一种麻附甘药物双酯型生物碱的含量测定方法

摘要

本发明提供了一种麻附甘药物双酯型生物碱的含量测定方法，采用高效液相色谱法测定，其色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-四氢呋喃为流动相A，以磷酸溶液（含磷酸二氢钾）为流动相B，按时间进行程序梯度洗脱，采用样品与对照品混合法进行测定，其目标成分分离度、峰形、拖尾因子均有了显著改善，且专属性、线性、检测限、耐用性均好。

说明书

技术领域

本发明涉及药品，具体涉及一种麻附甘药物附子生物碱的含量测定方法，属药品技术领域。

技术背景

麻附甘制剂是麻黄附子甘草汤方制成制剂的简称，由附子、麻黄、甘草组成，其处方出于《伤寒论》，具有解表散寒，固本通阳的功效，主治少阴病，恶寒身疼，无汗，微发热，脉沉微者。

附子所含生物碱主要有双酯类生物碱，单酯类生物碱和胺基醇类生物碱。现代研究表明双酯型生物碱(新乌头碱、次乌头碱、乌头碱)是毒性成分，现公开的测定双酯型生物碱的含量测定方法很多，但都不适合于本麻附甘药物的测定，无法在生产和使用中有效的保证产品的安全性。

《中国药典》2010年版一部中采用的高效液相色谱法测定附子药材中双酯型生物碱，经过反复试验发现，该法测定“麻附甘药物”中双酯型生物碱含量，杂质分离效果较差，新乌头碱、次乌头碱、乌头碱拖尾较高，阴性存在明显干扰。

现有技术双酯型生物碱含量测定方法还有：

薄层色谱法：在一定的波长下用紫外或是可见光照射薄层板，在薄层板上对紫外或可见光有吸收的物质就会产生相应的斑点，对其进行扫描，扫描得到的图谱和积分值可用做药材的质量检查。该法可同时分析多个样品，展开剂用量少、选择多，样品处理简单；缺点是精密度低，限度控制灵敏度低，重复性差。

高效毛细管电泳法：该法具有分离时间短、杂质干扰少、使用有机溶剂少、操作简便等优点；分离能力较弱，对PH值要求较高，重现性差。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种麻附甘药物双酯型生物碱的含量测定方法，本发明杂质与附子中双酯型生物碱分离效果好，阴性无干扰，新乌头碱、次乌头碱、乌头碱分离度均大于1.5，线性、检测限、耐用性均良好。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

本发明所述的一种麻附甘药物双酯型生物碱的含量测定方法，其特征在于：用高效液相色谱法测定附子中双酯型生物碱含量，流动相按时间进行梯度洗脱，采用加样法进行测定。

本发明所述的一种麻附甘药物双酯型生物碱的含量测定方法，其特征在于：以乙腈：四氢呋喃（20：20至30：10）为流动相A，以含0.02%-0.3%磷酸的0.01-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液为流动相B，按时间进行梯度洗脱，0分钟至80分钟流动相B由90%至70%，检测波长为222-242nm，理论板数按乌头碱峰计算应不低于8000。

对照品溶液制备：取新乌头碱对照品、次乌头碱对照品、乌头碱对照品适量，精密称定，分别加乙腈制成每1ml含0.05-0.5mg的溶液，作为对照品贮备液，精密量取上述三种对照品贮备液各5ml，置50ml量瓶中，加0.1%磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得。

固相萃取柱系统适用性试验：精密量取对照品贮备液各3ml，混匀，室温减压回收至干，残渣精密加入0.1mol/L盐酸溶液50ml使溶解，精密量取5ml，置于处理好的固相萃取柱上，以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂，150-200mg，容量为4-10ml，预先依次用乙腈、水各6ml洗脱，依次以0.1mol/L盐酸溶液、甲醇、乙腈各5ml洗脱，弃去洗脱液，放置5分钟，继用乙腈：浓氨试液（90：10）的混合溶液10ml洗脱，收集洗脱液，于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入乙腈：0.1%磷酸溶液（30：70）的混合溶液3ml使溶解，滤过，取续滤液作为固相萃取柱系统适用性试验溶液。

