一种宏观超分子组装的三维有序组织工程支架及制备

摘要

本发明公开了一种宏观超分子组装制备三维有序结构，所制备的有序结构有望应用于细胞诱导分化模版和三维组织工程支架材料方面。该方法可引入的构筑基元包括聚二甲基硅氧烷、水凝胶、壳聚糖等多种生物相容性材料，通过微压印方法将上述材料和磁性纳米粒子压入预制的模版可以实现构筑基元的大量制备并对其表面进行特异性超分子官能团的修饰。进而，利用外磁场实现构筑基元在三维空间的准确定位，并在指定位置利用超分子相互作用固定构筑基元，从而实现三维有序结构的可控制备。此外，通过在指定构筑基元表面修饰特异性蛋白识别位点，可以在该方法实施过程中利用分子间特异性识别引入所需要的生长因子，从而实现指定生长因子在三维支架材料内部的定向引入。

说明书

技术领域

本发明涉及超分子组装和三维有序结构材料制备领域。更具体地，涉及 一种宏观超分子组装的三维有序组织工程支架及制备。

背景技术

三维有序结构的可控制备在光子晶体、增强材料以及光电器件等多种领域 得到了广泛关注与深入研究。目前，该领域的研究工作大多关注纳米尺度的构 筑基元，而对十几微米以上至毫米尺度的构筑基元研究较少，其原因在于该尺 寸区间的三维有序结构制备相对困难：对于传统加工而言该尺寸太小难以进行 精细操作，对于新兴的微纳加工技术而言，该尺寸则太大导致工艺繁复、耗时 漫长，不具有实际可操作性。然而，十微米至一厘米的三维有序结构对于组织 工程支架、长波光子晶体领域具有重要研究意义。特别地，大多数细胞都处于 这一尺寸范围之内，当前的细胞培养技术也从传统的二维培养推进到了三维细 胞培养，构筑与细胞尺寸相比拟的三维支架结构可以为细胞生长提更加接近生 物体内环境的支架材料。因此，发展十微米至一厘米尺寸三维有序结构的制备 方法，可以为细胞生长提供合适的支架并对促进组织工程研究产生重要意义。 迄今为止，由于制备上的困难，十微米至一厘米尺寸三维有序结构的相关报道 较少。例如，基于3D打印技术的三维生物打印(3D bioprinting)方法可以通过喷 墨打印、微挤出和激光辅助打印等方法，将含有细胞、生物相容性材料和生长 因子等细胞所需培养环境的液体混合物作为“墨水”，利用计算机辅助技术构 建的三维模型，进行组织或器官的打印和再造。然而，该方法的问题在于其分 辨率有限，难以构建精细支架材料；由于打印装置的特殊性，该方法对设备、 细胞、生物材料和生长因子都有一定的限制与要求，从而制约了其在组织工程 领域的广泛应用。因此，发展一种具有普适性的、温和的、生物相容的三维有 序结构制备方法仍然是一大挑战。

超分子组装，作为一种温和的、生物相容的而且不依赖于特殊设备的方法， 可以较好地解决上述问题。自提出以来，传统超分子组装的研究通常着眼于分 子层次或纳米尺度的构筑基元。为了将自组装体系从分子层次拓展到微米及以 上尺度，Whitesides等人提出了“全尺度自组装”的概念，并应用界面自由能 最小化原理在油水界面实现了毫米构筑基元的组装，形成有序阵列，该阵列通 过后续的固化操作可以得到不依赖于界面而存在的结构。为了去除对界面的依 赖，Harada教授组在毫米级凝胶块体表面引入环糊精/偶氮苯超分子官能团， 可以在简单的震荡条件下通过主客体识别作用实现凝胶构筑基元的超分子组 装并获得独立存在的组装体；他们利用光照或竞争分子实现对组装过程的调 控。同年，申请人的研发小组报道了直径17微米玻璃纤维通过金属-羧酸间多 齿配位作用在基底表面的可控组装，构筑有序图案。为了进一步理解微米以上 构筑基元的超分子组装机理，我们引入了柔性间隔层的概念，可以实现多种刚 性构筑基元(PDMS，聚甲基丙烯酸甲酯)的超分子组装，并证实其组装机理为 多重相互作用，从而为非水凝胶体系的宏观超分子组装提出了一种设计原则。 此外，DNA杂交、静电相互作用等组装推动力被用于微米以上凝胶体系的超 分子组装。这些结果表明超分子组装具有自下而上、实验条件温和的优点，而 且超分子化学中具有丰富的生物相容的分子识别体系可以用于构筑基元的特 异性组装。然而，由于宏观超分子组装体的形成过程具有一定的随机性，构筑 基元间存在一些错配现象，因而需要发展新的方法以实现宏观构筑基元的规 则、取向性排列，以形成三维有序结构。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种宏观超分子组装的三维有序组织工程支 架。

