一种硅珠法结合离心套管提取DNA的方法

摘要

本发明公开了一种硅珠法结合离心套管提取DNA的方法，包括以下步骤：1)将检材置入离心套管的内套管内，将TES缓冲液、十二烷基肌氨酸钠、蛋白酶K混匀加入内套管内，置金属浴上裂解；2)离心机中离心，加入吸附液再次离心；3)去除内套管加入吸附液、硅珠悬浊液静置吸附；4)离心去除上清；5)离心吸去残液；6)加入冰乙醇离心去除上清；7)离心吸去残液；8)烘干硅珠，加入洗脱液孵化；9)加入PCR扩增液内扩增；本发明方法检出率高，最终模板保有量达50-70％，特别适用于微量检材的检验，可检出模板含量在100pg以上的现场DNA检材。

说明书

技术领域

本发明涉及一种提取DNA的方法，具体是对现有硅珠法的改进，采用硅珠 法结合离心套管提取DNA的方法。

背景技术

硅珠法是在高浓度的硫氰酸胍存在的条件下，DNA能够被二氧化硅特异性地 吸附；当条件消失后，DNA又可以从二氧化硅上解离出来。采用的细胞破碎条件 比较激烈和充分硫氰酸胍是高性能的蛋白变性剂，可以使蛋白质与DNA充分分 离，在硅珠吸附前，高速离心，可以将不溶性物质去除，吸附后漂洗将溶解性 PCR抑制剂除去。概括地说，即利用二氧化硅微粒特异捕获有机质溶液中DNA分 子的性能提取DNA的方法。

如中华人民共和国公共安全行业标准GA/T383-2002，法庭科学DNA实验室 检验规范中公开了硅珠法的提取步骤：

a)在检材中加入TES缓冲液和十二烷基肌氨酸钠，煮沸5min以上，离心 去载体；

b)加入吸附液混合后加入硅珠悬液，混合后置于室温15min左右；

c)离心去上清液，加入漂洗液，混合；

d)离心去上清，加入冷70％乙醇，混合；

e)离心去上清液，加入TES，56℃保温10min以上；

f)离心后4℃冰箱内备用。

以上这种方法在行业内广泛使用，其优点是提取后的DNA模板纯度高，基 本无杂质残留，有利于PCR扩增，对于血迹、烟头等杂质含量高、模板浓度高 的常规检材，提取效果好。但这种方法在微量检材检验时效果差，DNA面板损失 量较大，损失率高达80-90％，检出率低下。

发明内容

本发明的目的是提供一种硅珠法结合离心套管提取DNA的方法，该提取方 法适用于微量检材的检验。

为了达到上述目的，本发明的技术方案是：

一种硅珠法结合离心套管提取DNA的方法，包括以下步骤：

(1)将检材置入离心套管的内套管内，将TES缓冲液、十二烷基肌氨酸钠、 蛋白酶K(10mg/ml)按体积比10:2～3:2～3(优选体积比10:2:2)混匀后，取 160～200微升，加入离心套管的内套管内，置37～56℃(优选56℃)金属浴上 裂解20～30分钟，95～99℃(优选99℃)裂解10～15分钟。

在本专利中，离心套管采用专利文献CN103146569B公开的离心管，该离心 管包括离心管和内套管。

本步骤的目的是将DNA裂解，将DNA与蛋白质分离，从细胞核中释放出来。

(2)将离心套管放入离心机中13000～17000g(优选15000g)离心0.5～1 分钟，打开离心套管的管盖加入吸附液200～300微升，再次放入离心机13000～ 17000g离心2～5分钟。本步骤是利用具有过滤作用的离心套管去除载体和杂质。

(3)打开离心套管管盖，去除内套管，加入吸附液700～1000微升，加入 硅珠悬浊液10～16微升，静置吸附15～20分钟。本步骤的目的是将水溶性DNA 吸附在硅珠上。

上述吸附液优选硫氰酸胍。

(4)去除吸附液：将离心套管的离心管置于离心机内6000～8000g离心20～ 30秒，去除上清。

(5)充分去除吸附液：再次将离心套管的离心管置入离心机内6000～8000g 离心，离心时间优选30秒，吸去残液。

(6)加入600～800微升70％冰乙醇，充分涡旋后，将离心套管的离心管置 于离心机内6000～8000g离心20～30秒，去除上清。本步骤的目的是洗去残留 扩增抑制物，如残留吸附液。

(7)再次将离心套管的离心管置入离心机内6000～8000g离心，离心时间 优选30秒，吸去残液。

(8)置56℃金属浴上开盖烘干硅珠，充分去除残留乙醇，加入洗脱液20～ 100微升，充分涡旋后，置56～60℃金属浴上孵化15～20分钟，将DNA从硅珠 上释放出来。

