一种促进肺癌细胞凋亡的药物组合物以及检测方法

摘要

本发明提供一种促进肺癌细胞凋亡的药物组合物，包括水飞蓟宾、替加氟和铂类药物；所述肺癌细胞选自非小细胞肺癌细胞株A549。本发明属于医药技术领域，本发明提供的药物组合物具有良好的肺癌细胞抑制效果，且可显著促进肺癌细胞的凋亡。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一种促进肺癌细胞凋亡的药物组合物以及肺癌细胞凋亡的检测方法。

背景技术

肺癌是一种常见的肺部恶性肿瘤，近年来的发病率和死亡率增长最快，对人类健康安全的威胁也越来越大。恶性肿瘤是危害人类生命健康的细胞性疾病，肿瘤细胞从生物体内正常细胞转化为恶性细胞，其形态、功能、代谢和增殖等都会发生变化，可以看作是细胞的异常分化导致其具有永生性。

水飞蓟宾(Silybin)是从菊科药用植物水飞蓟种子的种皮中提取所得的一种天然黄酮木脂素类化合物。水飞蓟宾呈黄色粉末，味苦，可溶于丙酮、乙酸乙酯、甲醇、乙醇，微溶于氯仿，几乎不溶于水。其分子式为C₂₅H₂₂O₁₀，摩尔质量为482.12。水飞蓟宾临床上主要用于治疗中毒性及酒精相关性肝病的治疗，还可作为抗氧化食品添加剂。药理学研究表明，水飞蓟宾能够清除机体内自由基，延缓衰老，对抗脂质过氧化，抑制一氧化氮的产生，减轻对组织细胞的毒素，保护肝细胞膜、改善肝功能，降血脂和保护心肌等作用。孙羿等在《水飞蓟宾对人膀胱癌细胞株5637增殖的抑制作用及其机制》一文中指出水飞蓟宾可抑制人膀胱癌细胞株5637的增殖，并能降低凋亡抑制因子Survivin的mRNA表达。中国专利申请201010238453.X公开了水飞蓟宾在治疗神经受损方面的用途。

替加氟是氟尿嘧啶的衍生物，在体内经肝脏活化转变为氟尿嘧啶而起抗肿瘤作用，能干扰和阻断DNA、RNA及蛋白质合成，主要作用于S期，是抗嘧啶类的细胞周期特异性药物。药理学研究表明，替加氟对胃癌、结肠癌、直肠癌、胰腺癌、乳腺癌和肝癌具有一定的疗效。

自从顺铂被发现具有抗癌活性以来，铂类抗癌药物的应用和研究得到了迅速发展，临床上常用的铂类抗癌药物有顺铂、卡铂和奥沙利铂等。奥沙利铂为第三代铂类抗癌药物，是第一个显现对结肠癌有效的络铂类烷化剂及在体内外均有广谱抗肿瘤活性的铂类抗癌药。奥利沙铂对大肠癌、非小细胞肺癌、卵巢癌及乳腺癌等多种肿瘤细胞株，包括对顺铂和卡铂耐药株均有显著的抑制作用。

目前，市场上仍缺少可以显著促进肺癌细胞凋亡的药物组合物。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种促进肺癌细胞凋亡的药物组合物，并提供了相应的肺癌细胞凋亡的检测方法。

一种促进肺癌细胞凋亡的药物组合物，包括水飞蓟宾、替加氟和铂类药物；所述肺癌细胞选自非小细胞肺癌细胞株A549。

发明人对现有的具有抗癌效果的药物进行了大量筛选和复配，预料不到地发现：通过水飞蓟宾、替加氟和铂类药物以一定重量比组合得到的药物组合物具有良好的肺癌细胞抑制效果，且可显著促进肺癌细胞的凋亡。

通常情况下，水飞蓟宾主要用于肝脏疾病的治疗，替加氟主要用于治疗消化系癌。铂类药物虽然具有较广泛的抗癌作用，但尚无文献报道铂类药物可与水飞蓟宾、替加氟联合作为组合物联合使用。替加氟即1-(四氢-2-呋喃基)-5-氟-2,4(1H,3H)-嘧啶二酮。

