诱导脂肪干细胞分化为成纤维细胞的方法

摘要

本发明涉及干细胞诱导领域，尤其涉及诱导脂肪干细胞分化为成纤维细胞的方法。该方法为：将脂肪干细胞于磷酸维生素C和bFGF存在条件下诱导培养，得到成纤维细胞。经试验证明，采用本发明提供的方法，培养7～10天后细胞仍呈梭形或漩涡形状，虽然形状上与脂肪干细胞十分相似，但是对I型胶原的表达情况检测结果表明，培养后的细胞中I型胶原的表达量升高了124倍，显著优于对照组。说明，采用本发明提供的方法成功将脂肪干细胞诱导分化称为成纤维细胞，且分化速度优于对照组。继续扩增培养、传代过程中，细胞进一步的分化、扩增，从而能够获得更大量的成纤维细胞。

说明书

技术领域

本发明涉及干细胞诱导领域，尤其涉及诱导脂肪干细胞分化为成纤维细胞的方法。

背景技术

干细胞治疗被认为是临床上一种组织损伤修复的安全、有效的治疗方法。现有技术中，以骨髓或脐血充间质干细胞作为创面修复材料的技术已有报道。但是，骨髓充间质干细胞(BMSCs)存在病毒污染的隐患，且随着供者年龄增长，其细胞数量和扩增、分化能力出现明显下降趋势，不适合批量制备。而来源于脐血或胎盘的充间质干细胞虽然可以克服上述缺陷，却仅能在出生时保存，并非所有患者都能提供。从人体脂肪组织中分离出来的脂肪间充质干细胞(ADSCs)可通过分泌多种生长因子，控制和调节临近的受损细胞，发挥重要功能，而且ADSCs容易从吸脂的脂肪中获得，对患者创伤小，干细胞分离效率高，具有多能分化的能力，因此ADSCs近年来已经成为种子细胞的研究热点。

但是，将ADSCs用于制备创面修复材料首先面临的问题就是分化。2008年有报道称，利用脂肪干细胞于人脱细胞真皮基质复合，移植到裸鼠皮肤缺损处，发现植入的细胞向血管内皮细胞、成纤维细胞、上皮细胞分化，并能有效促进创面愈合。而皮肤作为人体面积最大的器官，发生大面积缺损或难愈合是现如今困扰临床工作着的一大难题，ADSCs无疑成为种子细胞和支架材料的理想选择。现有技术中对ADSCs成纤维细胞分化研究较少，仅有的研究结果显示，ADSCs分化为成纤维细胞所需的时间较为漫长。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种快速诱导脂肪干细胞分化为成纤维细胞的方法。

本发明提供的诱导脂肪干细胞分化为成纤维细胞的方法为：将脂肪干细胞于磷酸维生素C和bFGF存在条件下诱导培养，得到成纤维细胞。

磷酸维生素C，又名维生素C磷酸酯，能够促进胶原蛋白生成。

bFGF为成纤维细胞生长因子，具有促进有丝分裂的作用，能够促进创伤组织愈合与组织修复，促进组织再生。

本发明采用磷酸维生素C和bFGF作为诱导剂，诱导脂肪干细胞分化成为成纤维细胞。实验表明，经过7～10天的诱导脂肪干细胞向成纤维细胞分化，且与其他对照组相比分化速度更快。

在一些实施例中，诱导培养的培养基为含有5wt％FBS的DMEM/F12培养基。

在一些实施例中，bFGF的浓度为5～15μg/mL；磷酸维生素C的浓度为0.5～1.5mmol/L。

在一些实施例中，bFGF的浓度为10μg/mL；磷酸维生素C的浓度为1mmol/L。

本发明通过实验表明，生长因子的种类、浓度对脂肪干细胞成纤维细胞分化速度的影响十分显著，改变生长因子的种类或浓度会导致分化速度的下降。

在一些实施例中，诱导培养的培养基中还包括地塞米松。

在一些实施例中，地塞米松的浓度为0.01～0.2μmol/L。

在一些实施例中，地塞米松的浓度为0.1μmol/L。

地塞米松作为抗炎剂使用。

在一些实施例中，脂肪干细胞在诱导培养前，经胰蛋白酶消化、融合。

具体的，脂肪干细胞的胰蛋白酶消化、融合为：取第三代～第五代的脂肪干细胞，加入质量分数为0.25％胰蛋白酶和质量分数为0.02％EDTA进行消化，以血清终止消化后1200r/min离心5min，以DMEM/F12培养基重悬细胞，调整密度为1×10⁴/mL，培养至40％～50％融合。