本发明的另一个目的在于提供一种宏观超分子组装制备三维有序组织工 程支架的方法。

本发明针对目前十微米至一厘米尺寸三维有序结构制备方面的困难，以及 三维有序结构中定向引入多种生长因子的问题，提出并发展了一种超分子组装 方法实现十微米至一厘米三维有序结构的制备，并在特定位点引入特定生长因 子。用于构筑三维结构的生物相容性构筑基元主要通过冰冻切片、微压印、微 加工等方法获得，其特征形状、尺寸大小可以在十几微米至厘米尺寸范围内可 调。在构筑基元的制备过程中，水热法合成的磁性纳米粒子通过掺杂混合，以 制备具有磁响应性构筑基元。所制备构筑基元的表面修饰有超分子作用或生物 识别作用的官能团。十微米至一厘米的三维有序结构的构建是通过结合外磁场 对磁响应性构筑基元进行精确定位以及宏观超分子组装进行构筑基元固定实 现的；在该三维结构的构筑过程中，所需生长因子可以通过识别构筑基元表面 的特异性结合位点来引入。

通过冰冻切片、微压印、机械微加工模版浇铸等方法获得尺寸在十微米至 一厘米的生物相容性构筑基元。在构筑基元的制备中，通过混合掺杂的方式引 入磁性纳米粒子以制备十微米至一厘米磁响应的生物相容性构筑基元。在所制 备的构筑基元表面通过交替层状组装技术、掺杂混合等方式修饰带有超分子作 用如主客体识别、静电、氢键、配位的互补官能团以及生物识别作用如生物素 /亲和素(biotin/avidin)、芽孢杆菌rna酶/芽孢杆菌rna酶抑制剂(barnase/barstar) 的互补官能团，使得上述互补构筑基元可以通过超分子相互作用或生物识别作 用实现宏观超分子组装。进而，结合外磁场对磁响应性生物相容性构筑基元进 行精确定位和宏观超分子组装对磁响应性生物相容性构筑基元进行固定的方 式，自下而上逐步构建十微米至一厘米尺寸范围的三维有序结构，并在构筑过 程中通过构筑基元表面的超分子或生物识别位点引入生长因子，实现特定生长 因子在三维结构中的可控定位，最终可望用于细胞诱导分化模版和组织工程支 架材料；本发明引入的磁响应性生物相容性构筑基元是指：该构筑基元具有良 好的生物相容性，而且在外磁场存在的情况下，可以通过磁响应方式被外磁场 控制，进行运动和定位。

本发明所述宏观超分子组装的三维有序组织工程支架为堆垛状三维有序 结构，所述三维有序结构由多个在二维方向平行地、周期性有序排列的构筑 基元构成，两个相互接触的构筑基元通过各自表面上修饰的官能团发生超分 子相互作用而实现两个表面的连接；所述支架的大小为10^-5～10^-2m。

本发明中的构筑基元有序排列是指处于同一平面的构筑基元，相互平行 且相邻，构筑基元间距在十微米至一毫米的排列。

为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

1.磁性纳米粒子的制备

利用水热法或者共沉淀法制备四氧化三铁纳米粒子。

2.微米至毫米级磁响应性生物相容性构筑基元的制备

对于毫米及以上尺度的生物相容性构筑基元，可以通过向传统机械加工模 版内浇铸液态生物相容性构筑基元溶液成型而实现批量化生物相容性构筑基 元制备，具体通过如下步骤实现：

1)结合计算机辅助技术，采用机械加工行业中的激光雕刻技术，在板材 上镂刻所需空心图案的阵列，作为制备生物相容性构筑基元的模版。在毫米尺 度上对模版图案的形状、尺寸大小均进行精确调控；

2)清洗干燥模版后，将其固定于平整玻璃表面，将所制备的磁性纳米粒 子分散于可交联的生物相容性构筑基元液体中，最后浇铸填充至模版的镂空图 案内；

3)通过机械夹紧的方式，形成压板-模版-底板三明治结构，通过加热、光 照等方式固化生物相容性构筑基元，脱模得到分立的磁响应的生物相容性构筑 基元。

冰冻切片法制备微米尺度磁响应性生物相容性构筑基元

1)选取粘度相对较大的液态生物相容性构筑基元，采用“夹心”方式将 分散有磁性纳米粒子的可交联液态生物相容性构筑基元紧密压制于压板与底 板之间，生物相容性构筑基元厚度通过两端夹板厚度调节。