优选地，所述药物组合物中，水飞蓟宾、替加氟和铂类药物的质量比为(1~2)：(1~2)：(0.5~1)。

优选地，所述药物组合物中，水飞蓟宾、替加氟和铂类药物的质量比为2：2：1。

优选地，所述铂类药物选自卡铂或奥沙利铂。

优选地，所述药物组合物由水飞蓟宾、替加氟、铂类药物和药学上可接受的载体制得。

优选地，所述药物组合物为注射剂。

相应地，本发明还提供一种肺癌细胞凋亡的检测方法，包括如下步骤：

A）培养A549肺癌细胞，收集对数生长期细胞，调整细胞浓度，接种于6孔板中培养；

B）采用所述的药物组合物对所述肺癌细胞进行处理；

C）采用不含EDTA的胰酶消化所述肺癌细胞，并采用含有胎牛血清的培养基终止对肺癌细胞的消化，将终止消化后的肺癌细胞进行离心，弃除上清液，采用预冷的PBS缓冲液重悬细胞并转入无菌的离心管中，离心收集细胞；

D）加入Binding Buffer重悬，加入Annexin V-FITC后轻轻混匀，避光孵育，再加入PI，轻轻混匀，进行流式细胞仪检测。

细胞凋亡是指细胞在一定的生理或病理条件下，受内在遗传机制的控制自动结束生命的过程。细胞凋亡的过程大致可分为四个阶段：（1）凋亡信号转导；（2）凋亡基因激活；（3）凋亡的执行；（4）凋亡细胞的清除。 将Annexin V进行绿色荧光FITC（异硫氰酸荧光素）标记，以标记了的Annexin V作为探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶（PI）是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，它不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和坏死细胞，PI能够透过细胞膜在嵌入细胞核的双链DNA后释放红色荧光。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供药物组合物包括水飞蓟宾、替加氟和铂类药物，具有良好的肺癌细胞抑制效果，且可显著促进肺癌细胞的凋亡，对肺癌细胞的增殖能力有显著的协同抑制作用，尤其对非小细胞肺癌细胞株A549具有非常好的抑制效果。

附图说明

图1 为效果实施例二中的对照组流式细胞仪检测图。

图2 为效果实施例二中的实施例一组流式细胞仪检测图。

图3 为效果实施例二中的对比例一组流式细胞仪检测图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步详细的说明。

本发明中，肺癌细胞株A549细胞株购自武汉大学中国典型培养物保藏中心，SPF级BALB/c-nu小鼠购自广东省医学实验动物中心，所使用的试剂均为常规市售试剂。

实施例一  促进肺癌细胞凋亡的药物组合物

备方法：取处方量的水飞蓟宾、替加氟和奥沙利铂，加入适量的去离子水，再加入1，2-丙二醇和泊洛沙姆进行充分溶解，加入氯化钠，混匀，过滤除菌即得。

实施例二  促进肺癌细胞凋亡的药物组合物

制备方法：同实施例一。

对比例一

与实施例一相比的不同之处在于：将水飞蓟宾由2.0g变为0g，将替加氟由2.0g变为3.0g，将奥沙利铂由1.0g变为2.0g。

制备方法：同实施例一。

对比例二

与实施例一相比的不同之处在于：将水飞蓟宾由2.0g变为3.0g，将替加氟由2.0g变为0g，将奥沙利铂由1.0g变为2.0g。

制备方法：同实施例一。

对比例三

与实施例一相比的不同之处在于：将水飞蓟宾由2.0g变为2.5g，将替加氟由2.0g变为2.5g，将奥沙利铂由1.0g变为0g。

制备方法：同实施例一。

效果实施例一  本发明提供的药物组合物对A549细胞裸鼠移植瘤生长的影响

取对数生长期的A549细胞，用无菌PBS溶液调整至细胞浓度为3×10⁷个/mL，在BALB/c-nu小鼠背部皮下接种A549细胞0.1ml，待皮下移植瘤体积达75 mm³左右时，按瘤体积和荷瘤鼠体重均衡原则分为6组，每组3只。