分别精密吸取上述固相萃取柱系统适用性试验溶液和对照品溶液各5-30μl，注入液相色谱仪，测定，计算系统适用性试验溶液和对照品溶液各相应成分峰面积比值，不得小于0.95。

供试品溶液的制备：取检品，称取0.5-5g，置具塞锥形瓶中，加乙腈：浓氨试液（90：10）的混合溶液25ml，超声处理10-50分钟，滤过，滤液于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣加0.1mol/L盐酸溶液10ml使溶解，滤过，照固相萃取柱系统适用性试验项下的方法，自“置于处理好的固相萃取柱上”起，依法操作，得供试品溶液，量取对照品溶液与供试品溶液配制成分别含新乌头碱、次乌头碱、乌头碱2-18μg/ml的混合溶液。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与混合溶液各5-30μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本发明所述的一种麻附甘药物双酯型生物碱的含量测定方法，其特征在于：以乙腈：四氢呋喃（20：20至30：10）为流动相A，以含0.02%-0.3%磷酸的0.01-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液为流动相B，按时间进行梯度洗脱，0分钟至80分钟流动相B由90%至70%。

本发明所述的一种麻附甘药物双酯型生物碱的含量测定方法，其特征在于：所用固相萃取柱填料为混合型阳离子交换反相吸附剂，规格为100-200mg，容积为4-8ml，并预先依次用乙腈、水各6ml洗脱处理。

本发明所述的一种麻附甘药物双酯型生物碱的含量测定方法，其特征在于：检品溶液加在固相萃取柱上后，依次以0.1mol/L盐酸溶液、甲醇、乙腈各5ml洗脱，弃去洗脱液，放置5分钟，继用乙腈：浓氨试液（90：10）的混合溶液10ml洗脱，收集洗脱液。

本发明所述的一种麻附甘药物双酯型生物碱的含量测定方法，其特征在于：固相萃取柱系统适用性试验中试验溶液与对照品溶液中三种双酯型生物碱峰面积的比值不得小于0.95。

本发明所述的一种麻附甘药物双酯型生物碱的含量测定方法，其特征在于：混合溶液中对照品溶液：供试品溶液的比例为10%：90%至90%：10%。

本发明提供了根据特定的处方制备的麻附甘药物中双酯型生物碱的含量测定方法；本发明与现有技术的区别在于采用了不同的梯度洗脱程序，排除了阴性对双酯型生物碱测定的干扰，其目标成分分离度、峰形、拖尾因子均有了显著改善，且专属性、线性、耐用性均好。

为了更好的理解本发明，以下通过本发明含量测定方法的方法学研究进一步说明本发明的有益效果。方法学旨在进一步说明本发明的作用，而非本发明的限制。

一、制备样品

1、制备麻附甘胶囊剂

取附子20kg，麻黄13.34kg，甘草13.34g，加水煎煮二次，第一次加水8倍量，煎煮3小时，第二次加水6倍量，煎煮2小时，滤过，滤液合并，浓缩成稠膏状，在80℃以下减压干燥，粉碎，与适量辅料混匀，装入胶囊，得麻附甘药物的胶囊剂。

2、制备不含附子的阴性胶囊剂

取麻黄200g，甘草200g，照制备麻附甘胶囊剂的方法制成不含附子的阴性胶囊剂。

二、药典法和本发明法含量测定适用性比较

《中国药典》2010年版第二增补本附桂骨痛胶囊项下附子双酯型生物碱含量测定法（以下简称“药典法”）与本发明附子双酯型生物碱含量测定法，用于麻附甘胶囊剂附子双酯型生物碱含量测定的比较。

1.“药典法”测定麻附甘胶囊剂双酯型生物碱含量适用性试验

色谱条件  以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈：四氢呋喃(25：15)为流动相A，以含0.1%磷酸的0.03mol/L磷酸二氢钾溶液为流动相B；按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为232nm。