2)通过加热或光照等方式对所夹分散有磁性纳米粒子的液态生物相容性 构筑基元进行彻底固化，形成所需厚度的薄膜，脱模得到所需厚度的薄片。

3)在显微镜下，将薄片裁成长宽均在毫米级而且长宽比为1：1的薄片。

4)用冰冻包埋剂OCT包覆上述薄片，设定冰冻切片机步进距离，将包埋 了的薄片放置在垂直于冰冻切片机刀口的位置，在步进马达的控制下进行切 割，可以批量得到长度为毫米级，宽度和高度均为微米级的长条状磁响应性生 物相容性构筑基元。

微压印法制备微米尺度磁响应性生物相容性构筑基元

1)用紫外光刻法在硅基底表面制备所需图形的SU8光刻胶阵列。

2)在SU8光刻胶阵列上旋涂PDMS预聚体及其交联剂的混合物，对上述 阵列进行复制，得到相反图案的空穴阵列，作为微压印模版。

3)将分散有磁性纳米粒子的可交联液态生物相容性构筑基元滴至上述 PDMS模版上，并覆盖聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄片，压紧。

4)将PDMS-生物相容性构筑基元液体混合物-PET夹层结构通过纳米热压 仪压制，以充分填充PDMS模版上空穴阵列，同时去除溢出空穴和残留在 PDMS模版与PET之间的液体层。

5)通过加热或光照引发液态生物相容性构筑基元混合物交联、固化。揭 开PET，由于PET的表面能(～42mN/m)远比PDMS模版的表面能(～22mN/m) 高，所以揭开PET过程中，所固化的生物相容性构筑基元会粘附于PET上， 可以通过剥离和收集得到分立的磁响应性生物相容性构筑基元。

为了区分磁响应性生物相容性构筑基元表面修饰的官能团，在混合液体中 可以掺入少量染料以作区分。

对于不经过步骤4)中纳米热压仪压制的情况，由于PDMS模版与PET 之间液体层的存在，脱模后只能得到固定在一层薄膜上的磁响应性生物相容性 构筑基元阵列，而难以得到分立的磁响应性生物相容性构筑基元。

3.磁响应性生物相容性构筑基元表面修饰超分子或有生物识别作用的分 子，基底表面修饰超分子

1)采用接枝反应或自由基共聚方式，将超分子或具有生物识别作用的分 子分别接至聚电解质上；所述超分子包括超分子给体或超分子受体；所述具有 生物识别作用的分子包括生物识别给体或生物识别受体。

2)将磁响应性生物相容性构筑基元通过乙醇、去离子水超声的方式洗净， 配制交替层状自组装(LbL)过程所需的聚电解质溶液，浓度在0.1-1.0mg/mL范 围。

3)为了区分修饰有不同官能团的构筑基元，LbL修饰之前，构筑基元以 染色区分，例如红色和绿色。将染有绿色的磁响应性生物相容性构筑基元交替 循环浸泡于接枝有超分子给体的a聚电解质溶液和b聚电解质溶液中，所述b 聚电解质是可以与a聚电解质通过静电、氢键、配位键等相互作用进行LbL的 聚电解质，循环交替浸泡可以在绿色构筑基元表面修饰一定厚度的含有该超分 子给体的聚电解质多层膜。同时，将染有红色的磁响应性生物相容性构筑基元 交替浸泡于接枝有超分子受体的c聚电解质溶液和d聚电解质溶液中，所述d 聚电解质是可以与c聚电解质通过静电、氢键、配位键等相互作用进行LbL的 聚电解质，循环交替浸泡可以在红色构筑基元表面修饰一定厚度的含有该超分 子受体的聚电解质多层膜。

同样，接枝有生物识别分子的聚电解质可以通过步骤3)修饰到磁响应性 生物相容性构筑基元表面。

将磁响应性生物相容性构筑基元换为基底，与上述步骤1)至步骤3)相 同，可在基底表面修饰超分子。

4.磁诱导修饰有超分子的磁响应性生物相容性构筑基元构筑三维有序结 构

1)在有一定量水的培养皿中放置修饰有超分子的基底，在水面分散修饰 有超分子的磁响应性生物相容性构筑基元；

2)用磁铁或者三维磁操作装置施加局部磁场，使磁响应性生物相容性构 筑基元响应外磁场，可以随着磁场的移动或变化而运动，操作磁场将磁响应性 生物相容性构筑基元定位至指定位置；

