一种促进黑色素细胞色素产生的细胞株

摘要

本发明涉及一种促进黑色素细胞色素产生的细胞株，称为小鼠胚胎细胞RMD9，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C201408。本发明还涉及包含该细胞株的细胞培养物以及培养悬液。本发明还描述了小鼠胚胎细胞RMD9的制备方法及其在皮肤美容产品筛选中的应用。

说明书

技术领域

本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种促进黑色素细胞色素产生的细胞株。

背景技术

决定皮肤颜色最重要的因子是一种被称为黑色素的色素性物质。黑色素的形成是由存在于表皮基底层的黑色素细胞产生的。如果这个黑色素的产生出现异常被抑制，或者黑色素细胞消失，就会形成一种后天性色素脱失症，俗称为白癜风。现阶段，针对白癜风的治疗方法包括甾族化合物治疗法以及光化学疗法。但是，这些治疗方法的预后不是很理想，都需要接受持续性的治疗。

除上述治疗方法外，也有从其他部位取皮或毛囊进行移植的治疗方法。但是，这种疗法会造成与治疗部位同等面积的皮肤缺损，因此当治疗部位面积相对大时就不能进行此类治疗了。另外，也有从自体采取黑色素细胞，经过体外培养后再注射移植的治疗方法。此疗法与自体取皮相比，可以进行相对大面积的治疗，但是在注射部位造成色素分布不均，大面积治疗时要达到色素的均匀分布是非常困难的。

另一方面，以创伤治愈以及烧伤治愈为目的的表皮培养方案也被提出。皮肤培养不仅可以实现大范围的治疗而且非常有效果。但是，目前的表皮培养都不含有黑色素细胞，就算有黑色素细胞也无法有效地使黑色素形态正常形成。虽然在细胞培养时，促进黑色素产生的方法有很多种，例如：用紫外线照射进行物理刺激，添加黑色素细胞活性因子等。但是，即使使用了这类的处理方法也无法有效且稳定地形成正常的色素形态。另外，当黑色素细胞和其他皮肤细胞共同培养的时候，如果进行这些处理，会影响到黑色素细胞以外细胞的成长，所以在运用上还是相当困难的。

针对上述问题，本发明提供了一种新的促进黑色素细胞色素形成的细胞株。出人意料的是，在该细胞株的存在下，含有黑色素细胞的表皮组织培养物形成完全的片状形状，在美容和医疗应用时能够实现大面积的色素均匀分布。

发明内容

本发明的发明者经过大量研究发现，通过对提取的黑色素细胞和表皮细胞进行共培养，可以很好的促进黑色素细胞色素的产生，实现本发明的技术效果。本发明的细胞株能够促进黑色素细胞的色素产生，因而能够很好的还原皮肤色素。所以，适用于治疗白癜风以及进行美白药物的筛选等领域的研究。

因此，在本发明的一方面，提供了一种促进黑色素细胞色素产生的细胞株，细胞株名称为小鼠胚胎细胞RMD9，保藏在中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：C201408。保藏日期为2014年1月17日。

在本发明的另一方面，提供了一种细胞培养物，该细胞培养物包含本发明的细胞株小鼠胚胎细胞RMD9以及黑色素细胞。本发明所述细胞培养物中黑色素细胞的生物来源可以是任意来源，例如生物来源选自：小鼠、大鼠、猪、牛、猴子和人。在一个实施方式中，本发明所述细胞培养物中小鼠胚胎细胞RMD9与黑色素细胞共培养。在一个优选的实施方式中，小鼠胚胎细胞RMD9作为滋养层细胞与黑色素共培养，促进黑色素细胞的色素产生。