表1   “药典法”梯度洗脱表 

时间(min)流动相A(%)流动相B(%)0~3815→2685→7438~3926→3574→6539~49356549~5035→1565→85

对照品溶液制备  取新乌头碱对照品、次乌头碱对照品、乌头碱对照品适量，精密称定，分别加乙腈制成每1ml含0.2mg的溶液，作为对照品贮备液。精密量取上述三种对照品贮备液各5ml，置50ml量瓶中，加0.1%磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得。

供试品溶液的制备  取本品内容物，混匀，精密称取1.0009g，置具塞锥形瓶中，加乙腈：浓氨试液(90：10)的混合溶液25ml，超声处理30分钟，滤过，滤液于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣加0.1mol/L盐酸溶液10ml使溶解，滤过，置于处理好的固相萃取柱(以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂，150mg，容量为6ml，预先依次用乙腈、水各6ml洗脱)上，依次以0.1mol/L盐酸溶液、甲醇、乙腈各5ml洗脱，弃去洗脱液，放置5分钟，继用乙腈：浓氨试液(90：10)的混合溶液10ml洗脱，收集洗脱液，于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入乙腈：0.1%磷酸溶液(30：70)的混合溶液3ml使溶解，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

阴性溶液的制备  取阴性制剂同供试品溶液制备法配制阴性溶液。

分别精密吸取上述溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

试验结果显示，阴性溶液在与对照品溶液第一、三色谱峰相应位置附近均有色谱峰，表明阴性对本法测定双酯型生物碱存在干扰。因此“药典法”中采用方法不适用于麻附甘药物双酯型生物碱的含量测定。

2. 本发明方法测定麻附甘胶囊剂双酯型生物碱含量适用性试验

色谱条件  以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈：四氢呋喃(25：15)为流动相A，以含0.1%磷酸的0.03mol/L磷酸二氢钾溶液为流动相B；按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为232nm。

表2   梯度洗脱表 

时间(min)流动相A(%)流动相B(%)0~7515→2085→8075~7720→3580→6577~87356587~8935→1565→85

对照品溶液制备  取新乌头碱对照品、次乌头碱对照品、乌头碱对照品适量，精密称定，分别加乙腈制成每1ml含0.2mg的溶液，作为对照品贮备液。精密量取上述三种对照品贮备液各5ml，置50ml量瓶中，加0.1%磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得。

固相萃取柱系统适用性试验  精密量取对照品贮备液各3ml，混匀，室温减压回收至干，残渣精密加入0.1mol/L盐酸溶液50ml使溶解，精密量取5ml，置于处理好的固相萃取柱（以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂，150mg，容量为6ml，预先依次用乙腈、水各6ml洗脱）上，依次以0.1mol/L盐酸溶液、甲醇、乙腈各5ml洗脱，弃去洗脱液，放置5分钟，继用乙腈：浓氨试液（90：10）的混合溶液10ml洗脱，收集洗脱液，于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入乙腈：0.1%磷酸溶液（30：70）的混合溶液3ml使溶解，滤过，取续滤液作为固相萃取柱系统适用性试验溶液。

分别精密吸取上述固相萃取柱系统适用性试验溶液和对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，计算系统适用性试验溶液和对照品溶液各相应成分峰面积比值，不得小于0.95。

供试品溶液的制备  取本品内容物，混匀，精密称取1.0004g，置具塞锥形瓶中，加乙腈：浓氨试液（90：10）的混合溶液25ml，超声处理30分钟（功率200W，频率40kHz），滤过，滤液于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣加0.1mol/L盐酸溶液10ml使溶解，滤过，照固相萃取柱系统适用性试验项下的方法，自“置于处理好的固相萃取柱上”起，依法操作，得供试品溶液。精密量取对照品溶液、供试品溶液各1ml，混匀，得混合溶液。

阴性溶液的制备  取阴性制剂同供试品溶液制备方法制备。

测定法  分别精密吸取对照品溶液与混合溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

表3   系统适用性试验结果（n=5） 

项目理论板数分离度拖尾因子重复性新乌头碱>21000——0.97～0.990.24%次乌头碱>2500060.95～0.980.63%乌头碱>2700030.99-1.030.74%双酯型生物碱——————0.45%

