二芳基取代的吡唑并环类衍生物、其制备方法及其在医药领域的应用

摘要

本发明公开了一种具有式I结构的二芳基取代的吡唑并环类衍生物、其制备方法及其在医药领域的应用。本发明的二芳基取代的吡唑并环类衍生物具有明显的SK-MEL28细胞抑制活性，可作为BRAF抑制剂，用于制备预防或治疗包括黑色素瘤在内的及其与B-RAF V600E突变相关疾病的药物，具有广阔的应用前景和价值。

说明书

技术领域

本发明涉及二芳基取代的吡唑并环类衍生物及其制备方法和应用，具体地，涉及一种具有B-RAF V600E突变高表达的SK-MEL28细胞抑制活性的二芳基取代的吡唑并环类衍生物、其制备方法及其在医药上的应用。

背景技术

肿瘤是威胁人类健康的最严重疾病之一，近年来随着细胞生物学和肿瘤药理学的发展，肿瘤的化学药物治疗发生了巨大改变。传统的化学治疗药物由于非特异性地阻断细胞分裂从而在杀死肿瘤细胞的同时也引起正常细胞死亡而逐渐遭到摒弃，同时，以肿瘤细胞中异常激活的信号通路中的关键节点蛋白作为靶点，发现高效、低毒、特异性强的小分子抑制剂已成为当今抗肿瘤药物研究开发的重要方向。在肿瘤中异常表达激活的受体酪氨酸激酶(RTK)由于在肿瘤发生发展、侵袭转移、化疗抗性等各个环节均发挥关键作用已成为抗肿瘤药物研究的热点。

细胞分裂素活化蛋白激酶(MAPKs)通过大量细胞表面受体介导胞内信号传递。在MAPK介导的通路中，RAF/MEK/ERK信号级联受到广泛关注，因为它在大量人类癌症的形成中起重要作用，特别是那些与RAF蛋白激活有关的作用。

研究表明RAF的激活主要包括通过N末端的调控区域来解除对RAF催化区域的抑制。RAS结合区域和富含半胱氨酸的区域都参与了激酶区域的相互作用以及RAF的自身抑制。这个基本作用模式适用于所有的三种Raf蛋白(A-RAF,B-RAF和C-RAF)。但是对于A-RAF和C-RAF来说还需要一些其他的步骤来达到最大程度的激活，如激活氨基酸残基的磷酸化和负调控氨基酸残基的去磷酸化。因此，B-RAF是该家族中最容易被RAS激活的蛋白。另外，B-RAF激酶的活性要比C-RAF和A-RAF高很多。

根据现有的研究成果，B-RAF为与细胞增殖相关的重要的同工型蛋白，且为致癌的RAS的重要靶标。已证实体内的异常突变仅在B-RAF的情况下发生，该异常突变被认为发生在皮肤恶性黑色素瘤中的发生率为30～60％ (Nature,2002,417,949～954)，在甲状腺癌中的发生率为30～50％，在结肠直肠癌中的发生率为5～20％，在卵巢癌中的发生率为30％或更少(Nature Rev.Mol.Cell Biology,2004,5,875～885)。迄今为止，已发现45种或更多种的B-RAF突变。突变的B-RAF蛋白在NIH3T3细胞(Nature,2002,417,949～954)和黑色素瘤细胞(Cancer Res.,2004,64,2338～2342)中被转变，且对于黑色素瘤的存活和转变是必不可少的(CancerRes.,2003,63,5198～5202)。因此，处于Raf/MEK/ERK的串联信号转导核心的B-Raf在肿瘤的存活中起着至关重要的作用。

RAF激酶抑制剂已被用于阻止肿瘤细胞增殖从而治疗以下的癌症：组织细胞淋巴瘤、小细胞肺癌和胰腺癌以及乳腺癌。Sorafenib是口服的抑制细胞生长的多靶点激酶抑制剂，被FDA批准用于治疗晚期肾细胞癌。Sorafenib通过抑制肿瘤细胞增生和肿瘤血管生成以阻止肿瘤生长(Clark等，2005，Clinical Cancer Res 11(15):5472-5480；Yu等，2005，Oncogene 24(46):6861-6869；Wilhelm等，2004，Cancer Res.64(19):7099-7109)。

但是上述靶向疗法的应用并不理想，会出现诸如耐药性以及一般人群缺乏肿瘤应答等问题。因此，本领域亟需开发新的抑制剂来克服肿瘤治疗中的诸多问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的高效低毒的BRAF抑制剂。

本发明的第一方面提供了一种如式I所示的化合物、其药学上可接受的盐、其前药、其水合物或溶剂合物：

式中：

n为1或2；

X为N或CH；

Y为卤素或NR₂R₃；

R₁选自下组：取代或未取代的C₁-C₈烷基、取代或未取代的C₃-C₈环烷基、取代或未取代的C₆-C₁₀芳基、含有1-3个杂原子的杂芳基，其中，所述取代是指具有选自下组的取代基：C₁-C₃烷基、C₁-C₃卤代烷基、C₃-C₈环烷基、C₆-C₁₀芳基、C₁-C₆烷氧基、卤素；

R₂选自下组：H、甲酰基、烷氧基羰基、-L₁NHC(O)OR_1a、-L₁NHC(O)NHR_1a、取代或未取代的C₃-C₆环烷基、取代或未取代的C₁-C₃烷基、取代或未取代的酰基；

其中，所述“取代”是指具有选自下组的取代基：氰基、-C(O)NH₂、羟基或C₁-C₆烷基；

L₁是任选地被1-3个各自独立地选自卤素、C₁-C₄烷基或卤素取代的C₁-C₄烷基取代的C₁-C₄亚烷基；

R_1a为H、C₁-C₄烷基或卤素取代的C₁-C₄烷基；

R₃为H或甲基；

R₄为H、卤素或C₁-C₄烷基；

R₅为H或卤素；

R₆为H、卤素、C₁-C₄烷氧基、C₁-C₄烷基；

R₇为卤素、H或C₁-C₄烷基。

在另一优选例中，所述芳基任选地被1-3个各自独立地选自卤素、CH₃或CF₃的取代基取代。

在另一优选例中，所述化合物选自下组：

N-{3-[3-(2-氨基-嘧啶-4-基)-4,5,6,7-四氢-吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基]-苯基}-2,6-二氟-苯磺酰胺；

N-{3-[3-(2-氨基-嘧啶-4-基)-4,5,6,7-四氢-吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基]-苯基}-甲磺酰胺；

N-{3-[3-(2-氨基-嘧啶-4-基)-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-B]吡唑-2-基]-苯基}-甲磺酰胺；

丙烷-1-磺酸{3-[3-(2-氨基-嘧啶-4-基)-4,5,6,7-四氢-吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基]-苯基}-酰胺；