在本发明的另一方面，提供了一种培养悬液，所述培养悬液包含本发明的细胞株小鼠胚胎细胞RMD9。

在本发明的另一方面，提供了一种培养悬液，所述培养悬液包含本发明的细胞株小鼠胚胎细胞RMD9的提取物。

在本发明的另一方面，提供了本发明细胞株小鼠胚胎细胞RMD9的制备方法，所述方法包括以下步骤：

a.取小鼠皮肤片，进行细胞株的克隆过程；

b.将上述克隆的细胞株与黑色素细胞共培养的培养过程；

c.评价黑色素细胞的色素生产能力，选定能够促进黑色素细胞色素产生的细胞株。

在本发明的另一方面，提供了包含小鼠胚胎细胞RMD9和黑色素细胞的细胞培养物在进行皮肤美容产品筛选中的应用。在一些实施方式中，本发明提供了包含小鼠胚胎细胞RMD9和黑色素细胞的细胞培养物在筛选美白产品中的应用。在一些实施方式中，本发明提供了包含小鼠胚胎细胞RMD9和黑色素细胞的细胞培养物在筛选白癜风治疗产品中的应用。在一些实施方式中，本发明提供了包含小鼠胚胎细胞RMD9和黑色素细胞的细胞培养物在筛选痤疮治疗产品中的应用。在一些实施方式中，本发明提供了包含小鼠胚胎细胞RMD9和黑色素细胞的细胞培养物在筛选烧伤治疗产品中的应用。在一些实施方式中，本发明提供了包含小鼠胚胎细胞RMD9和黑色素细胞的细胞培养物在筛选大面积黑痣治疗产品中的应用。在一些实施方式中，本发明提供了包含小鼠胚胎细胞RMD9和黑色素细胞的细胞培养物在筛选纹身治疗产品中的应用。在一些实施方式中，本发明提供了包含小鼠胚胎细胞RMD9和黑色素细胞的细胞培养物在筛选过度晒伤治疗产品中的应用。

发明详述

本发明的细胞株能够促进黑色素细胞色素的产生。黑色素细胞是一种皮肤里的特殊的细胞，它产生黑色素，传递给周围的角质形成细胞。在本发明中，对于黑色素细胞的采集部位没有具体限制，可以从表皮基底层或毛囊基底部充分获取。由于表皮角质细胞是构成表皮的上皮细胞，所以也可以从表皮基底部或毛囊基底部获取。

黑色素细胞是分裂次数有限的正常细胞。比如分裂50～80次后细胞寿命就结束了。本发明对于黑色素细胞的生物种类来源没有特别的规定，优选使用小鼠、大鼠、猪、牛等哺乳类，或者是人、猴子等灵长类，最优选使用人来源的细胞。例如，黑色素细胞可以是已经建立的市售黑色素细胞，也可以是从患者自身提取的黑色素细胞。

细胞株化使得黑色素细胞即使超过了分裂次数，也可以继续传代培养。这类的细胞株通过传代，即使细胞正常死亡或超过传代数，也可以通过选择可以增殖的细胞来达到继续培养。

另外，导入了遗传因子的细胞或者使用遗传因子导入技术制作出来动物类的株化细胞也是可以继续增殖的。被导入的遗传因子没有限定，比如SV40病毒的大抗原遗传因子，ras遗传因子，c-myc遗传因子等。将遗传因子导入细胞的方法包括显微注射法，电脉冲法，脂质体法等，这些都是大家熟知的技术。

制备本发明细胞株的细胞的生物种类来源没有特别限制，可以包括大鼠，小鼠，猪，牛，人，猴子等哺乳类，优选使用大鼠、小鼠等啮齿类，最优选使用大鼠来源的细胞进行细胞株化。

本发明的细胞株能够促进黑色素细胞的色素产生。细胞株促进黑色素细胞的色素产生作用分为两种。第一种：促进每个黑色素细胞的色素产生，提高黑色素细胞的黑色度。另一种：增加黑色素细胞的细胞数量。不论是那种作用，结果就是通过目测就能确认含有黑色素细胞细胞培养组合物的黑色的程度有显著的提高。本发明所述促进黑色素细胞的色素产生作用可能是上述中的某一种，也可能两个作用都包含。

本发明的细胞株作为促进黑色素细胞的色素产生的条件，例如，可以和黑色素细胞共培养，可以将本发明细胞株的培养悬液供给黑色素细胞培养物，可以将本发明细胞株的提取物供给黑色素细胞培养物等，其中比较好的是和黑色素细胞共同培养。共培养的条件也没有限制，例如包括本发明的细胞株和黑色素细胞混合培养的方法，或者本发明的细胞株作为滋养层细胞对黑色素细胞进行培养的方法等。在一个优选的实施方式中，将本发明的细胞株作为滋养层细胞对黑色素细胞进行培养。