结果表明本法测定双酯型生物碱系统适用性良好。

表4   固相萃取柱系统适用性试验结果 

项目过柱前面积过柱后面积比值新乌头碱312362.6 310633.50.994次乌头碱328493.0 327140.750.996乌头碱301359.0 300054.250.996

固相萃取柱系统适用性试验结果显示本法测定所用固相萃取柱对三种双酯型生物碱吸附、解吸附率均在95%以上，表明所选用固相萃取柱适用于本法中双酯型生物碱的测定。

专属性试验结果显示供试品溶液在与次乌头碱色谱峰相应位置处有色谱峰，阴性溶液在与新乌头碱、次乌头碱、乌头碱色谱峰相应位置均无色谱峰，表明本法测定阴性无干扰，专属性强。

本品中双酯含量较低（0.0012%），且中药中各种成分较多很难彻底排除各类微量成分对结果的干扰，在测定中稍有色谱峰即可对测定产生影响，致使图谱无法达到高效液相色谱法试验要求，故在供试品溶液中加入定量双酯型生物碱对照品，利于方法学研究试验中各项指标的控制，亦可得到较为准确的结果。

试验结果显示采用供试品与对照品混合法测得双酯型生物碱与直接测得结果相近，三种双酯型生物碱与相邻其他峰均可有效分离，表明可采用本法对本品中双酯型生物碱进行测定。

与“药典法”比较，色谱峰峰形明显改善，拖尾因子更小，各组分可有效分离，表明本方法适用于麻附甘药物双酯型生物碱的含量测定。

三、本发明双酯型生物碱含量测定方法学验证过程

1. 线性试验

取每1ml分别含新乌头碱、次乌头碱、乌头碱各20μg的混合对照品溶液，作为对照品线性贮备液。分别制备不同浓度线性溶液。分别精密各吸取线性溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

表5   新乌头碱线性试验结果 

新乌头碱(μg/ml)0.9877 1.9754 3.9508 9.8769 19.7538 峰面积146372998262607160145325364

以新乌头碱对照品的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为：y=165787x-2616.6，r=1.0000。结果表明本法测定新乌头碱进样量在0.01～0.2μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。

表6   次乌头碱线性试验结果 

次乌头碱(μg/ml)1.1058 2.2116 4.4231 11.0578 22.1157 峰面积151913087365154168223343857

以次乌头碱对照品的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为：y=15674x-3598.6，r=0.9999。结果表明本法测定次乌头碱进样量在0.01～0.2μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。

表7   乌头碱线性试验结果 

乌头碱(μg/ml)1.0621 2.1242 4.2484 10.6210 21.2420 峰面积135532760259771153193316987

以乌头碱对照品的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为：y=15057x-4122.7，r=0.9999。结果表明本法测定乌头碱进样量在0.01～0.2μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2. 检测限试验

取双酯型生物碱对照品溶液稀释进样，测得S/N为2.5：1，双酯型生物碱检测限分别为：新乌头碱0.49ng、次乌头碱0.55ng、乌头碱0.53ng。

3. 溶液稳定性试验

取供试品溶液室温放置，分别于第0、10、20小时吸取10μl，注入液相色谱仪，测定，结果见下表。

表8   溶液稳定性试验结果 

项目0h10h20h平均RSD新乌头碱158827156839157442157702.7 0.65%次乌头碱198547198123197536198068.7 0.26%乌头碱155464155013154693155056.7 0.25%双酯型生物碱5128385099855096915108280.34%

结果显示供试品溶液在室温放置20小时内稳定性良好。

4. 色谱柱耐用性试验

采用不同厂牌的色谱柱进行测定，结果见下表。

表9   不同色谱柱耐用性试验

结果表明本法测定双酯型生物碱含量对不同厂牌色谱柱耐用性良好。

具体实施方式

实施例1：麻附甘颗粒剂双酯型生物碱含量测定

1）制备颗粒剂：

取附子6kg，麻黄2kg，甘草2kg，加水煎煮两次，第一次加8倍量水，煎煮2小时，第二次加6倍量水，煎煮1小时，合并两次煎液，滤过，浓缩至稠膏状，在80℃以下减压干燥，粉碎，与适量糊精混匀，制成颗粒，干燥，整粒，得麻附甘药物的颗粒剂。