丙烷-1-磺酸{3-[3-(2-异丁基氨基-嘧啶-4-基)-4,5,6,7-四氢-吡唑并 [1,5-a]吡啶-2-基]-苯基}-酰胺；

2,6-二氟-N-{3-[3-(2-异丁基氨基-嘧啶-4-基)-4,5,6,7-四氢-吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基]基-苯基}-苯磺酰胺；

N-{3-[3-(2-氨基-嘧啶-4-基)-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-2-基]-苯基}-2,6-二氟-苯磺酰胺；

丙烷-1-磺酸{3-[3-(2-氨基-嘧啶-4-基)-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-B]吡唑-2-基]-苯基}-酰胺；

N-{3-[3-(2-异丁基氨基-嘧啶-4-基)-4,5,6,7-四氢-吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基]-苯基}-甲磺酰胺；

丙烷-1-磺酸{3-[3-(2-异丁基氨基-嘧啶-4-基)-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-2-基]-苯基}-酰胺；

丙烷-1-磺酸(3-{3-[2-(2-氰基乙基氨基)-嘧啶-4-基]-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-2-基}-苯基)-酰胺；

N-(3-{3-[2-(2-氰基乙基氨基)-嘧啶-4-基]-4,5,6,7-四氢-吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基}基-苯基)-2,6-二氟-苯磺酰胺；

丙烷-1-磺酸{3-[3-(2-氰基-乙氨基-嘧啶-4-基)-4,5,6,7-四氢吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基]-苯基}-酰胺；

N-(3-{3-[2-(2-氰基乙基氨基)-嘧啶-4-基]-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-2-基}-苯基基)-2,6-二氟-苯磺酰胺；

N-(3-{3-[2-氨基吡啶-4-基]-4,5,6,7-四氢吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基}-2-氟苯基)-2,6-二氟苯磺酰胺；

N-(5-氯3-{3-[2-(2-氰基乙基氨基)-嘧啶-4-基]-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-2-基}-2-氟苯基基)-2,6-二氟苯磺酰胺；

N-(3-{3-[2-(2-氰基乙基氨基)-嘧啶-4-基]-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-2-基}-2,4-二氟苯基)-2,6-二氟苯磺酰胺；

N-(3-{3-[2-(2-氰基乙基氨基)-嘧啶-4-基]-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-2-基}-2,6-二氟苯基)-2,6-二氟苯磺酰胺；

甲基(S)-(1-((4-(2-(3-((2,6-二氟苯基)磺酰氨基)-2-氟苯基)-5,6-二氢-4H-吡咯[1,2-b]吡唑-3-基)嘧啶-2-基)氨基)丙烷-2-基)氨基甲酸酯；

2,6-二氟-N-(2-氟-3-(3-(2-((2-(甲基磺酰)乙基)氨基)嘧 啶-4-基)4H－5,6-二氢吡咯并[3，2-b]吡唑-2-基)苯基)苯磺酰胺。

本发明的第二方面提供了一种式I化合物的制备方法，所述方法包括步骤：

二取代炔烃中间体V与斯德酮III发生环加成反应，得到吡唑并环类衍生物I：

在另一优选例中，本步反应温度为170-180℃，较佳地为175℃。

本发明的第三方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有治疗有效量的如本发明的第一方面所述的式I化合物，或其药学上可接受的盐、互变异构体、光学异构体、药学上可接受的溶剂合物。

在另一优选例中，所述的药物组合物用于治疗与B-RAF V600E突变相关的疾病，或所述的药物组合物用于治疗与与B-RAF V600E突变相关的疾病。

在另一优选例中，所述的与B-RAF V600E突变相关的疾病选自下组：细胞异常增殖、形态变化、运动功能亢进，或其组合。

本发明的第四方面提供了一种B-RAF激酶抑制剂，所述抑制剂含有抑制有效量的如本发明的第一方面所述的式I化合物，或其药学上可接受的盐、互变异构体、光学异构体、药学上可接受的溶剂合物。

在另一优选例中，所述药学上可接受的盐是式I化合物的选自下组的盐：无机酸盐、有机酸盐、烷基磺酸盐、芳基磺酸盐，或其组合；较佳地，所述的盐选自下组：盐酸盐、氢溴酸盐、硝酸盐、硫酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐、丙酸盐、苯甲酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、甲基磺酸盐、乙基磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐，或其组合。

在另一优选例中，所述药学上可接受的溶剂合物，是指式I化合物与选自下组的溶剂形成的溶剂合物：水、乙醇、异丙醇、乙醚、丙酮，或其组合。

本发明的第五方面提供了式I化合物的用途，用于：

(a)制备B-RAF抑制剂；

(b)用于体外非治疗性地抑制SK-MEL28细胞的活性； 

(c)用于体外非治疗性地抑制肿瘤细胞生长；

(d)用于制备治疗B-RAF V600E突变抑制活性的药物。

本发明的第六方面提供了一种体外非治疗性的抑制B-RAF激酶的方法，所述方法包括步骤：

在式I化合物或其药学上可接受的盐存在的情况下，培养细胞，从而抑制所述细胞中B-RAF激酶活性。

本发明的第七方面提供了一种治疗与BRAF V600E突变相关疾病的方法，所述方法包括步骤：

向治疗对象施用治疗有效剂量的如本发明第一方面所述的式I化合物或其药学上可接受的盐、互变异构体、光学异构体、药学上可接受的溶剂合物。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

具体实施方式

本发明人经过长期而深入的研究，意外地制备了一类具有如式I所示结构的化合物，且所述的化合物是一类有效的B-RAF抑制剂，特别适合用作B-RAF V600E突变抑制活性的抑制剂。基于上述发现，发明人完成了本发明。

术语

在本发明中，所述的烷基包括直链或支链的烷基，所述的链烯基包括直链或支链的链烯基，所述的链炔基包括直链或支链的炔基，所述的卤素为F、Cl、Br或I。

除非特别说明，在本发明中，术语“取代”指基团上的一个或多个氢原子被选自下组的取代基取代：C1～C4烷基、C3～C7环烷基、C1～C4烷氧基、卤 素、羟基、羧基(-COOH)、C1～C4醛基、C2～C4酰基、C2～C4酯基、氨基、苯基；所述的苯基包括未取代的苯基或具有1-3个取代基的取代苯基，所述取代基选自：卤素、C1-C4烷基、氰基、OH、硝基、C3～C7环烷基、C1～C4烷氧基、氨基。

特别地，在本文中，除非特别说明，所提到的原子包括其所有同位素的形式，例如，当提到“氢原子”时，指氢原子、氘原子、氚原子或其组合。在本发明中，某元素各种同位素原子的丰度可以是该元素在自然界中天然存在的状态，也可以是某种同位素富集的状态。

术语“C1～C6烷基”指具有1～6个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、或类似基团。

特别地，除非特别说明，在本发明中，当未限定基团的碳原子个数时，指具有1-10个碳原子，优选1-6个碳原子的基团。

在另一优选例中，所述的杂环为饱和环或不饱和环。

术语“C1～C4烷氧基”指具有1-4个碳原子的直链或支链烷氧基，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、或类似基团。