这里的滋养层细胞是指能够诱导其他细胞（本发明是黑色素细胞）的细胞。另外，所谓滋养层细胞指的是在培养容器中细胞已一体化或准一体化的皮状形态。所谓的一体化或准一体化指的是通过光学显微镜看到培养皿的基底的70～100%的面积都被细胞所占有的状态。另外，所谓的皮状的培养物是指细胞形成了1～5层，可以平面展开的培养物。另外滋养层细胞培养物即使使用丝裂霉素C，X照射来抑制细胞的增殖也是没有问题的。

下面将描述本发明细胞株的具体制备过程：

（1）本发明细胞株的克隆过程

所谓的细胞株克隆过程，就是取得完全相同的遗传背景的细胞株集合的过程。从原代到传代培养所建立的细胞株，一般会有好几种遗传背景。所以想要维持稳定平衡是很困难的。所以在这里必须以一个细胞为起源来建立细胞集合，得到同质量的具有稳定特性的细胞集合。作为操作方法，例如可以将细胞株的分散液稀释到临界点，也存在单一的细胞分离方法。作为克隆的细胞株，可以是由原代细胞形成的细胞株，也可以是由已细胞株化的STO细胞或3T3细胞派生出来的细胞株。

（2）培养含有细胞株和黑色素细胞的细胞培养组合物的过程

所谓的培养含有细胞株和黑色素细胞一起的细胞培养组合物的过程是指将本发明细胞株克隆过程（1）中取得的单一遗传背景的细胞株和黑色素细胞一起培养的过程。这里所谓的细胞培养组合物指的是含有本发明细胞株和黑色素细胞的细胞培养物。相关的细胞培养组合物既可以是由细胞株以及黑色素细胞构成，也可以包含其他细胞。所谓的其他细胞，包括例如表皮角质细胞，成纤维细胞等。通过细胞株和黑色素细胞共培养，可以观察被单独分离的细胞株对黑色素细胞会产生什么影响。共培养的方法包括例如：将含有细胞株和黑色素细胞的细胞悬液接种到培养容器；或者让单独分离的细胞株形成滋养层细胞培养物，然后在这个上面接种含有黑色素细胞的细胞悬浊液；以及类似的方法。具体的操作方式，例如单独分离的细胞株形成滋养层细胞培养物后，在这个上面接种含有黑色素细胞的皮肤片经过消化酶处理的细胞悬液，但这并不是唯一的方法。

（3）对黑色素细胞的色素产生能力的评价过程

所谓黑色素细胞的色素产生能力的评价过程是对于过程（2）共培养后的细胞培养组合物中黑色素细胞的色素成型状态的评价。黑色素细胞的色素成型状态的评价方法包括：目测观察黑色化状态，使用光学显微镜对黑色化的黑色素细胞的细胞数进行计数，或对酪氨酸酶等和色素形成相关的酶的活性，遗传因子发现量进行评价的方法等。黑色素细胞的色素产生能力的评价在过程（2）之后进行，细胞株对于黑色素细胞的影响是在充分时间培养之后进行评价。培养的时间没有特别规定，一般为1～60天，理想状态为3～40天后进行黑色素细胞的色素生产能力的评价。具体操作包括：将含有黑色素细胞的皮肤片的消化悬液接种到单独分离的细胞株作为滋养层细胞上，经过10～50天的培养后，培养物做DOPA染色，然后用光学显微镜观察黑色素细胞的细胞数，这只是一种方法，但不局限于这种方法。

通过过程（3）的操作，将黑色素细胞的色素产生能力最好的细胞株挑选出来。或者重复进行过程（1）至（3）的筛选，反复进行2次以上也是可以的。通过这个操作，就能取得本发明的细胞株。在一个具体的实施方式中，本发明的细胞株是细胞株RMD9。该细胞株作为以保藏号CCTCC NO:C201408保藏。

另外，本发明也涉及此类细胞株衍生的细胞。所谓“衍生”，是指以这类细胞株为起源的意思。具体就是指使用遗传因子导入技术将这类细胞株改变了的细胞，本发明也包括从这类细胞株中被单独分离的亚种细胞株。

本发明的细胞株，主要是通过和黑色素细胞共培养从而更好的促进黑色素细胞的色素生产能力。关于本发明的细胞株的序列，虽然不清楚，但可以肯定本发明的细胞株含有有诱导作用的体液因素或者含有细胞黏附因子。不仅是作为滋养层细胞培养物，也可作为细胞株和细胞培养基材的混合物，含有细胞株的细胞分散液等，含有本发明的细胞株的产物是本发明的操作形态。另外，从细胞株中得到的培养悬液，以及细胞提取物也是本发明的操作形态之一。