(9)将硅珠悬浊液加入PCR扩增液内扩增，提高DNA模板产量。

本发明利用机械离心原理，使用离心套管将载体上的DNA充分移至离心管 内，并最大限度地过滤杂质，保留DNA模板；加大吸附液的用量，(现有技术用 量为300微升，本发明中用量在1200微升左右)，从而保证吸附液的浓度没有 明显下降，从而保证硅珠能够充分吸附DNA；删去现有技术中的漂洗步骤，不仅 简化提取流程，更重要的是减少DNA模板损失；减少乙醇漂洗步骤，在充分吸 取残留物的基础上，减少DNA模板损失；将硅珠悬浊液加入PCR扩增液内扩增， 使硅珠上的残留的DNA模板得到充分利用。

本发明方法检出率高，最终模板保有量达50-70％，特别适用于微量检材的 检验，可检出模板含量在100pg以上的现场DNA检材。

具体实施方式

实施例1

(1)将手套印棉签拭子置入离心套管的内套管内，将TES缓冲液、十二烷 基肌氨酸钠、蛋白酶K(10mg/ml)按体积比10:2:2混匀后，取200微升，加入 离心套管的内套管内，置56℃金属浴上裂解20分钟，95℃裂解10分钟；

(2)将离心套管放入离心机中17000g离心30秒，打开离心套管的管盖加 入吸附液200微升，再次放入离心机15000g离心2分钟；

(3)打开离心套管的管盖，去除内套管，加入硫氰酸胍1000微升，加入 硅珠悬浊液10微升，置自动涡旋仪上1300转吸附15分钟；

(4)将离心套管的离心管置于离心机内8000g离心30秒，去除上清；

(5)再次将离心套管的离心管置入离心机内8000g离心30秒，吸去残夜；

(6)加入750微升70％冰乙醇，充分涡旋后，将离心套管的离心管置于离 心机内8000g离心20秒，去除上清；

(7)再次将离心套管的离心管置入离心机内，8000g离心30秒，吸去残液；

(8)置56℃金属浴上开盖烘干硅珠，加入洗脱液20微升，充分涡旋后， 置56℃金属浴上孵化15分钟；

(9)将硅珠悬浊液加入PCR扩增液内扩增。

提取结果：检出模板含量在100pg的手套印棉签拭子。

实施例2

(1)将网线插头压片剪入离心套管的内套管内，将TES缓冲液、十二烷基 肌氨酸钠、蛋白酶K(10mg/ml)按体积比10:2:3混匀后，取160微升，加入离 心套管的内套管内，置56℃金属浴上裂解20分钟，99℃裂解15分钟；

(2)将离心套管放入离心机中15000g离心1分钟，打开离心套管的管盖 加入吸附液200微升，再次放入离心机13000g离心5分钟；

(3)打开离心套管的管盖，去除内套管，加入硫氰酸胍700微升，加入硅 珠悬浊液16微升，置自动涡旋仪上1000转吸附20分钟；

(4)将离心套管的离心管置于离心机内6000g离心30秒，去除上清；

(5)再次将离心套管的离心管置入离心机内，6000g离心30秒，吸去残夜；

(6)加入600微升70％冰乙醇，充分涡旋后，将离心套管的离心管置于离 心机内6000g离心30秒，去除上清；

(7)再次将离心套管的离心管置入离心机内，6000g离心30秒，吸去残液；

(8)置56℃金属浴上开盖烘干硅珠，加入洗脱液80微升，充分涡旋后， 置60℃金属浴上孵化15分钟；

(9)将硅珠悬浊液加入PCR扩增液内扩增。

提取结果：检出模板含量在100pg，检出率在80％以上。

实施例3

(1)将作案工具手柄擦拭子置入离心套管的内套管内，将TES缓冲液、十 二烷基肌氨酸钠、蛋白酶K(10mg/ml)按体积比10:3:3混匀后，取180微升， 加入离心套管的内套管内，置37℃金属浴上裂解30分钟，99℃裂解10分钟；

(2)将离心套管放入离心机中13000g离心1分钟，打开离心套管的管盖 加入吸附液300微升，再次放入离心机17000g离心2分钟；

(3)打开离心套管的管盖，去除内套管，加入硫氰酸胍1000微升，加入 硅珠悬浊液16微升，置自动涡旋仪上1200转吸附18分钟；

(4)将离心套管的离心管置于离心机内8000g离心20秒，去除上清；

(5)再次将离心套管的离心管置入离心机内，8000g离心30秒，吸去残夜；

(6)加入800微升70％冰乙醇，充分涡旋后，将离心套管的离心管置于离 心机内8000g离心20秒，去除上清；

(7)再次将离心套管的离心管置入离心机内，8000g离心30秒，吸去残液；

(8)置56℃金属浴上开盖烘干硅珠，加入洗脱液100微升，充分涡旋后， 置56℃金属浴上孵化20分钟；

(9)将硅珠悬浊液加入PCR扩增液内扩增。

提取结果：检出模板含量在100pg，检出率在80％以上。

上述实施例不以任何方式限制本发明，凡是采用等同替换或等效变换的方 式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。