在一些实施例中，诱导培养过程中每2天更换诱导培养基。

在一些实施例中，诱导培养的时间为7d～10d，温度为37℃，CO₂体积分数5％，饱和湿度95％。

在一些实施例中，第三代～第五代的脂肪干细胞的制备方法包括：将脂肪组织经PBS缓冲液冲洗，以胶原酶消化后，经离心取细胞沉淀后以脂肪干细胞完全培养基培养至80％融合，以胰蛋白酶消化后传代培养至第三代～第五 代。

在一些实施例中，诱导培养后，还包括扩增培养、传代的步骤。

在一些实施例中，扩增培养、传代的培养基为成纤维细胞无血清培养基SFM。

在一些实施例中，扩增培养、传代过程中，每2天更换培养基。

在一些实施例中，扩增培养、传代的条件为温度为37℃，CO₂体积分数5％，饱和湿度95％。

本发明提供的诱导脂肪干细胞分化为成纤维细胞的方法为：将脂肪干细胞于磷酸维生素C和bFGF存在条件下诱导培养，得到成纤维细胞。经试验证明，采用本发明提供的方法，培养7～10天后细胞仍呈梭形或漩涡形状，虽然形状上与脂肪干细胞十分相似，但是对I型胶原的表达情况检测结果表明，培养后的细胞中I型胶原的表达量升高了124倍，显著优于对照组。说明，采用本发明提供的方法成功将脂肪干细胞诱导分化称为成纤维细胞，且分化速度优于对照组。继续扩增培养、传代过程中，细胞进一步的分化、扩增，从而能够获得更大量的成纤维细胞。

附图说明

图1示原代培养脂肪干细胞的倒置显微镜(100×)观察结果，其中，图1-a示原代培养48h后观察结果；图1-b示原代培养5天后观察结果；

图2示流式细胞仪检测扩增培养至第三代的脂肪干细胞表面抗原表达情况；

图3示脂肪干细胞成纤维细胞诱导培养后以倒置显微镜放大40倍观察细胞形态结果；其中图3-a示诱导培养前脂肪干细胞形态，图3-b示实验组细胞诱导培养后形态；图3-c示对照组1细胞诱导培养后形态；图3-d示对照组2细胞诱导培养后形态；图3-e示对照组3细胞诱导培养后形态；

图4示免疫荧光染色检测诱导分化后细胞I型胶原的表达情况；其中，图4-a示实验组细胞I型胶原表达情况；图4-b示对照组1细胞I型胶原表达情况；图4-c示对照组2细胞I型胶原表达情况；图4-d示对照组3细胞I型胶原表达情况。

具体实施方式

本发明提供了诱导脂肪干细胞分化为成纤维细胞的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。

其中，脂肪干细胞完全培养基购自广州仪涛科学仪器有限公司

成纤维细胞无血清培养基购自广州仪涛科学仪器有限公司

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1人脂肪干细胞(ADSCs)的分离与培养 

通过脂肪抽吸术获取的人体腹部皮下脂肪组织抽提液(术前己排除内分泌疾病及传染病)800g离心，用PBS缓冲液冲洗，浸泡，再800gx4min洗涤3次。

剔除肉眼可见的血管及结蹄组织，用眼科剪将其充分剪碎后放入50ml离心管，加入2倍体积0.5％胶原酶、1倍体积1％BSA和双抗，混匀，封口，放入摇床中37℃消化50min，至糊状为止。

加入等体积的含体积分数为10％胎牛血清的低糖DMEM终止消化，1800r/min离心10min，离心后分为3层，上层为油脂及未消化完全的脂肪组织，中层为上清液，下层为脂肪干细胞和红细胞等混合细胞的沉淀。

