳性标准物质。

在实际霍乱弧菌检测时，可利用该线性良好的标准曲线，通过实验荧光PCR 方法检测出待测样品中霍乱弧菌特定基因的拷贝数，并可根据霍乱弧菌特定基 因的拷贝数与细菌总数之间的线性关系，换算出霍乱弧菌的具体个数。由于目 前针对霍乱弧菌实时荧光PCR检测方法的标准物质的研发仍是空白，在实际霍 乱弧菌实时PCR检测时，各单位使用的多是自行设计构建的质粒DNA分子作为 标准品，其中的目的基因特异性片段各不相同，同时缺乏统一的定值方法，质 粒DNA分子定值准确度差，造成各实验室之间的检测结果差异极大，缺乏可比 性、有效性和可靠性。因此，本质粒标准分子可以解决实时荧光PCR检测霍乱 弧菌时缺乏标准物质的难题，适用于多种扩增霍乱弧菌毒力调控子toxR基因 的实时荧光PCR方法，保证检测结果的可比性，为霍乱弧菌实时荧光PCR方法 检测提供生物计量技术支持。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。