3)缓慢吸水以降低水位，使修饰有超分子的磁响应性生物相容性构筑基 元与修饰有超分子的基底表面充分接触，达到分子间作用距离，一段时间后， 该磁响应性生物相容性构筑基元可以通过其表面修饰的超分子给(受)体与修 饰有超分子受(给)体的基底通过超分子相互作用固定，即构筑基元表面修饰 的超分子给(受)体分子和基底表面修饰的超分子受(给)体分子发生超分子 相互作用，该磁响应性生物相容性构筑基元被固定后，将不再受磁场变化的影 响；

本发明中所述超分子给受体是指一种超分子相互作用(例如静电相互作 用)涉及的作用双方。

4)重新加水，用磁场诱导第二个修饰超分子给(受)体的磁响应性生物 相容性构筑基元，磁搬运至指定位置，即与第一根已固定的磁响应性生物相容 性构筑基元长条相互平行且端点相互平齐的位置，二者间距可以在十微米至一 毫米范围内调节，按照上述步骤3)继续定位和固定，可以在基底上构筑所需 要的磁响应性生物相容性构筑基元图案，形成第一层磁响应性生物相容性构筑 基元；

5)类似步骤3)和4),用磁场诱导修饰有超分子给(受)体的磁响应性生物 相容性构筑基元运动，磁搬运至第一层已组装的磁响应性生物相容性构筑基元 上方，使该修饰有超分子给(受)体的磁响应性生物相容性构筑基元通过超分 子相互作用固定在第一层已组装的磁响应性生物相容性构筑基元之上，形成第 二层磁响应性生物相容性构筑基元；

6)自下而上地构筑所需层数的三维有序结构。

5.磁诱导修饰有超分子和/或生物识别作用的分子的磁响应性生物相容性 构筑基元构筑在特定位点具有特定生长因子的三维有序结构

1)对于不同的生长因子(属于蛋白类物质)，首先，通过1-(3-二甲氨基丙 基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/N-羟基丁二酰亚胺，即EDC/NHS催化体系，在水 溶液中分别对生长因子进行特异性识别位点标记，如生物素(biotin)标记和芽孢 杆菌rna酶抑制剂(barstar)标记；

2)将部分磁响应性生物相容性构筑基元修饰超分子，部分磁响应性生物 相容性构筑基元同时修饰超分子和带有生物识别作用的分子(biotin或barstar)；

3)在有一定量水的培养皿中放置修饰有超分子的基底，在水面分散修饰 有超分子的磁响应性生物相容性构筑基元；

4)用磁铁或者三维磁操作装置施加局部磁场，使修饰有超分子的磁响应 性生物相容性构筑基元响应外磁场，可以随着磁场的移动或变化而运动，操作 磁场将任意一个磁响应性生物相容性构筑基元移至修饰有超分子的基底上方 任意位置；

5)缓慢吸水以降低水位，使修饰有超分子的生物相容性构筑基元与修饰 有超分子的基底表面充分接触，达到分子间作用距离，一段时间后，该修饰有 超分子的磁响应性生物相容性构筑基元可以通过其表面的超分子给(受)体与 修饰有超分子受(给)体的基底表面通过超分子相互作用固定，即构筑基元表面 修饰的超分子给(受)体分子和基底表面修饰的超分子受(给)体分子发生超 分子相互作用，该磁响应性生物相容性构筑基元被固定后，将不再受磁场变化 的影响；

6)重新加水，用磁场操作第二个修饰有超分子的磁响应性生物相容性构 筑基元，磁搬运至基底上指定位置，即与第一个已固定构筑基元相互平行且端 点相互平齐的位置，二者间距可以在十微米至一毫米范围内调节，按照上述步 骤5)继续定位和固定，形成第一层互相平行、周期性排列的磁响应性生物相 容性构筑基元；

7)类似步骤5)和6)，用磁场诱导同时修饰有超分子和生物识别作用分 子(biotin)的磁响应性生物相容性构筑基元运动，磁搬运至第一层磁响应性生物 相容性构筑基元上方，其放置位置具有以下特征：与第一层构筑基元有交点， 与第一层所有构筑基元之间的夹角可以在0-90度之间调节。使该磁响应性生 物相容性构筑基元通过超分子相互作用固定在第一层磁响应性生物相容性构 筑基元上；

8)类似步骤7)，用磁场诱导同时修饰有超分子和另一种生物识别作用分 子(barstar)的磁响应性生物相容性构筑基元至同一层另一位置，或者其它层的 所需位置；

9)自下而上地构筑所需层数的三维有序结构，并在所需位置引入带有特 异性生物识别位点的生物相容性构筑基元；

10)将步骤9)所制备的三维有序结构浸泡于可以和biotin、barstar特异性 识别的蛋白混合溶液(即亲和素avidin、芽孢杆菌rna酶barnase)中，使三维有 序结构中的生物识别位点可以分别通过各自的特异性生物结合作用 (biotin/avidin识别，barstar/barnase识别)，识别对应的生长因子，实现三维有 序结构中不同生长因子的定向引入，为进一步细胞分化提供复杂的化学、生物 三维环境；