术语“烷基酰基”或“烷基羰基”指具有“-CO-烷基”结构的基团，例如甲基酰基、乙基酰基、丙基酰基、异丙基酰基、丁基酰基、异丁基酰基、仲丁基酰基、叔丁基酰基、或类似基团。

术语“药学上可接受的溶剂合物”指相应的化合物与水、乙醇、异丙醇、乙醚、丙酮的溶剂合物。

式I化合物

本发明提供了一种如式I所示的化合物：

式中：

n为1或2；

X为N或CH；

Y为卤素或NR₂R₃；

R₁选自下组：取代或未取代的C₁-C₈烷基、取代或未取代的C₃-C₈环烷基、取代或未取代的C₆-C₁₀芳基、含有1-3个杂原子的杂芳基，其中，所述取代是指具有选自下组的取代基：C₁-C₃烷基、C₁-C₃卤代烷基、C₃-C₈环烷基、C₆-C₁₀芳基、C₁-C₆烷氧基、卤素；

R₂选自下组：H、甲酰基、烷氧基羰基、-L₁NHC(O)OR_1a、-L₁NHC(O)NHR_1a、取代或未取代的C₃-C₆环烷基、取代或未取代的C₁-C₃烷基、取代或未取代的酰基；

其中，所述“取代”是指具有选自下组的取代基：氰基、-C(O)NH₂、羟基或C₁-C₆烷基；

L₁是任选地被1-3个各自独立地选自卤素、C₁-C₄烷基或卤素取代的C₁-C₄烷基取代的C₁-C₄亚烷基；

R_1a为H、C₁-C₄烷基或卤素取代的C₁-C₄烷基；

R₃为H或甲基；

R₄为H、卤素或C₁-C₄烷基；

R₅为H或卤素；

R₆为H、卤素、C₁-C₄烷氧基、C₁-C₄烷基；

R₇为卤素、H或C₁-C₄烷基。

在另一优选例中，所述芳基任选地被1-3个各自独立地选自卤素、CH₃或CF₃的取代基取代。

在另一优选例中，所述化合物选自下组：

N-{3-[3-(2-氨基-嘧啶-4-基)-4,5,6,7-四氢-吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基]-苯基}-2,6-二氟-苯磺酰胺；

N-{3-[3-(2-氨基-嘧啶-4-基)-4,5,6,7-四氢-吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基]-苯基}-甲磺酰胺；

N-{3-[3-(2-氨基-嘧啶-4-基)-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-B]吡唑-2-基]-苯基}-甲磺酰胺；

丙烷-1-磺酸{3-[3-(2-氨基-嘧啶-4-基)-4,5,6,7-四氢-吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基]-苯基}-酰胺；

丙烷-1-磺酸{3-[3-(2-异丁基氨基-嘧啶-4-基)-4,5,6,7-四氢-吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基]-苯基}-酰胺；

2,6-二氟-N-{3-[3-(2-异丁基氨基-嘧啶-4-基)-4,5,6,7-四氢-吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基]基-苯基}-苯磺酰胺；

N-{3-[3-(2-氨基-嘧啶-4-基)-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-2-基]-苯基}-2,6-二氟-苯磺酰胺；

丙烷-1-磺酸{3-[3-(2-氨基-嘧啶-4-基)-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-B]吡唑-2-基]-苯基}-酰胺；

N-{3-[3-(2-异丁基氨基-嘧啶-4-基)-4,5,6,7-四氢-吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基]-苯基}-甲磺酰胺；

丙烷-1-磺酸{3-[3-(2-异丁基氨基-嘧啶-4-基)-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-2-基]-苯基}-酰胺；

丙烷-1-磺酸(3-{3-[2-(2-氰基乙基氨基)-嘧啶-4-基]-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-2-基}-苯基)-酰胺；

N-(3-{3-[2-(2-氰基乙基氨基)-嘧啶-4-基]-4,5,6,7-四氢-吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基}基-苯基)-2,6-二氟-苯磺酰胺；

丙烷-1-磺酸{3-[3-(2-氰基-乙氨基-嘧啶-4-基)-4,5,6,7-四氢吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基]-苯基}-酰胺；

N-(3-{3-[2-(2-氰基乙基氨基)-嘧啶-4-基]-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-2-基}-苯基基)-2,6-二氟-苯磺酰胺；

N-(3-{3-[2-氨基吡啶-4-基]-4,5,6,7-四氢吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基}-2-氟苯基)-2,6-二氟苯磺酰胺；

N-(5-氯3-{3-[2-(2-氰基乙基氨基)-嘧啶-4-基]-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-2-基}-2-氟苯基基)-2,6-二氟苯磺酰胺；

N-(3-{3-[2-(2-氰基乙基氨基)-嘧啶-4-基]-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-2-基}-2,4-二氟苯基)-2,6-二氟苯磺酰胺；

N-(3-{3-[2-(2-氰基乙基氨基)-嘧啶-4-基]-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-2-基}-2,6-二氟苯基)-2,6-二氟苯磺酰胺；

甲基(S)-(1-((4-(2-(3-((2,6-二氟苯基)磺酰氨基)-2-氟苯基)-5,6-二氢-4H-吡咯[1,2-b]吡唑-3-基)嘧啶-2-基)氨基)丙烷-2-基)氨基甲酸酯；

2,6-二氟-N-(2-氟-3-(3-(2-((2-(甲基磺酰)乙基)氨基)嘧啶-4-基)4H－5,6-二氢吡咯并[3，2-b]吡唑-2-基)苯基)苯磺酰胺。

更优选地，本发明所述的式I化合物如表1中所示。

表1

式I化合物的制备方法

本发明还提供了一种式I化合物的制备方法，所述方法包括步骤：

二取代炔烃中间体V与斯德酮III发生环加成反应，得到吡唑并环类衍生物I：

在另一优选例中，本步反应温度为170-180℃，较佳地为175℃。

药学上可接受的盐

本发明化合物的药用形式可包括化合物本身，以及药学上可接受的其他变化形式，如光学异构体，顺反异构体等，或者药学上可接受的盐或溶剂合物。

优选地，所述的药学上可接受的盐包括但并不限于：无机酸盐、有机酸盐、烷基磺酸盐、芳基磺酸盐，或其组合；较佳地，所述的盐选自下组：盐酸盐、氢溴酸盐、硝酸盐、硫酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐、丙酸盐、苯甲酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、甲基磺酸盐、乙基磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐，或其组合；

优选地，所述的药学上可接受的溶剂合物包括但并不限于：所述的化合物与水、乙醇、异丙醇、乙醚、丙酮等的溶剂合物。

式I化合物的用途

本发明所述的式I化合物用于： 

(a)制备B-RAF抑制剂；

(b)用于体外非治疗性地抑制SK-MEL28细胞的活性； 

(c)用于体外非治疗性地抑制肿瘤细胞生长；

(d)用于制备治疗B-RAF V600E突变抑制活性的药物。

本发明的主要优点包括：

与现有技术相比，本发明提供的二芳基取代的吡唑并环类衍生物对B-RAF V600E突变高表达的人皮肤恶性黑色素瘤SK-MEL28细胞株具有明显的抑制作用；尤其是化合物17和18，其半数抑制浓度IC₅₀值分别为137nM和124nM，比阳性对照药物威罗菲尼(182nM)好，具有较好的开发和应用前景。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