弃上层和中层，下层加入完全培养基重悬细胞沉淀，70um细胞筛网过滤，

将滤过后的滤液调整细胞浓度为5x10⁵单核细胞/mL接种于T-25cm²培养瓶中，37℃、5％CO₂、饱和湿度培养。

48h后换液，加入脂肪干细胞完全培养基继续培养。

细胞培养至80％融合时，采用0.25％胰蛋白酶/0.02％EDTA消化传代至第三代～第五代。

期间用倒置显微镜观察，观察结果如图1所示，结果显示：原代细胞培养24h后，可见少量细胞贴壁；48h后(图1-a)，倒置显微镜下见圆形、短梭 形、不规则形细胞；换液后，细胞迅速生长，梭形细胞明显增多，部分细胞可见多个突起，4-5天(图1-b)开始单层融合，呈成纤维样细胞，生长迅速，3天传代一次，随着代数增多，细胞形态逐渐均一。

实施例2人脂肪干细胞(ADSCs)表面标记的鉴定

取对数生长期第3代的细胞，吸出培养基后，加入0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA的消化液进行消化，之后用适量血清终止消化，轻轻吹打成单细胞悬液。

1000rpm,离心10min，弃上清，用4℃遇冷的PBS洗涤细胞3次后重悬均匀，调整细胞浓度约为10⁵-10⁶个/ml。

取2个上样管，每管加入500ul的单细胞悬液，离心后1号管标为标准对照，2号各加入2μlFITC或PE标记的小鼠抗人细胞表面分子CD59、CD45、CD34、CD105抗体工作液。

室温，避光，孵育20min。

PBS洗两遍，以去除未结合的抗体，500ul的1640培养基重悬后，上流式细胞仪鉴定表面标记。

鉴定结果如图2所示，以未加抗体的实验为对照，流式细胞仪检测ADSCs表面抗原显示：扩增第3代的ADSCs CD59、CD90呈阳性表达，而HLA-DR、CD45呈阴性表达，符合干细胞的特性。

实施例3人脂肪干细胞向成纤维细胞的诱导分化及鉴定

取实施例1制得的第三代～第五代的ADSCs，吸出培养基后，加入0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA的消化液进行消化，之后用适量血清终止消化。

1200rpm离心5min，脂肪干细胞完全培养基重悬，调整密度为1x10⁴/ml，接种于6孔板中，每孔2ml。

当细胞达到40％-50％融合时，应用表1所示培养基，同样环境下诱导培养，每2天更换诱导培养基，培养7～10天后，取部分细胞检测相关指标，其余细胞用成纤维细胞完全培养基继续培养、传代，每2天更换完全培养基一次。

表1脂肪干细胞成表皮细胞诱导分化实验设计

实施例4人脂肪干细胞向表皮细胞的诱导分化效果

培养后以倒置显微镜观察细胞形态结果如图3所示，ADSCs诱导分化10天后，细胞形态无明显变化，细胞仍呈梭形及旋涡状生长。这是因为成纤维细胞形态与脂肪干细胞的形态十分相近。

实施例5Real-time PCR检测CK10及CK19表达情况

采用Real-time PCR检测CK10及CK19表达情况，

1、细胞总RNA抽提

将实施例2中对照组及实验组的细胞利用胰酶消化后，离心收集细胞沉淀，加入500μL硕盟TRIzol试剂，在室温下放置5min使其充分裂解；向裂解液中加入100μL氯仿，漩涡振荡器震荡，使溶液充分混匀，室温静置3min；4℃，10000rpm离心15min；离心后取出离心管，样品分为三层，小心将上层清水相吸至新的EP管中；向上清水相中加入等体积的异丙醇，漩涡振荡器震荡混匀，室温静置5min,4℃，10000rpm离心15min；倒掉上清，缓慢加入1mL 75％的预冷乙醇，轻轻混匀洗涤沉淀；用枪头小心吸去液体，加入50μL的DEPC水后漩涡振荡器混匀，充分溶解RNA沉淀；取RNA样品2μL，利用核酸蛋白分析仪器测定样品的浓度。

2、细胞cDNA获取

利用TAKARA公司的Prime Script^TM RT reagent Kit逆转录试剂盒在较短时间内高效合成Real Time PCR用cDNA，具体步骤如下：

按照表2组分配制RT反应液(反应液配制必须在冰上进行)。

表2反应液

试剂>使用量>终浓度>5*Prime Script Buffer(for Real Time)>2μL>1*>Prime Script RT Enzyme>0.5μL> >Oligo dT Primer(50μM)>0.5μL>25pmol>Random 6mers(100μM)>0.5μL>50pmol>Total RNA> > >RNase Free dH₂O>up to 10μL> >