11)对于所制备的三维有序结构，通过MTT标准方法进行细胞毒性评价， 培养成纤维细胞、脂肪干细胞、内皮细胞、间充质干细胞等进行细胞吸附实验， 对于吸附有间充质干细胞的三维支架进行长时间培养，考察干细胞在所引入生 长因子作用下的分化情况。

所述的生物相容性构筑基元包括PDMS、水凝胶、聚乳酸、聚乳酸-乙二醇 酸、聚己内酯、胶原、壳聚糖等。

所述的宏观超分子组装尺度包含十微米至一厘米尺度范围。

本发明制备的宏观超分子组装的三维有序组织工程支架为堆垛状三维有 序结构，所述三维有序结构由多个在二维方向平行地、周期性有序排列的构 筑基元构成，两个相互接触的构筑基元通过各自表面上修饰的互补的给(受) 体官能团发生超分子相互作用而实现两个表面的连接；所述支架的大小为10^-5～10^-2m。

本发明的有益效果如下：

本发明提供的宏观超分子组装制备三维有序组织工程支架的方法，通过多 种微加工方法获得尺寸在十微米至一厘米的生物相容性构筑基元，并在生物相 容性构筑基元的制备中引入磁性纳米粒子以使构筑基元响应外磁场。对所制备 的生物相容性构筑基元进行表面修饰获得带有超分子作用如主客体识别、静 电、氢键、配位的互补官能团以及生物识别作用的互补官能团，使得上述互补 生物相容性构筑基元可以通过超分子相互作用实现宏观超分子组装而固定下 来。进而，利用外磁场在三维空间内对生物相容性构筑基元进行准确定位，并 在指定位置利用操作平台基底与生物相容性构筑基元之间的超分子相互作用 固定生物相容性构筑基元，从而自下而上逐步构建十微米至一厘米尺寸范围的 三维有序结构；在三维结构构筑过程中，通过生物相容性构筑基元表面生物识 别位点可以定向引入指定生长因子，从而实现多种生长因子在三维支架材料内 部的定向引入。该方法可以提供一种新的制备具有复杂化学、生物环境的三维 有序结构的方法，是一种具有普适性的、温和的、生物相容的制备方法，有望 用于制备诱导细胞分化的模版和三维组织工程支架。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1a和图1b示出合成四氧化三铁纳米粒子的透射电镜照片；

图2a示出合成纯四氧化三铁纳米粒子和

图2b示出磁响应性构筑基元的磁滞回线；

图3示出方形亚克力模版及机械夹紧光学照片；

图4示出磁响应性PDMS立方体构筑基元；

图5示出磁响应性水凝胶构筑基元；

图6示出冰冻切片法制备构筑基元流程示意图；

图7示出冰冻切片法制备的PDMS条状构筑基元；

图8示出微压印法制备微米级构筑基元示意图；

图9a，图9b，图9c和图9d示出紫外光刻法制备的SU8光刻胶阵列；

图10a和图10b示出微压印法制备的微米级水凝胶构筑基元荧光照片

图10c和图10d示出微压印法制备的微米级水凝胶构筑基元水中剥离普通 光学照片；

图11a示出合成产品PAA-CD核磁谱图；

图11b示出合成产品PAA-Azo核磁谱图；

图12示出交替层状自组装技术法修饰构筑基元表面流程示意图；

图13示出磁诱导宏观超分子组装构筑三维有序结构流程示意图；

图14a，图14b，图14c和图14d示出磁诱导宏观超分子组装所构筑的三 维有序结构；

图15a和图15b示出特定位点具有特定生长因子的三维有序结构；

图16示出材料的细胞毒性评价结果；

图17a和图17b示出细胞吸附实验结果。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一 步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员 应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制 本发明的保护范围。

1.水热法制备四氧化三铁磁性纳米粒子

1)、将六水合三氯化铁溶于乙二醇中，搅拌形成清亮黄色溶液。

2)、加入醋酸钠和聚乙二醇，继续剧烈搅拌30分钟，形成土黄色浊液， 加入到聚四氟乙烯反应釜中，密封，在200摄氏度下加热10小时。

3)、冷却至室温，用乙醇洗涤所得到的四氧化三铁纳米粒子，洗涤三次， 在60摄氏度真空烘箱内干燥6小时，获得黑色粉体，其尺寸大小和磁滞回线 分别如图1a和图1b、图2a和图2b所示。