下述实施例中所制得的化合物的结构是通过核磁共振(¹HNMR)和质谱(MS)、必要时采用NOE(Nuclear Overhauser Effect)予以确定。

¹HNMR位移(δ)以百万分之一(ppm)的单位给出。¹HNMR的测定是用BrukerAVANCE-400核磁仪，测定的溶剂为氘代二甲亚砜(DMSO-d₆)，氘代氯仿(CDCl₃)，内标为四甲基硅烷(TMS)，化学位移是以10^-6作为单位给出。

MS的测定是用FINNIGAN LCQAd(ESI)质谱仪(生产商：Therm，型号：Finnigan LCQ advantage MAX)。

IC₅₀值的测定是用NovoStar酶标仪(德国BMG公司)。

薄层硅胶是使用烟台黄海HSGF254或青岛GF254硅胶板。

硅胶柱层析是使用烟台黄海硅胶200～300目硅胶为载体。

另外，以下实施例中如无特殊说明，反应均在氮气气氛下进行。

氮气气氛是指反应瓶连接一个约1L容积的氮气气球。

以下实施例中如无特殊说明，反应中的溶液均指水溶液。

实施例1

第一步：

室温下将二(三苯基膦)二氯化钯(47mg，0.067mmol)和三苯基膦(35mg，0.134mmol)溶解于THF(10ml)中，依次加入三乙胺(15ml)和2,4-二氯嘧啶(2g，13.4mmol)，氮气保护下搅拌15分钟，然后依次加入碘化亚铜(26mg，0.134mmol)和3-乙炔基-苯胺(1.77g，14.77mmol)，外温90℃搅拌4h，TLC检测原料反完全，冷却，抽滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤，合并有机相用无水硫酸钠干燥，减压浓缩。用硅胶柱色谱法纯化得3-(2-氯-嘧啶-4-乙炔基)-苯胺(1.2g，淡黄色固体)收率：39％。¹MS m/z(ESI):230.6[M+1] 

¹HNMR(400Hz,DMSO-d₆):8.82(m,1H),7.75(m,1H),7.13(t,1H),6.79(m,2H),6.74(m,1H),5.41(s,2H). 

第二步：

室温下将3-(2-氯-嘧啶-4-乙炔基)-苯胺(1g，4.4mmol)和2,5-二氟苯磺酰氯(1g，4.84mol)加入二氯甲烷(20ml)中，然后在冰浴下滴加吡啶(0.64ml)，滴加完毕后室温搅拌60h，TLC监测原料反应完全，1N HCl溶液(30ml)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，减压浓缩。用硅胶柱色谱法纯化得到N-[3-(2-氯-嘧啶-4-乙炔基)-苯基]-2,6-二氟-苯磺酰胺(1g，白色固体)，收率：56％。¹MS m/z(ESI):406.8[M+1] 

¹HNMR(400Hz,DMSO-d₆):11.25(s,1H),8.85(m,1H),7.82-7.72(m,2H), 7.44(m,3H),7.32(m,3H).

第三步：

室温下将N-[3-(2-氯-嘧啶-4-乙炔基)-苯基]-2,6-二氟-苯磺酰胺(1.1g，2.71mmol)悬浮于80ml的均三甲苯中，加入4,5,6,7-四氢[1,2,3]恶二唑并[3,4-a]吡啶-8-鎓-3-酚盐(0.42g，3mmol)，氮气置换三次，氮气保护下升至外温175℃，搅拌24h，TLC监测原料反应完全。减压除去溶剂，粗品用硅胶柱色谱法纯化得到N-{3-[3-(2氯-嘧啶-4-基)-4,5,6,7-四氢-吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基]-苯基}-2,6-二氟-苯磺酰胺(0.33g，黄色固体)收率：24％。¹MS m/z(ESI):502.9[M+1] 

¹HNMR(400Hz,DMSO-d₆):10.97(s,1H),8.42(d,1H),7.71(m,1H),7.32-7-13(m,6H),6.82(d,1H),4.15(m,2H),3.01(m,2H),2.00(m,2H),1.83(m,2H). 

第四步：

室温下将N-{3-[3-(2氯-嘧啶-4-基)-4,5,6,7-四氢-吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基]-苯基}-2,6-二氟-苯磺酰胺(0.1g，0.2mmol)加入15ml的7mol/L的氨气/甲醇溶液中,90℃封管反应60h,TLC监测原料反应完全,冷却至室温后加入50ml二氯甲烷，减压浓缩。用硅胶柱色谱法纯化得N-{3-[3-(2-氨基-嘧啶-4-基)-4,5,6,7-四氢-吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基]-苯基}-2,6-二氟-苯磺酰胺(0.01g，白色固体)收率：10.4％。¹MS m/z(ESI):483.5[M+1] 

¹HNMR(400Hz,DMSO-d₆):10.93(s,1H),7.92(d,1H),7.71(m,1H),7.28-7.09(m,6H),6.43(s,2H),5.97(d,1H),4.11(m,2H),2.97(m,2H),2.00(m,2H),1.80(m.2H). 

实施例2

第一步：

室温下将3-(2-氯-嘧啶-4-乙炔基)-苯胺(1.5g，6.6mmol)和甲磺酰氯(0.83g，7.26mol)加入二氯甲烷(30ml)中，然后在冰浴下滴加吡啶(0.6ml)，滴加完毕后室温搅拌60h，TLC监测原料反应完全，1N HCl溶液(30ml)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，减压浓缩。用硅胶柱色谱法纯化得到N-[3-(2-氯-嘧啶-4-乙炔基)-苯基]-甲磺酰胺(1.4g，黄色固体)，收率：69％。¹MS m/z(ESI):308.7[M+1] 

¹HNMR(400Hz,DMSO-d₆):10.06(s,1H),8.86(d,1H),7.83(d,1H),7.52-7.35(m,4H),3.06(s,3H). 