因为本发明的细胞株能很好的促进黑色素细胞的色素生产能力，所以能够很好的还原皮肤的色素形态。例如，将含有黑色素细胞的细胞分散液接种到本发明的细胞株形成的滋养层细胞上，培养后形成细胞培养组合物，将其移植到白癜风患者的患部，就能恢复正常的色素形态。类似的细胞培养组合物的具体实施方式包括，将含有黑色素细胞的细胞分散液接种到本发明的细胞株形成的滋养层细胞上，培养后形成的培养表皮都有成功案例。

由本发明的细胞株形成的滋养层细胞物和含有黑色素细胞的细胞培养组合物的制备方法没有特别的规定，可以使用以下方法来很好的制作完成。

从腰部，腹部，背部，臀部等，主要是从能被衣服所遮盖的部位采集表皮组织。采集的皮肤组织片在培养之前，先要用含有消化酶的培养液浸泡进行酶处理。作为比较合适的消化酶，有胰蛋白酶，胶原酶，中性蛋白酶等。作为溶解消化酶的培养液，原代培养时也可以使用无血清培养液。另外，例如Dulbecco’s MEM等也用的很好。

本发明的细胞株形成的滋养层细胞培养物，当使用培养液将细胞株培养成80～100%的一体化后，使用丝裂霉素C或X线照射等来抑制细胞增殖。培养细胞株的培养没有特别的规定，但使用含有10%牛胎儿血清的Dulbecco’sMEM等效果比较理想。

在滋养层细胞上接种含有黑色素细胞以及表皮角质细胞的细胞分散液，进行培养。作为在培养时理想的培养液Ca²⁺的浓度，常规：0.5～1.9mM，理想：0.8～1.6mM，最理想是1.4mM浓度的KGM培养液。使用该培养液，制作出多层的皮状细胞培养组合物通常需要3～14天，理想天数在5～12天。

在无血清培养液中也可以加入类似于EGF、FGF的激素或成长因子。另外，也可以使用一些常用的细胞培养液，例如，除了上述的KGM培养液以外，还有DMEM（Dulbecco’s MEM）、RPMI1640、F-10、F-12、MEM、Dulbecco’s MEM+10%FBS等。作为添加物，除了上述以外，还可以加入氢化可的松，转铁蛋白，孕甾酮，乙醇胺等。

为了适用于广泛的移植领域，从皮肤中提取的黑色素细胞和皮肤角质细胞通过传代，尽可能多的培养比较好，但是，传代过多的话，黑色素细胞的黑色素生产能力酒会下降，以0-3代比较好。细胞传代时，使用胰蛋白酶处理等通常的方法即可。

当滋养层细胞培养物上的皮肤角质细胞达到一体化后，通过再继续培养3～7天，就能长成多层细胞层的接近皮肤状的培养物。

细胞培养组合物根据上述方法大概需要花费10～30天，在14～21天之间效果是最理想的。

这样的一个细胞培养组合物，通过目测就能了解黑色的程度。具体细节上，就需要通过光学显微镜来观察了解基础的黑色素细胞和角质细胞的数量比。表皮角质细胞100：黑色素细胞数量在1～50之间为基础，1～30为普通，2～20之间为理想，3～10之间为完美。数量比可以通过光学显微镜来观察测定，另外当培养组织物在消化酶处理的阶段，一体化或准一体化的时候也能测定。

本发明的细胞培养组合物没有规定动物的种类，但是白癜风治疗时使用人来源比较好。特别对于黑色素细胞和表皮角质细胞最好是同一个人由来比较好，因为同一个人提供自体的组织对于细胞培养组合物排异性低。

本发明的细胞培养组合物中的黑色素细胞有多个的树状凸起，类似于人类身体环境。该形态能通过DOPA染色等对黑色素细胞细胞培养组合物进行染色，然后用光学显微镜观察。据数据显示，该形态的黑色素细胞的黑色素生产能力相当高。

黑色素细胞细胞培养组合物这项研究虽然适用于局限性白癜风的治疗，但也适用于烧伤，过度晒伤，痔，刺青等的各类色素异常的治疗。另外，不仅在医疗方面，在对黑色素进行药效评价的时候也适用美白效果等。比如：上述细胞培养组合物在培养的时候，在培养液中添加各种药物，从而对黑色素细胞的形成进行评价，从而达到筛选有抑制黑色素生长作用的药物等。