2）含量测定：

色谱条件与系统适用性试验  以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈：四氢呋喃（20：20）为流动相A，以含0.02%磷酸的0.01mol/L磷酸二氢钾溶液为流动相B；按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为222nm；理论板数按乌头碱峰计算为26695。

表10   实施例1梯度洗脱 

时间（min）流动相A（%）流动相B（%）0~7510→2590→7575~7725→3575→6577~873565

对照品溶液制备：取新乌头碱对照品、次乌头碱对照品、乌头碱对照品适量，精密称定，分别加乙腈制成每1ml含0.05mg的溶液，作为对照品贮备液，精密量取上述三种对照品贮备液各5ml，置50ml量瓶中，加0.1%磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得。

固相萃取柱系统适用性试验：精密量取对照品贮备液各3ml，混匀，室温减压回收至干，残渣精密加入0.1mol/L盐酸溶液50ml使溶解，精密量取5ml，置于处理好的固相萃取柱（以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂，150mg，容量为4ml，预先依次用乙腈、水各6ml洗脱）上，依次以0.1mol/L盐酸溶液、甲醇、乙腈各5ml洗脱，弃去洗脱液，放置5分钟，继用乙腈：浓氨试液（90：10）的混合溶液10ml洗脱，收集洗脱液，于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入乙腈：0.1%磷酸溶液（30：70）的混合溶液3ml使溶解，滤过，取续滤液作为固相萃取柱系统适用性试验溶液；

分别精密吸取上述固相萃取柱系统适用性试验溶液和对照品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，计算，系统适用性试验溶液和对照品溶液各相应成分峰面积比值大于0.95。

供试品溶液的制备：取检品，称取5g，置具塞锥形瓶中，加乙腈：浓氨试液（90：10）的混合溶液25ml，超声处理50分钟，滤过，滤液于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣加0.1mol/L盐酸溶液10ml使溶解，滤过，照固相萃取柱系统适用性试验项下的方法，自“置于处理好的固相萃取柱上”起，依法操作，得供试品溶液，量取对照品溶液0.1ml与供试品溶液0.9ml，混匀，得混合溶液。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与混合溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

结果：3个双酯型生物碱理论塔板数、分离度、拖尾因子均达到要求，该批麻附甘颗粒剂双酯型生物碱含量为5.9μg/袋。

实施例2：麻附甘颗粒剂双酯型生物碱含量测定

1）制备颗粒剂：

取附子12kg，麻黄10kg，甘草10kg，加水煎煮两次，第一次加10倍量水，煎煮2.5小时，第二次加8倍量水，煎煮1.5小时，合并两次煎液，滤过，浓缩至稠膏状，在80℃以下减压干燥，粉碎，与适量糊精混匀，制成颗粒，干燥，整粒，得麻附甘药物的颗粒剂。

2）含量测定：

色谱条件与系统适用性试验  以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈：四氢呋喃（30：10）为流动相A，以含0.3%磷酸的0.05mol/L磷酸二氢钾溶液为流动相B；按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为242nm；理论板数按乌头碱峰计算为25013。

表11   实施例2梯度洗脱 

时间（min）流动相A（%）流动相B（%）0~8015→2585→7580~8525→3575→6585~953565

对照品溶液制备：取新乌头碱对照品、次乌头碱对照品、乌头碱对照品适量，精密称定，分别加乙腈制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品贮备液，精密量取上述三种对照品贮备液各5ml，置50ml量瓶中，加0.1%磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得。

固相萃取柱系统适用性试验：精密量取对照品贮备液各3ml，混匀，室温减压回收至干，残渣精密加入0.1mol/L盐酸溶液50ml使溶解，精密量取5ml，置于处理好的固相萃取柱（以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂，150mg，容量为5ml，预先依次用乙腈、水各6ml洗脱）上，依次以0.1mol/L盐酸溶液、甲醇、乙腈各5ml洗脱，弃去洗脱液，放置5分钟，继用乙腈：浓氨试液（90：10）的混合溶液10ml洗脱，收集洗脱液，于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入乙腈：0.1%磷酸溶液（30：70）的混合溶液3ml使溶解，滤过，取续滤液作为固相萃取柱系统适用性试验溶液；