2.1机械微加工模版浇铸法制备毫米级磁响应性生物相容性构筑基元

对于毫米及以上尺度的生物相容性构筑基元，可以通过传统机械加工模版 浇铸成型的方式制备。

1)采用机械加工行业中的激光雕刻技术，在聚甲基丙烯酸甲酯(亚克力) 板材上镂刻所需空心图案，作为制备生物相容性构筑基元的模版。借助于计算 机辅助技术，模版上图案的形状、尺寸大小均容易在毫米及以上尺度进行控制 和调节。以方形图案为例，可以作为浇铸立方体生物相容性构筑基元的模版， 如图3所示；

2)用乙醇、去离子水依次清洗模版，干燥后固定于平整玻璃表面；

3)在室温下，将液态生物相容性构筑基元(以PDMS为例，其预聚体和交 联剂的混合物)与所制备的四氧化三铁纳米粒子充分混合分散，将所得到的混 合物填充到固定在玻璃板上的模版方孔内；

4)在上方扣压另一玻璃板，并将玻璃板-模版-玻璃板三者夹紧，在65摄 氏度烘箱中加热一段时间，固化，脱模得到分立的磁响应性的立方体PDMS 小块作为生物相容性构筑基元，如图4所示。

对于水凝胶生物相容性构筑基元的制备，可以采用同样步骤，将水凝胶单 体、交联剂、引发剂混合均匀后的液体，与磁性纳米粒子充分混合分散，填充 到模版中，通过热引发或光引发聚合形成凝胶后，脱模即可，如图5所示。对 于聚乳酸、聚乳酸-乙二醇酸、聚己内酯、胶原、壳聚糖等低熔点材料，可以 在较高温度下使其成为熔融液体，与磁性纳米粒子混合后浇铸于金属模版中， 然后冷却至室温固化、脱模。

2.2冰冻切片法制备微米尺度磁响应性生物相容性构筑基元

1)、将载玻片用Piranha洗液(浓硫酸：过氧化氢＝3：1v/v)进行清洗，去 离子水冲洗，氮气吹干。在密闭容器内，滴加少量1H,1H,2H,2H-全氟辛基三乙 氧基硅烷，分立放置洗净的载玻片，在60摄氏度下通过气相沉积该全氟硅烷 至载玻片上，使载玻片呈现疏水性。

2)、如图6所示，以PDMS为例，首先将PDMS预聚体及其交联剂、磁 性纳米粒子以一定比例混合，滴于所制备的疏水载玻片上，两端垫厚度为150 微米的盖玻片，上方按压疏水载玻片，形成疏水载玻片-PDMS混合物-疏水载 玻片夹层结构，在65摄氏度下加热固化，脱模得到厚度为150微米的PDMS 薄片。

3)、在显微镜下，将上述150微米的PDMS薄片裁成宽度为2毫米×2毫 米×150微米的薄片。

4)、用冰冻包埋剂OCT包覆上述薄片，设定冰冻切片机步进距离，将包 埋了的薄片放置在垂直于冰冻切片机刀口的位置，在步进马达的控制下进行切 割，可以批量得到尺寸为2毫米×150微米×10～100微米的长条，其中10～100 微米为可设定可调整的步进距离，如图7所示。

2.3微压印法制备微米尺度磁响应性生物相容性构筑基元

微压印法流程如图8所示：

1)、以200微米×25微米×20微米水凝胶长条为例，用紫外光刻法在硅 片表面制备SU8光刻胶的阵列，如图9所示，图9a是长条状SU8光刻胶阵列， 图9b为其中一个长条构筑基元的放大图及相应尺寸，图9c是长条构筑基元的 横断面图，图9d是图9c中长条横断面图的尺寸。

2)、在SU8光刻胶阵列上旋涂PDMS预聚体及其交联剂的混合物，对上 述阵列进行复制，得到相反图案的长条形空穴，作为模版。

3)、将水凝胶单体、交联剂、引发剂和增粘剂混合，并分散磁性纳米粒子， 将该混合物滴至上述PDMS模版上，并覆盖聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄片， 压紧。

4)、将PDMS-水凝胶单体混合物-PET夹层结构通过纳米热压仪压紧，可 以充分填充PDMS上长条型空穴，同时去除所溢出和残留在模版与PET之间 的液体。

5)、通过365nm紫外光照或加热引发水凝胶交联、固化。揭开PET，由 于PET的表面能与凝胶长条的表面能更加匹配，所以揭开PET过程中，所固 化的凝胶块体会粘附于PET上，可以在水中脱落和收集分立的水凝胶长条，如 图10a，图10b，图10c和图10d所示。