附图简述

图1显示了完成的黑色素细胞细胞培养组合物。其中，图1A显示了滋养层细胞RMD9存在下的细胞形态，图1B显示了在Swiss3T3细胞存在下的细胞形态，其中，Swiss3T3是市售获得的细胞，例如可以ATCC,CCL-92从http://www.atcc.org/Products/All/CCL-92.aspxhttp://www.atcc.org/Products/All/CCL-92.aspx购得。

图2显示了黑色素细胞细胞培养组合物的显微镜观察影像(图2A)以及多巴染色影像(图2B)，其中箭头所指的是黑色素细胞。采用的显微镜是OLYMPUS公司制造IX51,DP26显微摄影系统，焦距：X20倍。

具体实施方案

以下是对于此项发明的表皮组织培养物以及用途和制造方法的实例展示以及具体说明，但是本发明并不局限于此。

（1）RMD9细胞的选定

小鼠皮肤片在10%FCS-DMEM（含有10%牛胎儿血清的Dulbecco’s）中进行培养，培养出成纤维细胞。将成纤维细胞进行30次以上的传代培养，得到细胞株。用10%FCS-DMEM对细胞株进行极限稀释，接种于96孔的滴定板上，得到细胞株的克隆。将细胞株的克隆扩大培养，接种在6孔培养皿，培养至100%一体化。将从人皮肤组织取得的黑色素细胞接种到滋养层细胞培养物上，培养10～30天后，目测黑色的程度。选择黑色程度较好的细胞株，选定RMD9。

（2）滋养层细胞的制作

将RMD9接种到培养皿中，使用10%FCS-DMEM将其培养到100%一体化。100%一体化后，添加培养液将丝裂霉素C调制成4μg/ml，培养1.5～2个小时。将培养液去除，用DMEM清洗2次，换成10%FCS-DMEM，继续培养1天。另外，使用3T3的小鼠细胞作为对照，调制方法相同。

（3）皮肤样品采集以及黑色素细胞细胞培养组合物的制作

在患者腰部使用70%酒精棉球进行灭菌，从患者身体采集组织片。采集的组织片浸泡在碘液中进行消毒，然后用PBS清洗。将组织片切碎，放入消化液中（消化液：TrypLE被PBS5倍稀释后）4℃环境下放置16～24个小时。常温30分钟搅拌，使用细胞株化过滤设备将残渣除去。形成的细胞悬液进行离心处理，回收细胞。然后关于残渣的处理，使用胶原蛋白酶（GIBCO公司）37℃环境3小时处理，然后进行细胞回收。回收的细胞播撒到6cm培养皿中，使用KGM、放置于37℃5%二氧化碳培养箱中培养。培养10～20天，长满后再培养3～7天，细胞培养组合物培养完成（图1）。作为对照，另外制作了一份没有使用滋养层细胞培养物的培养物组成物。

（4）将黑色素细胞培养组合物进行DOPA染色。

使用光学显微镜，观察被DOPA染色的黑色素细胞的形状，黑色素细胞和表皮角质细胞的数量以及堆积的细胞数（参见表1和图1-2）。

表1

表1以及附图1-2表明，在本发明RMD9细胞株存在下，能够促进黑色素细胞的色素产生，因此能够很好的还原皮肤色素。作为对照，在3T3细胞存在下没有上述效果，目测仍然为白色。此外，DOPA染色也表明，在本发明细胞株RMD9存在下，黑色素细胞有多个树状凸起，其形态类似于人类身体环境。

（5）体表移植

对患者的局限性白斑部位使用70%酒精面进行充分消毒，打磨掉表皮。将RMD9作为滋养层细胞培养的细胞培养组合物平铺于被打磨得部位。覆盖消过毒的纱布，缠绷带，固定。3～5个月后目测移植部位，和非白斑部位进行比较，无色素斑，恢复正常。

表2

由此可见，本发明的细胞株能够促进黑色素细胞的色素生长。因此，本发明的细胞株和含有黑色素细胞的细胞培养组合物非常适合于局限性白斑的治疗，也能够达到大面积颜色均匀附着生长。

虽然本发明已经以较佳实施例揭示如上，但是其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，可作各种的更动与润饰，因此本发明的保护范围应当视所附的权利要求所界定的为准。