第二步：

室温下将N-[3-(2-氯-嘧啶-4-乙炔基)-苯基]-甲磺酰胺(0.8g，2.6mmol)悬浮于25ml的均三甲苯中，加入4,5,6,7-四氢[1,2,3]恶二唑并[3,4-a]吡啶-8-鎓-3-酚盐(0.37g,2.6mmol)，氮气置换三次，氮气保护下升至外温175℃，搅拌24h.TLC监测原料反应完全.减压除去溶剂，粗品用硅胶柱色谱法纯化得到N-{3-[3-(2-氯-嘧啶-4-基)-4,5,6,7-四氢-吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基]-苯基}-甲磺酰胺(120mg，黄色固体)收率：11.4％。¹MS m/z(ESI):404.8[M+1] 

第三步：

室温下将N-{3-[3-(2-氯-嘧啶-4-yl)-4,5,6,7-四氢-吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基]-苯基}-甲磺酰胺(0.12g，0.3mmol)加入15ml的7mol/L的氨气/甲醇溶液中,90℃封管反应60h,TLC监测原料反应完全,冷却至室温后加入50ml二氯甲烷，减压浓缩。用硅胶柱色谱法纯化得N-{3-[3-(2-氨基-嘧啶-4-基)-4,5,6,7-四氢-吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基]-苯基}-甲磺酰胺(20mg，白色固体)收率：17.4％。¹MS m/z(ESI):385.5[M+1] 

¹HNMR(400Hz,DMSO-d₆):9.75(s,1H),8.03(d,1H),7.36(m,2H),7.21(m,2H),6.45(d,2H),6.20(d,1H),4.14(m,2H),2.98(m,5H),2.00(m,2H),1.80(m,2H). 

实施例3

第一步：

将N-[3-(2-氯-嘧啶-4-乙炔基)-苯基]-甲磺酰胺(0.8g，2.6mmol)悬浮于25ml的均三甲苯中，加入5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-C][1,2,3]恶二唑-7-鎓-3-酚盐(0.33g，6mmol)，氮气置换三次，氮气保护下升至外温175℃，搅拌24h.TLC监测原料反应完全.减压除去溶剂，粗品用硅胶柱色谱法纯化得到N-{3-[3-(2-氯-嘧啶-4-基)-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-2-基]-苯基}-甲磺酰胺(80mg，黄色固体)收率：7.9％。¹MS m/z(ESI):390.8[M+1] 

第三步：

室温下将N-{3-[3-(2-氯-嘧啶-4-基)-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-2-基]-苯基}-甲磺酰胺(80mg，0.2mmol)加入15ml的7mol/L的氨气/甲醇溶液中,90℃封管反应60h,TLC监测原料反应完全,冷却至室温后加入50ml二氯甲烷，减压浓缩。用硅胶柱色谱法纯化得N-{3-[3-(2-氨基-嘧啶-4-基)-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-2-基]-苯基}-甲磺酰胺(15mg，白色固体)收率：20.2％。¹MS m/z(ESI):371.4[M+1] 

¹HNMR(400Hz,DMSO-d₆):9.78(s,1H),8.03(d,1H),7.39-7.20(m,4H),6.39(m,2H),6.26(d,1H),4.14(m,2H),3.12(m,2H),2.96(s,3H),2.58(m,2H). 

实施例4

第一步：

室温下将3-(2-氯-嘧啶-4-乙炔基)-苯胺(1.5g，6.6mmol)和丙基磺酰氯(1g，7.26mol)加入二氯甲烷(30ml)中，然后在冰浴下滴加吡啶(0.6ml)，滴加完毕后室温搅拌60h，TLC监测原料反应完全，1N HCl溶液(10ml)洗涤， 有机相用无水硫酸钠干燥，减压浓缩。用硅胶柱色谱法纯化得到丙烷-1-磺酸[3-(2-氯嘧啶-4-乙炔基)-苯基]-胺(1.5g，黄色固体)，收率：68％。¹MS m/z(ESI):336.8[M+1] 

¹HNMR(400Hz,DMSO-d₆):10.10(s,1H),8.85(d,1H),7.83(d,1H),7.49-7.35(m,4H),3.17(m,2H),1.74(m,2H),0.97(t,3H). 

第二步：

室温下将丙烷-1-磺酸[3-(2-氯嘧啶-4-乙炔基)-苯基]-胺(0.8g，1.85mmol)悬浮于25ml的均三甲苯中，加入4,5,6,7-四氢[1,2,3]恶二唑并[3,4-a]吡啶-8-鎓-3-酚盐(0.26g，1.85mmol)，氮气置换三次，氮气保护下升至外温175℃，搅拌24h，TLC监测原料反应完全，减压除去溶剂，粗品用硅胶柱色谱法纯化得到丙烷-1-磺酸{3-[3-(2-氯-嘧啶-4-基)-4,5,6,7-四氢-吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基]-苯基}-胺(0.1g，黄色固体)收率：12.5％。¹MS m/z(ESI):432.9[M+1] 

第三步：

室温下将丙烷-1-磺酸{3-[3-(2-氯-嘧啶-4-基)-4,5,6,7-四氢-吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基]-苯基}-胺(0.1g，0.23mmol)加入15ml的7mol/L的氨气/甲醇溶液中，90℃封管反应60h，TLC监测原料反应完全,冷却至室温后加入50ml二氯甲烷，减压浓缩。用硅胶柱色谱法纯化得丙烷-1-磺酸{3-[3-(2-氨基-嘧啶-4-基)-4,5,6,7-四氢-吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基]-苯基}-酰胺(60mg，白色固体)收率：63.8％。¹MS m/z(ESI):413.5[M+1] 

¹HNMR(400Hz,DMSO-d₆):9.80(s,1H),8.02(d,1H),7.33-7.14(m,4H),6.46(s,2H),6.16(d,1H),4.13(m,2H),3.02(m,4H),2.00(m,2H),1.81(m,2H),1.68(m,2H),0.92(t,3H). 

实施例5

室温下将丙烷-1-磺酸{3-[3-(2-氯-嘧啶-4-基)-4,5,6,7-四氢-吡唑并 [1,5-a]吡啶-2-基]-苯基}-胺(0.1g，0.23mmol)，5ml异丁胺加入单口瓶中,室温搅拌过夜,TLC监测原料反应完全,加入50ml二氯甲烷，用10ml 1N盐酸溶液洗涤。用硅胶柱色谱法纯化得丙烷-1-磺酸{3-[3-(2-异丁基氨基-嘧啶-4-基)-4,5,6,7-四氢-吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基]-苯基}-酰胺(30mg，淡黄色固体)收率：28.0％。¹MS m/z(ESI):467.6[M+1] 

¹HNMR(400Hz,DMSO-d₆):9.82(s,1H),8.03(d,1H),7.32-7.12(m,5H),6.16(d,1H),4.14(m,2H),3.00(m,5H),2.00(m,2H),1.75(m,2H),1.66(m,2H),1.25(m,2H),0.89(m,9H). 

实施例6

室温下将N-{3-[3-(2氯-嘧啶-4-基)-4,5,6,7-四氢-吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基]-苯基}-2,6-二氟-苯磺酰胺(0.1g，0.2mmol)，5ml异丁胺加入单口瓶中,室温搅拌过夜,TLC监测原料反应完全,加入50ml二氯甲烷，用10ml 1N盐酸溶液洗涤。用硅胶柱色谱法纯化得2,6-二氟-N-{3-[3-(2-异丁基氨基-嘧啶-4-基)-4,5,6,7-四氢-吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基]基-苯基}-苯磺酰胺(30mg，淡黄色固体)收率：28.0％。¹MS m/z(ESI):555.6[M+1] 

¹HNMR(400Hz,DMSO-d₆):10.93(s,1H),7.95(d,1H),7.67(m,1H),7.28-7.07(m,6H),5.97(m,1H),4.15(m,2H),3.01(m,4H),2.00(m,2H),1.83(m,2H),1.25(m,1H),0.86(m,6H). 