对照组：生理盐水；

实施例一组：2mg/kg水飞蓟宾+2mg/kg替加氟+1mg/kg奥沙利铂；

实施例二组：1.5mg/kg水飞蓟宾+2mg/kg替加氟+0.8mg/kg奥沙利铂；

对比例一组：3mg/kg替加氟+2mg/kg奥沙利铂；

对比例二组：3mg/kg水飞蓟宾+2mg/kg奥沙利铂；

对比例三组：2.5mg/kg水飞蓟宾+2.5mg/kg替加氟。

隔日给药1次，将上述组别分别采用腹腔注射的方式，共计8次，末次给药48 h后脱臼处死小鼠，切除移植瘤，称取瘤重。瘤重抑制率（%）= (1-实验组瘤重均值/对照组瘤重均值)×100%。通过瘤重的比较来体现各实验组药物对A549细胞裸鼠瘤生长的影响。数据以平均数±标准差表示，采用SPSS15.0软件进行统计学分析。

试验结果如表1所示。从表1可知，与对照组相比，实施例一组和实施例二组对A549细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用均具有极显著性差异（P＜0.01），而对比例一组、对比例二组和对比例三组则均不具有显著性差异（p＞0.05）；与对比例一组相比，实施例一组和实施例二组对A549细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用均具有极显著性差异（P＜0.01）；与对比例二组相比，实施例一组和实施例二组对A549细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用均具有极显著性差异（P＜0.01）；与对比例三组相比，实施例一组和实施例二组对A549细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用均具有极显著性差异（P＜0.01）。通过对比，可以发现：水飞蓟宾、替加氟和紫杉醇都对本发明提供的药物组合物的肿瘤抑制效果起着至关重要的影响，这三种成分的组合起到了协同增效作用。

注：^** 与对照组相比，P＜0.01；^## 与对比例一组相比，P＜0.01；^▲▲与对比例二组相比，P＜0.01；^■■与对比例三组相比，P＜0.01。

效果实施例二  本发明提供的药物组合物对A549肺癌细胞凋亡的影响

对照组：不含FBS的RPMI1640培养基；

实施例一组：2μg/mL水飞蓟宾+2μg/mL替加氟+1μg/mL奥沙利铂；

实施例二组：1.5μg/mL水飞蓟宾+2μg/mL替加氟+0.8μg/mL奥沙利铂；

对比例一组：3μg/mL替加氟+2μg/mL奥沙利铂；

对比例二组：3μg/mL水飞蓟宾+2μg/mL奥沙利铂；

对比例三组：2.5μg/mL水飞蓟宾+2.5μg/mL替加氟。

培养A549肺癌细胞，收集对数生长期细胞，调整细胞浓度至5×10⁴个/mL左右，每孔加入1.5mL，接种于6孔板中培养，培养24h后，分别采用对照组、实施例一组、实施例二组、对比例一组、对比例二组和对比例三组处理A549细胞；处理24h后，采用不含EDTA的胰酶消化所述肺癌细胞，并采用含有胎牛血清的培养基终止对肺癌细胞的消化，将终止消化后的肺癌细胞进行离心，弃除上清液，采用1mL预冷的PBS缓冲液重悬细胞并转入无菌的离心管中，离心，收集10⁵个细胞；加入1mL Binding Buffer重悬，加入5 μLAnnexin V-FITC后轻轻混匀，避光孵育，再加入5 μLPI，轻轻混匀，进行流式细胞仪检测。对照组的流式细胞检测图如图1所示，实施例一组的流式细胞检测图如图2所示，对比例一组的流式细胞检测图如图3所示。

通过对比图1至图3可知，实施例一组可显著促进A549肺癌细胞的早期凋亡，实施例一组的早期凋亡率明显高于对比例一组的早期凋亡率。可见：水飞蓟宾、替加氟和奥沙利铂都对本发明提供的药物组合物的肿瘤细胞增殖抑制效果起着至关重要的影响，这三种成分的组合起到了协同增效作用。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。