为了区分磁响应性生物相容性构筑基元表面修饰的官能团，在混合液体中 可以掺入少量染料以作区分。

3.磁响应性生物相容性构筑基元表面修饰带有超分子作用的官能团

1)用于交替层状组装技术的修饰有超分子的聚电解质合成：采用接枝反 应或自由基共聚方式，将超分子环糊精和偶氮苯引入至聚丙烯酸(PAA)这一聚 电解质中，获得聚丙烯酸-环糊精(PAA-CD)、聚丙烯酸-偶氮苯(PAA-Azo)，核 磁图如图11a和11b所示。

2)将磁响应性生物相容性构筑基元(以PDMS立方体小块为例)通过乙醇、 去离子水超声的方式洗净。

3)配制交替层状自组装(LbL)过程所需的聚电解质溶液：聚丙烯酸-环糊精 (PAA-CD)、聚丙烯酸-偶氮苯(PAA-Azo)：0.1-1.0mg/mL。

4)如附图12所示，将一种生物相容性构筑基元(染成绿色)交替循环浸泡 于聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(PDDA)和PAA-CD溶液中，获得一定厚度的 PDDA/PAA-CD多层膜；将另一种生物相容性构筑基元(染成红色)交替循环浸 泡于PDDA和PAA-Azo溶液中，获得一定厚度的PDDA/PAA-Azo多层膜。这 样，生物相容性构筑基元表面即可修饰带有环糊精或者偶氮苯的超分子。

此外，可以在聚(丙烯胺盐酸盐)(PAH)侧链接枝生物素(biotin)成为 PAH-biotin，通过参与上述交替层状组装技术形成含有生物素一种超分子的 PAH-biotin/PAA多层膜，或者同时带有环糊精与生物素两种超分子的 PAH-biotin/PAA-CD多层膜。类似地，可以引入含有芽孢杆菌rna酶的聚电解 质PAH-barnase，获得PAH-barnase/PAA-CD的多层膜。

在预浇铸溶液中混合带有超分子的化合物，例如PAA-CD或PAA-Azo，也 可以实现所制备生物相容性构筑基元的表面修饰上超分子。

三维有序结构操作平台基底(石英片、玻璃片或硅片)的表面修饰：首先， 用Piranha洗液(浓硫酸：过氧化氢＝3：1v/v)对石英片或玻璃片或硅片进行清 洗，去离子水冲洗，氮气吹干；然后将石英片或玻璃片或硅片交替循环浸泡于 PDDA和PAA-CD溶液中，获得一定厚度的PDDA/PAA-CD多层膜。

4.磁诱导修饰有超分子的磁响应性生物相容性构筑基元组装构筑三维有 序结构

1)以长条状磁响应性PDMS生物相容性构筑基元为例，在有一定量水的 培养皿中放置修饰有PDDA/PAA-CD多层膜的石英片或玻璃片或硅片基底，在 水面分散修饰有偶氮苯超分子的PDMS长条；

2)如图13所示，用磁铁或者三维磁操作装置施加局部磁场，使修饰有偶 氮苯超分子的PDMS长条响应外磁场，可以随着磁场的移动或变化而运动，操 作磁场将修饰有偶氮苯超分子的PDMS长条定位至基底上的任意位置；

3)缓慢吸水以降低水位，使修饰有偶氮苯超分子的PDMS长条与操作平 台基底表面充分接触，达到分子间作用距离，一段时间后，该PDMS条可以通 过其表面的偶氮苯超分子与操作平台基底表面的环糊精超分子通过超分子相 互作用使修饰有偶氮苯超分子的PDMS条固定在基底上的任意位置，其固定后 不再受磁场变化的影响；

4)重新加水，用磁场操作第二根修饰有偶氮苯超分子的PDMS长条，磁 搬运至基底上与第一根PDMS长条相互平行且端点相互平齐的位置，二者间距 可以在十微米至一毫米范围内调节，按照上述步骤3)继续定位和固定，可以 在操作平台基底上构筑所需要的修饰有偶氮苯超分子的PDMS长条的图案，形 成第一层平行、周期性排列的磁响应性生物相容性构筑基元；

5)重新加水，用磁场诱导修饰有环糊精超分子的PDMS长条运动，磁搬 运至第一层修饰有偶氮苯超分子的PDMS长条上方，其放置位置具有一下特 征：与第一层PDMS条有交点，与第一层所有PDMS条之间的夹角可以在0-90 度之间调节。按照这一排列方式，修饰有环糊精超分子的PDMS长条通过超分 子作用固定在修饰有偶氮苯超分子的PDMS层上，形成第二层磁响应性生物相 容性构筑基元；