实施例7

第一步：

室温下将N-[3-(2-氯-嘧啶-4-乙炔基)-苯基]-2,6-二氟-苯磺酰胺(1.1g， 2.71mmol)悬浮于25ml的均三甲苯中，加入5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-C][1,2,3]恶二唑-7-鎓-3-酚盐(0.34g，2.71mmol)，氮气置换三次，氮气保护下升至外温175℃，搅拌24h.TLC监测原料反应完全.减压除去溶剂，粗品用硅胶柱色谱法纯化得到N-{3-[3-(2-氯-嘧啶-4-基)-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-2-基]-苯基}-2,6-二氟-本磺酰胺(0.22g，黄色固体)收率：16.6％。¹MS m/z(ESI):488.9[M+1] 

¹HNMR(400Hz,DMSO-d₆):10.99(s,1H),8.42(d,1H),7.74(m,1H),7.32-7.18(m,6H),6.88(d,1H),4.20(m,2H),3.14(m,2H),2.61(m,2H). 

第二步：

室温下将N-{3-[3-(2-氯-嘧啶-4-基)-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-2-基]-苯基}-2,6-二氟-本磺酰胺(0.1g，0.2mmol)加入15ml的7mol/L的氨气/甲醇溶液中，90℃封管反应60h,TLC监测原料反应完全,冷却至室温后加入50ml二氯甲烷，减压浓缩。用硅胶柱色谱法纯化得N-{3-[3-(2-氨基-嘧啶-4-基)-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-2-基]-苯基}-2,6-二氟-苯磺酰胺(0.04g，淡黄色固体)收率：43.0％。¹MS m/z(ESI):467.5[M+1] 

¹HNMR(400Hz,DMSO-d₆):10.96(s,1H),7.91(d,1H),7.69(m,1H),7.32-7.13(m,6H),6.39(s,2H),6.04(d,1H),4.14(m,2H),3.09(m,2H),2.57(m,2H). 

实施例8

第一步：

室温下将丙烷-1-磺酸[3-(2-氯嘧啶-4-乙炔基)-苯基]-胺(0.8g，1.85mmol)悬浮于25ml的均三甲苯中，加入5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-C][1,2,3]恶二唑-7-鎓-3-酚盐(0.24g，1.85mmol)，氮气置换三次，氮气保护下升至外温175℃，搅拌24h。TLC监测原料反应完全，减压除去溶剂，粗品用硅胶柱色谱法纯化得到丙烷-1-磺酸-{3-[3-(2-氯-嘧啶-4-基)-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-2-基]-苯基}-胺(0.08g，黄色固体)收率：10.8％。¹MS  m/z(ESI):418.9[M+1] 

第二步：

室温下将丙烷-1-磺酸-{3-[3-(2-氯-嘧啶-4-基)-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-2-基]-苯基}-胺(0.08g，0.19mmol)加入15ml的7mol/L的氨气/甲醇溶液中,90℃封管反应60h,TLC监测原料反应完全,冷却至室温后加入50ml二氯甲烷，减压浓缩。用硅胶柱色谱法纯化得丙烷-1-磺酸{3-[3-(2-氨基-嘧啶-4-基)-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-B]吡唑-2-基]-苯基}-酰胺(0.06g，淡黄色固体)收率：79.6％。¹MS m/z(ESI):399.5[M+1] 

¹HNMR(400Hz,DMSO-d₆):9.84(s,1H),8.01(d,1H),7.37(m,2H),7.22(m,2H),6.34(s,2H),6.22(d,1H),4.15(m,2H),3.17-3.01(m,4H),2.58(m,2H),1.70(m,2H),0.94(t,3H). 

实施例9

室温下将N-{3-[3-(2-氯-嘧啶-4-基)-4,5,6,7-四氢-吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基]-苯基}-甲磺酰胺(0.1g，0.24mmol)，5ml异丁胺加入单口瓶中,室温搅拌过夜,TLC监测原料反应完全,加入50ml二氯甲烷，用10ml 1N盐酸溶液洗涤。用硅胶柱色谱法纯化得N-{3-[3-(2-异丁基氨基-嘧啶-4-基)-4,5,6,7-四氢-吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基]-苯基}-甲磺酰胺(0.04g，淡黄色固体)收率：38.1％。¹MS m/z(ESI):441.5[M+1] 

¹HNMR(400Hz,DMSO-d₆):9.75(s,1H),8.02(d,1H),7.32-7.14(m,5H),6.17(d,1H),4.12(m,2H),2.99-2.89(m,7H),2.01(m,2H),1.81(m,2H),1.22(m,1H),0.83(d,6H). 

实施例10

室温下将丙烷-1-磺酸-{3-[3-(2-氯-嘧啶-4-基)-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-2-基]-苯基}-胺(0.1g，0.24mmol)，5ml异丁胺加入单口瓶中,室温搅拌过夜,TLC监测原料反应完全,加入50ml二氯甲烷，用10ml 1N盐酸溶液洗涤。用硅胶柱色谱法纯化得丙烷-1-磺酸-{3-[3-(2-异丁胺基-嘧啶-4-基)-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-2-基]-苯基}-胺(20mg，淡黄色固体)收率：18.3％。¹MS m/z(ESI):455.6[M+1] 

¹HNMR(400Hz,DMSO-d₆):9.80(s,1H),8.03(d,1H),7.31-7.14(m,4H),6.16(d,1H),4.14(m,2H),3.02(m,5H),2.01(m,2H),1.82(m,2H),1.24(m,1H),0.92-0.83(m,9H). 

实施例11

室温下将丙烷-1-磺酸-{3-[3-(2-氯-嘧啶-4-基)-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-2-基]-苯基}-胺(0.1g，0.24mmol)，N,N-二异丙基乙胺(0.062g，0.48mmol)，3-氨基丙腈(0.05g，0.72mmol)，N-甲基吡咯烷酮(2.5ml)加入单口瓶中,再加入碳酸钠(0.051g，0.48mmol)，外温90℃搅拌过夜,TLC监测原料反应完全,加入50ml乙酸乙酯，依次用10ml饱和碳酸氢钠溶液，10ml水，10ml饱和食盐水洗涤。无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂。残余物用硅胶柱色谱法纯化得丙烷-1-磺酸(3-{3-[2-(2-氰基乙基氨基)-嘧啶-4-基]-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-2-基}-苯基)-酰胺(0.03g，淡黄色固体)收率：27.8％。¹MS m/z(ESI):452.5[M+1] 

¹HNMR(400Hz,DMSO-d₆):9.81(s,1H),8.11(d,1H),7.53-7.11(m,4H),6.28(d,1H),4.14(m,2H),3.40(m,2H),3.03(m,3H),2.55(m,2H),2.02(m, 2H),1.83(m,2H),1.66(m,2H),0.92(t,3H).