分别精密吸取上述固相萃取柱系统适用性试验溶液和对照品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，计算，系统适用性试验溶液和对照品溶液各相应成分峰面积比值大于0.95。

供试品溶液的制备：取检品，称取1g，置具塞锥形瓶中，加乙腈：浓氨试液（90：10）的混合溶液25ml，超声处理50分钟，滤过，滤液于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣加0.1mol/L盐酸溶液10ml使溶解，滤过，照固相萃取柱系统适用性试验项下的方法，自“置于处理好的固相萃取柱上”起，依法操作，得供试品溶液，量取对照品溶液0.9ml与供试品溶液0.1ml，混匀，得混合溶液。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与混合溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

结果：3个双酯型生物碱理论塔板数、分离度、拖尾因子均达到要求，该批麻附甘颗粒剂双酯型生物碱含量为5.1μg/袋。

实施例3：麻附甘胶囊剂双酯型生物碱含量测定

1）制备胶囊剂：

取附子10kg，麻黄6.67kg，甘草6.67kg，加水煎煮二次，第一次加8倍量，煎煮3小时，第二次加6倍量，煎煮2小时，煎液滤过，滤液合并，浓缩至稠膏状，在80℃以下减压干燥，粉碎，与适量淀粉混匀，装入胶囊，得麻附甘药物的胶囊剂。

2）含量测定：

色谱条件与系统适用性试验  以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈：四氢呋喃（26：14）为流动相A，以含0.1%磷酸的0.04mol/L磷酸二氢钾溶液为流动相B；按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为230nm；理论板数按乌头碱峰计算为26487。

表12   实施例3梯度洗脱 

时间（min）流动相A（%）流动相B（%）0~7915→2185→7979~8521→3579→6585~953565

对照品溶液制备：取新乌头碱对照品、次乌头碱对照品、乌头碱对照品适量，精密称定，分别加乙腈制成每1ml含0.3mg的溶液，作为对照品贮备液，精密量取上述三种对照品贮备液各5ml，置50ml量瓶中，加0.1%磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得。

固相萃取柱系统适用性试验：精密量取对照品贮备液各3ml，混匀，室温减压回收至干，残渣精密加入0.1mol/L盐酸溶液50ml使溶解，精密量取5ml，置于处理好的固相萃取柱（以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂，200mg，容量为10ml，预先依次用乙腈、水各6ml洗脱）上，依次以0.1mol/L盐酸溶液、甲醇、乙腈各5ml洗脱，弃去洗脱液，放置5分钟，继用乙腈：浓氨试液（90：10）的混合溶液10ml洗脱，收集洗脱液，于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入乙腈：0.1%磷酸溶液（30：70）的混合溶液3ml使溶解，滤过，取续滤液作为固相萃取柱系统适用性试验溶液；

分别精密吸取上述固相萃取柱系统适用性试验溶液和对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，计算，系统适用性试验溶液和对照品溶液各相应成分峰面积比值大于0.95。

供试品溶液的制备：取检品，称取1.5g，置具塞锥形瓶中，加乙腈：浓氨试液（90：10）的混合溶液25ml，超声处理40分钟，滤过，滤液于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣加0.1mol/L盐酸溶液10ml使溶解，滤过，照固相萃取柱系统适用性试验项下的方法，自“置于处理好的固相萃取柱上”起，依法操作，得供试品溶液，量取对照品溶液0.9ml与供试品溶液0.1ml，混匀，得混合溶液。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与混合溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

结果：3个双酯型生物碱理论塔板数、分离度、拖尾因子均达到要求，该批麻附甘胶囊剂双酯型生物碱含量为0.2μg/粒。

实施例4：麻附甘片剂双酯型生物碱含量测定

1）制备片剂：

取附子10kg，麻黄5kg，甘草5kg，加水煎煮三次，第一次加8倍量，煎煮2小时，第二、三次分别加6倍量，分别煎煮1小时，煎液滤过，滤液合并，浓缩至稠膏状，在80℃以下减压干燥，粉碎，与适量淀粉混匀，70%乙醇作润湿剂制粒，加适量硬脂酸镁，混匀，压片，得麻附甘药物的片剂。