6)自下而上地构筑所需层数的三维有序结构，对于所得到的三维有序结 构，其磁响应性生物相容性构筑基元的位置、间距和层数均在三维空间内可调， 如图14a，图14b，图14c和图14d所示。

5.磁诱导修饰有超分子和/或生物识别作用的分子的磁响应性生物相容性 构筑基元组装构筑在特定位点具有特定生长因子的三维有序结构

1)以引入两种不同的生长因子，血管内皮生长因子(VEGF)和成纤维细 胞生长因子(FGF)为例，首先，通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐 酸盐/N-羟基丁二酰亚胺，即EDC/NHS催化体系，在水溶液中对两种生长因子 VEGF和FGF进行生物素(biotin)标记和芽孢杆菌rna酶抑制剂(barstar)标记， 得到VEGF-biotin，FGF-barstar；

2)以长条状磁响应性PDMS生物相容性构筑基元为例，将部分PDMS长 条修饰环糊精或偶氮苯超分子，部分PDMS长条同时修饰环糊精超分子和亲和 素(avidin)分子，部分PDMS长条同时修饰环糊精超分子和芽孢杆菌rna酶分子， 部分PDMS长条同时亲和素分子和偶氮苯超分子，部分PDMS长条同时修饰 芽孢杆菌rna酶分子和偶氮苯超分子；

3)在有一定量水的培养皿中放置修饰有PDDA/PAA-CD多层膜的石英片 或玻璃片或硅片基底，在水面分散修饰有偶氮苯超分子的PDMS长条；

4)用磁铁或者三维磁操作装置施加局部磁场，使修饰有偶氮苯超分子的 PDMS长条响应外磁场，可以随着磁场的移动或变化而运动，操作磁场将修饰 有偶氮苯超分子的PDMS长条定位至基底上的指定位置；

5)缓慢吸水以降低水位，使修饰有偶氮苯超分子的PDMS长条与操作平 台基底表面充分接触，达到分子间作用距离，一段时间后，该修饰有偶氮苯超 分子的PDMS条可以通过其表面的偶氮苯超分子与操作平台基底表面的环糊 精超分子通过超分子相互作用固定，其固定后不再受磁场变化的影响；

6)重新加水，用磁场操作第二根修饰有偶氮苯超分子的PDMS长条，磁 搬运至基底上的指定位置，按照上述步骤5)继续定位和固定，可以在操作平 台基底上构筑所需要的修饰有偶氮苯超分子的PDMS长条的图案，形成第一层 磁响应性生物相容性构筑基元；

7)重新加水，用磁场诱导同时修饰有环糊精超分子和亲和素分子的PDMS 长条运动，磁搬运至第一层修饰有偶氮苯超分子的PDMS长条上方，使修饰有 环糊精超分子和亲和素分子的PDMS长条通过超分子相互作用固定在修饰有 偶氮苯超分子的PDMS层上，形成第二层磁响应性生物相容性构筑基元；

8)类似步骤7)，用磁场诱导同时含有芽孢杆菌rna酶分子和环糊精超分 子的PDMS长条，固定至同一层另一位置，或者磁诱导同时含有芽孢杆菌rna 酶分子和偶氮苯超分子的PDMS长条固定至相邻层的指定位置，也可以是磁诱 导同时含有亲和素分子和偶氮苯超分子的PDMS长条固定至相邻层的指定位 置；

9)自下而上地构筑所需层数的三维有序结构，并在所需位置引入带有特 异性识别位点(如avidin，barstar)的PDMS生物相容性构筑基元，如图15a 和图15b所示；

10)将步骤9)所制备的结构浸泡于VEGF-biotin和FGF-barstar的混合溶液 中，使三维有序结构中的avidin位点和barnase位点可以分别通过biotin/avidin 或barnase/barstar特异性结合作用，识别对应的VEGF-biotin和FGF-barstar生 长因子，实现三维有序结构中不同生长因子的定向引入，为进一步细胞分化提 供复杂的化学、生物三维环境；

11)对于步骤9)所制备的结构，通过MTT标准方法进行细胞毒性评价， 结果表明所用材料没有细胞毒性(如图16所示)。培养成纤维细胞、脂肪干细 胞、内皮细胞、间充质干细胞等进行细胞吸附实验，对于吸附有间充质干细胞 的三维支架进行长时间培养，考察干细胞在所引入生长因子作用下的分化情 况。细胞吸附实验结果如附图17a和图17b所示，体现了较好的细胞吸附、迁 移、生长和分化效果。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而 并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在 上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有 的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变 化或变动仍处于本发明的保护范围之列。