实施例12

室温下将N-{3-[3-(2氯-嘧啶-4-基)-4,5,6,7-四氢-吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基]-苯基}-2,6-二氟-苯磺酰胺(0.1g，0.2mmol)，N,N-二异丙基乙胺(0.052g，0.4mmol)，3-氨基丙腈(0.043g，0.6mmol)，N-甲基吡咯烷酮(2.5ml)加入单口瓶中,再加入碳酸钠(0.043g，0.4mmol)，外温90℃搅拌过夜,TLC监测原料反应完全,加入50ml乙酸乙酯，依次用10ml饱和碳酸氢钠溶液，10ml水，10ml饱和食盐水洗涤。无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂。残余物用硅胶柱色谱法纯化得N-(3-{3-[2-(2-氰基乙基氨基)-嘧啶-4-基]-4,5,6,7-四氢-吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基}基-苯基)-2,6-二氟-苯磺酰胺(0.03g，淡黄色固体)收率：27.8％。¹MS m/z(ESI):536.6.[M+1] 

¹HNMR(400Hz,DMSO-d₆):10.69(s,1H),8.01(d,1H),7.33-6.98(m,6H),6.67(m,1H),6.45(m,1H),6.04(m,1H),4.13(m,2H),3.53(m,2H),3.02(m,2H),2.67(m,2H),1.99(m,2H),1.82(m,2H). 

实施例13

室温下将丙烷-1-磺酸{3-[3-(2-氯-嘧啶-4-基)-4,5,6,7-四氢-吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基]-苯基}-胺(0.1g，0.23mmol)，N,N-二异丙基乙胺(0.059g，0.46mmol)，3-氨基丙腈(0.048g，0.69mmol)，N-甲基吡咯烷酮(2.5ml)加入单口瓶中,再加入碳酸钠(0.049g，0.46mmol)，外温90℃搅拌过夜,TLC监测原料反应完全,加入50ml乙酸乙酯，依次用10ml饱和碳酸氢钠溶液，10ml 水，10ml饱和食盐水洗涤。无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂。残余物用硅胶柱色谱法纯化得丙烷-1-磺酸{3-[3-(2-氰基-乙氨基-嘧啶-4-基)-4,5,6,7-四氢吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基]-苯基}-酰胺(0.03g，淡黄色固体)收率：28.0％。 ¹MS m/z(ESI):466.6.[M+1]

¹HNMR(400Hz,DMSO-d₆):9.81(s,1H),8.11(d,1H),7.35-7.13(m,4H),6.27(d,1H),4.16(m,2H),3.53(m,2H),3.02(m,4H),2.62(m,2H),2.02(m,2H),1.83(m,2H),1.64(m,2H),0.92(t,3H). 

实施例14

室温下将N-{3-[3-(2-氯-嘧啶-4-基)-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-2-基]-苯基}-2,6-二氟-本磺酰胺(0.1g，0.2mmol)，N,N-二异丙基乙胺(0.052g，0.4mmol)，3-氨基丙腈(0.043g，0.6mmol)，N-甲基吡咯烷酮(2.5ml)加入单口瓶中,再加入碳酸钠(0.043g，0.4mmol)，外温90℃搅拌过夜,TLC监测原料反应完全,加入50ml乙酸乙酯，依次用10ml饱和碳酸氢钠溶液，10ml水，10ml饱和食盐水洗涤。无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂。残余物用硅胶柱色谱法纯化得N-(3-{3-[2-(2-氰基乙基氨基)-嘧啶-4-基]-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-2-基}-苯基基)-2,6-二氟-苯磺酰胺(0.03g，淡黄色固体)收率：28.7％。¹MS m/z(ESI):522.5.[M+1] 

¹HNMR(400Hz,DMSO-d₆):10.72(s,1H),8.02(d,1H),7.26-7.14(m,6H),6.66(d,1H),6.46(m,1H),6.10(m,1H),4.17(m,2H),3.52(m,2H),3.14(m,2H),2.69-2.57(m,4H). 

实施例15

第一步

室温下将3-(2,6-二氟-苯磺酰胺)-2-氟-苯甲酸甲酯(2.95g,8.54mmol)加入甲苯(200ml)中，冰浴下滴加浓度为1.5摩尔每升的二异丙基氢化铝甲苯溶液，加完自然升至室温搅拌过夜。TLC监测原料反应完全，冰浴下滴加甲醇(10ml)，搅拌0.5h，再加入乙酸乙酯(100ml)，有机相依次用饱和酒石酸水溶液(100ml)，水(100ml)，饱和食盐水(100ml)洗涤，无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂得2,6-二氟-N-(2-氟-3-羟甲基-苯基)-苯磺酰胺(2.7g，淡黄色固体)收率：99％。¹MS m/z(ESI):318.3.[M+1] 

¹HNMR(400Hz,CDCl₃):7.59-7.46(m,2H),7.30(m,1H),7.22-6.97(m,4H),4.70(s,2H). 

第二步

室温下将2,6-二氟-N-(2-氟-3-羟甲基-苯基)-苯磺酰胺(3.1g，10.00mmol)加入二氯甲烷(30ml)中，冰浴下加入氯铬酸吡啶嗡盐(3.2g，15.00mmol)，室温搅拌过夜。TLC监测原料反应完全，抽滤，滤饼用水(500ml)溶解，二氯甲烷萃取(100ml*3)，合并有机相用无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂，残余物TLC监测原料反应完全2,6-二氟-N-(2-氟-3-甲酰基-苯基)-苯磺酰胺(2.74g，白色固体)收率86％。¹MS m/z(ESI):316.2.[M+1] 

¹HNMR(400Hz,CDCl₃):10.25(s,1H),7.92(m,1H),7.65-7.52(m,2H),7.41(s,1H),7.27(m,1H),7.03(m,2H). 

第三步

室温下将碘甲基三苯基碘化磷(6.9g，13mmol)加入新蒸四氢呋喃(90ml)中，冰浴下加入浓度为1摩尔每升的二(三甲基硅基)氨基锂的四氢呋喃溶液(13ml)，加完室温搅拌1h，溶液变澄清，降温至-60℃加入六甲基磷酰三胺(2.7ml,15mmol),加完降温至-78℃滴加2,6-二氟-N-(2-氟-3-甲酰基-苯基)-苯磺酰胺的新蒸四氢呋喃(60ml)溶液，加完-78℃下搅拌0.5h，然后自然升至室温搅拌2h。TLC监测原料反应完全，冰浴下，将体系缓慢加入饱和氯化铵溶液(300ml)中，用甲基叔丁基醚(100ml*3)萃取，合并有机相用无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂，残余物加入四氢呋喃(5ml)中，再加入浓度为1摩尔每升的四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液，85℃玻璃封管反应18h，TLC监测原料反应完全，冷却到室温，将体系加入水(100ml)中，乙酸乙酯(50ml*3)萃取，合并有机相用无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂，残余物用硅胶色谱法纯 化得N-(3-乙炔基-2-氟-苯基)-2,6-二氟-苯磺酰胺(1g，淡黄色固体)收率：37.0％。¹MS m/z(ESI):312.2.[M+1]。

¹HNMR(400Hz,CDCl₃):7.65(m,1H),7.55(m,1H),7.23(m,2H),7.08-6.98(m,3H),3.30(s,1H). 