2）含量测定：

色谱条件与系统适用性试验  以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈：四氢呋喃（23：17）为流动相A，以含0.08%磷酸的0.02mol/L磷酸二氢钾溶液为流动相B；按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为235nm；理论板数按乌头碱峰计算为9086。

表13   实施例4梯度洗脱 

时间（min）流动相A（%）流动相B（%）0~7515→2285→7875~7722→3578→6577~873565

对照品溶液制备：取新乌头碱对照品、次乌头碱对照品、乌头碱对照品适量，精密称定，分别加乙腈制成每1ml含0.15mg的溶液，作为对照品贮备液，精密量取上述三种对照品贮备液各5ml，置50ml量瓶中，加0.1%磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得。

固相萃取柱系统适用性试验：精密量取对照品贮备液各3ml，混匀，室温减压回收至干，残渣精密加入0.1mol/L盐酸溶液50ml使溶解，精密量取5ml，置于处理好的固相萃取柱（以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂，150mg，容量为6ml，预先依次用乙腈、水各6ml洗脱）上，依次以0.1mol/L盐酸溶液、甲醇、乙腈各5ml洗脱，弃去洗脱液，放置5分钟，继用乙腈：浓氨试液（90：10）的混合溶液10ml洗脱，收集洗脱液，于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入乙腈：0.1%磷酸溶液（30：70）的混合溶液3ml使溶解，滤过，取续滤液作为固相萃取柱系统适用性试验溶液；

分别精密吸取上述固相萃取柱系统适用性试验溶液和对照品溶液各15μl，注入液相色谱仪，测定，计算，系统适用性试验溶液和对照品溶液各相应成分峰面积比值大于0.95。

供试品溶液的制备：取检品，称取2g，置具塞锥形瓶中，加乙腈：浓氨试液（90：10）的混合溶液25ml，超声处理30分钟，滤过，滤液于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣加0.1mol/L盐酸溶液10ml使溶解，滤过，照固相萃取柱系统适用性试验项下的方法，自“置于处理好的固相萃取柱上”起，依法操作，得供试品溶液，量取对照品溶液0.4ml与供试品溶液0.6ml，混匀，得混合溶液。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与混合溶液各15μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

结果：3个双酯型生物碱理论塔板数、分离度、拖尾因子均达到要求，该批麻附甘片剂双酯型生物碱含量为3.5μg/片。

实施例5：麻附甘口服液剂双酯型生物碱含量测定

1）制备口服液剂：

取附子9kg，麻黄7kg，甘草7kg，加水煎煮两次，第一次加8倍量水，煎煮2小时，第二次加6倍量水，煎煮1小时，煎液滤过，滤液合并，浓缩至稠膏状，放冷，加入乙醇至含醇量达70%，静置24小时，滤过，滤液回收乙醇，浓缩至适量，加入糖粉及抑菌剂适量，静置，滤过，灌封，灭菌，得麻附甘药物的口服液剂。

2）含量测定：

色谱条件与系统适用性试验  以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈：四氢呋喃（22：18）为流动相A，以含0.12%磷酸的0.03mol/L磷酸二氢钾溶液为流动相B；按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为232nm；理论板数按乌头碱峰计算为21077。

表14   实施例5梯度洗脱 

时间（min）流动相A（%）流动相B（%）0~7514→2086→8075~7720→3580→6577~873565

对照品溶液制备：取新乌头碱对照品、次乌头碱对照品、乌头碱对照品适量，精密称定，分别加乙腈制成每1ml含0.2mg的溶液，作为对照品贮备液，精密量取上述三种对照品贮备液各5ml，置50ml量瓶中，加0.1%磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得。

固相萃取柱系统适用性试验：精密量取对照品贮备液各3ml，混匀，室温减压回收至干，残渣精密加入0.1mol/L盐酸溶液50ml使溶解，精密量取5ml，置于处理好的固相萃取柱（以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂，150mg，容量为6ml，预先依次用乙腈、水各6ml洗脱）上，依次以0.1mol/L盐酸溶液、甲醇、乙腈各5ml洗脱，弃去洗脱液，放置5分钟，继用乙腈：浓氨试液（90：10）的混合溶液10ml洗脱，收集洗脱液，于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入乙腈：0.1%磷酸溶液（30：70）的混合溶液3ml使溶解，滤过，取续滤液作为固相萃取柱系统适用性试验溶液；

分别精密吸取上述固相萃取柱系统适用性试验溶液和对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，计算，系统适用性试验溶液和对照品溶液各相应成分峰面积比值大于0.95。

供试品溶液的制备：取检品，称取2g，置具塞锥形瓶中，加乙腈：浓氨试液（90：10）的混合溶液25ml，超声处理10分钟，滤过，滤液于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣加0.1mol/L盐酸溶液10ml使溶解，滤过，照固相萃取柱系统适用性试验项下的方法，自“置于处理好的固相萃取柱上”起，依法操作，得供试品溶液，量取对照品溶液0.3ml与供试品溶液0.7ml，混匀，得混合溶液。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与混合溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

结果：3个双酯型生物碱理论塔板数、分离度、拖尾因子均达到要求，该批麻附甘口服液剂双酯型生物碱含量为0.8μg/ml。

实施例6：麻附甘丸剂双酯型生物碱含量测定

1）制备丸剂：

取附子8kg，麻黄5kg，甘草5kg，加水煎煮两次，第一次加8倍量水，煎煮2小时，第二次加8倍量水，煎煮2小时，煎液滤过，滤液合并，浓缩至稠膏状，加入淀粉适量，制丸，干燥，打光，得麻附甘药物的丸剂。

2）含量测定：

色谱条件与系统适用性试验  以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈：四氢呋喃（22：18）为流动相A，以含0.12%磷酸的0.03mol/L磷酸二氢钾溶液为流动相B；按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为232nm；理论板数按乌头碱峰计算为11090。

表16   实施例6梯度洗脱 

时间（min）流动相A（%）流动相B（%）0~8013→2087→8080~8520→3580→6585~903565

对照品溶液制备：取新乌头碱对照品、次乌头碱对照品、乌头碱对照品适量，精密称定，分别加乙腈制成每1ml含0.2mg的溶液，作为对照品贮备液，精密量取上述三种对照品贮备液各5ml，置50ml量瓶中，加0.1%磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得。

固相萃取柱系统适用性试验：精密量取对照品贮备液各3ml，混匀，室温减压回收至干，残渣精密加入0.1mol/L盐酸溶液50ml使溶解，精密量取5ml，置于处理好的固相萃取柱（以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂，150mg，容量为6ml，预先依次用乙腈、水各6ml洗脱）上，依次以0.1mol/L盐酸溶液、甲醇、乙腈各5ml洗脱，弃去洗脱液，放置5分钟，继用乙腈：浓氨试液（90：10）的混合溶液10ml洗脱，收集洗脱液，于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入乙腈：0.1%磷酸溶液（30：70）的混合溶液3ml使溶解，滤过，取续滤液作为固相萃取柱系统适用性试验溶液；

分别精密吸取上述固相萃取柱系统适用性试验溶液和对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，计算，系统适用性试验溶液和对照品溶液各相应成分峰面积比值大于0.95。

供试品溶液的制备：取检品，称取2g，置具塞锥形瓶中，加乙腈：浓氨试液（90：10）的混合溶液25ml，超声处理40分钟，滤过，滤液于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣加0.1mol/L盐酸溶液10ml使溶解，滤过，照固相萃取柱系统适用性试验项下的方法，自“置于处理好的固相萃取柱上”起，依法操作，得供试品溶液，量取对照品溶液0.7ml与供试品溶液0.3ml，混匀，得混合溶液。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与混合溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

结果：3个双酯型生物碱理论塔板数、分离度、拖尾因子均达到要求，该批麻附甘丸剂双酯型生物碱含量为0.4μg/丸。