第四步

室温下，三口瓶中依次加入4-溴吡啶-2-氨基甲酸叔丁酯(0.055g，0.2mmol)，二(三苯基膦)二氯化钯(0.003g，0.004mmol)，碘化亚铜(0.0004g，0.002mmol)，体系用氮气球(氮气：氢气体积比约为4:1)置换三次，加入三乙胺(0.1ml)。升温至内温80摄氏度，趁热滴加N-(3-乙炔基-2-氟-苯基)-2,6-二氟-苯磺酰胺(0.062g,0.2mmol)的乙腈(2.5ml)溶液,加完回流搅拌1h。TLC监测原料反应完全，冷却至室温，加水(10ml)，乙酸乙酯(5ml*3)萃取，合并有机相无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂，残余物用硅胶色谱法纯化得{4-[3-(2,6-二氟-苯磺酰胺)-2-氟-苯乙炔]-吡啶-2-基}-氨基甲酸叔丁酯(40mg，淡黄色固体)，收率：39.7％。¹MS m/z(ESI):504.5.[M+1]。

¹HNMR(400Hz,DMSO-d₆):11.04(s,1H),10.03(s,1H),8.31(d,1H),7.91(s,1H),7.75(m,1H),7.55(m,1H),7.41-7.13(m,4H),7.15(d,1H),1.49(s,9H). 

第五步

室温下将{4-[3-(2,6-二氟-苯磺酰胺)-2-氟-苯乙炔]-吡啶-2-基}-氨基甲酸叔丁酯(0.22g，0.44mmol)悬浮于25ml的均三甲苯中，加入4,5,6,7-四氢[1,2,3]恶二唑并[3,4-a]吡啶-8-鎓-3-酚盐(0.062g,0.44mmol)，氮气置换三次，氮气保护下升至外温175℃，搅拌24h.TLC监测原料反应完全.减压除去溶剂，粗品用硅胶柱色谱法纯化得到N-(3-{3-[2-氨基吡啶-4-基]-4,5,6,7-四氢吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基}-2-氟苯基)-2,6-二氟苯磺酰胺(0.014g，淡黄色固体)收率：13.2％。¹MS m/z(ESI):500.5.[M+1] 

¹HNMR(400Hz,DMSO-d₆):7.65(m,2H),7.30-7.14(m,4H),6.26(s,1H),6.02-5.94(m,2H),4.14(m,2H),2.82(m,2H),2.01(m,2H),1.81(m,2H). 

实施例16

除以上实施例公开的化合物外，还合成了具有以下测试结果的化合物，所述化合物的合成方法及步骤均参考实施例15。

¹MS m/z(ESI):573.2[M+1]；

¹MS m/z(ESI):557.63[M+1]；

¹MS m/z(ESI):557.63[M+1]；

¹MS m/z(ESI):616.63[M+1]；

¹MS m/z(ESI):593.61[M+1]。

实施例17生物学实验 

通过CCK-8检测试剂盒检测化合物对人皮肤恶性黑色素瘤细胞株SK-MEL28的增殖半数抑制浓度IC₅₀

(1)材料和方法 

细胞株:

SK-MEL28人皮肤恶性黑色素瘤细胞株(中科院细胞生物研究所)

试剂和耗材： 

Cell Counting Kit-8(Cat#CK04-13，Dojindo)

96孔培养板(Cat#3599，Corning Costar)

胎牛血清(Cat#10099-141，GIBCO)

培养基(Invitrogen)

台式酶标仪SpectraMax M5Microplate Reader(Molecular Devices) 

(2)试剂配制

培养基的配制：

细胞系 培养基 SK-MEL28 EMEM+10％FBS

化合物的制备：

用DMSO稀释化合物使终浓度为1mM。

(3)细胞培养

(i)收集对数生长期细胞，计数，用完全培养基重新悬浮细胞；

(ii)调整细胞浓度至合适浓度，接种96孔板，每孔接种100μl细胞悬液；

(iii)细胞在37℃，100％相对湿度，5％CO₂培养箱中孵育24小时。

(4)IC₅₀实验

(i)收集对数生长期细胞，计数，用完全培养基重新悬浮细胞，调整细胞浓度至合适浓度(SK-MEL28细胞，6k细胞/孔)接种96孔板，每孔加100μl细胞悬液。 细胞在37℃，100％相对湿度，5％CO₂培养箱中孵育24小时后。

(ii)用DMSO将待测化合物3倍梯度稀释8次后，按5μl每孔加入对应的95μl完全培养基中，得到20倍稀释的化合物。把上述化合物按25μl/孔加入细胞。化合物终浓度从10μM至0μM，3倍稀释，共10个浓度点。

(iii)细胞置于37℃，100％相对湿度，5％CO₂培养箱中孵育72小时。吸弃培养基，加入含10％CCK-8的完全培养基置于37℃培养箱中孵育2～4小时。轻轻震荡后在SpectraMax M5Microplate Reader上测定450nm波长处的吸光度，以650nm处吸光度作为参比，计算抑制率。

(5)数据处理

按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率：肿瘤细胞生长抑制率％＝[(Ac-As)/(Ac-Ab)]×100％

As:样品的OA(细胞+CCK-8+待测化合物)

Ac:阴性对照的OA(细胞+CCK-8+DMSO)

Ab:阳性对照的OA(培养基+CCK-8+DMSO)

(6)实验结果

本实验测试了以上候选化合物对SK-MEL28人皮肤恶性黑色素瘤细胞株的细胞毒作用。化合物终浓度从10μM至0μM，三倍梯度稀释，共10个浓度点。

IC₅₀值详见表2：

表2

化合物编号 半数抑制浓度(uM) 化合物编号 半数抑制浓度(uM) 对照物威罗菲尼 0.1826 11 0.5112 1 >10 12 1.181 2 >10 13 1.373 3 >10 14 0.2096 4 >10 15 未测 5 8.042 16 未测 6 0.7802 17 0.1376 7 5.572 18 0.1245 8 >10 19 0.4506

9 >10 20 0.6345 10 5.572 / /

由上表可见：本发明提供的二芳基取代的吡唑并环类衍生物对B-RAF V600E突变高表达的人皮肤恶性黑色素瘤SK-MEL28细胞株具有明显的抑制作用，显示出较好的开发和应用前景。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。