将反应液分装到PCR管中，放入PCR仪中，按下列条件进行逆转录反应反转录反应条件如表3

表3反转录条件

循环步骤>温度>时间>反转录反应>37℃>15min>反转录酶的失活反应>85℃>5sec> >4℃>保持>

将逆转录后得到的cDNA稀释，每10μL体系中加入65μLDEPC水放于4℃保存备用。

3、Real-time PCR检测因子表达 

采用Real-time PCR和免疫荧光法检测I型胶原表达情况，其中：因子Real-time PCR特异性引物序列由网站NCBI提供，由上海生物工程有限公司合成。GAPDH、I型胶原Real-time PCR特异性引物如表4：

表4Real-time PCR特异性引物 

基因>Primer F(上游引物)>Primer R(下游引物)>GAPDH>5’-GTCATTGAGAGCAATGCCAG-3’>5’-GTGTTCCTACCCCCAATGTG-3’>I型胶原>5’-CTGGTACGGCGAGAGCAT-3’>5’-CAGGCTCCGGTGTGACTC-3’>

得到引物后进行短暂离心，根据离心管上的要求加入一定量的DEPC水溶解引物并将其稀释成10μM储存于-20℃备用。

以反转录后的cDNA作为模板，采用BIO-RAD公司的SsoFast^TM EvaGreen Supermix试剂盒进行实时荧光定量PCR扩增炎症因子，具体步骤如下：

(1)按照下列组分配制Real-timePCR反应液

表5Real-timePCR反应液

试剂>使用量>终浓度>SsoFast EvaGreen supermix>5μL>1*>Forward primer>0.5μL>300-500nM>Reverse primer>0.5μL>300-500nM>DNA template>4μL> >Total volume>10μL> >

将反应液混匀后加入96孔Real-time PCR板中，每孔10μL，设为4个复孔。将反应板放入BIO-RAD CFX96^TMReal-time system仪器中，按照下列反应条件进行Real-time PCR，最后根据根据得到的C_(t)值，以诱导前细胞中基因的表达量为参照，计算诱导后细胞中目的基因相对于诱导前的表达量：

表6Real-time PCR程序

检测结果如表7所示：

对Real-timePCR检测结果如表7所示：

表7检测结果

 >I型胶原相对表达量>诱导前>1>实验组>124**>对照组1>1.1>对照组2>78**>对照组3>57**>

注，**示存在显著性差异(p<0.01)

ADSCs向成纤维细胞诱导分化10天后，抽取细胞RNA并反转录成cDNA后利用荧光定量PCR仪检测I型胶原的表达情况，和诱导前相比较，对照组1的I型胶原的表达量无明显变化；对照组2的I型胶原表达量升高78倍；对照组3的I型胶原表达量升高57倍；实验组的表达量升高124倍，说明脂 肪干细胞已向成纤维细胞分化，而且实验组明显比对照组1、对照组2和对照3的诱导分化速度快。

实施例6免疫荧光染色检测诱导分化后细胞表面的CK19的表达

以免疫荧光法检测CK19表达从而鉴定细胞分化效果。具体方法为：

将实施例2中对照组及实验组的细胞悬液接种到6孔板中培养至50-60％融合，PBS洗涤3次，每次5min。

4％的多聚甲醛室温固定10min，PBS洗涤3遍，每次5min。

用0.2％TritonX-100对细胞透化处理10min，PBS洗涤3遍，每次5min。

加10％血清，37℃孵育15min，倾去血清，PBS洗涤两遍，加入小鼠抗人CK19抗体工作液50ul，室温孵育1h，阴性对照用PBS代替抗体。

PBS洗涤3次，每次5min，滴加荧光标记的二抗工作液37℃孵育30min，PBS洗涤3次，每次5min。

加入0.5ug/mlDAPI染色10min，PBS洗涤3次，每次5min。

50％甘油封片，在荧光显微镜下观察实验结果并拍照。结果如图4所示：免疫荧光染色检测诱导分化后细胞I型胶原的表达情况如图4所示：ADSCs向成纤维细胞诱导分化10天后，利用免疫荧光染色法检测I型胶原的表达情况，发现对照组1免疫荧光染色呈阴性，对照组2、对照组3和实验组免疫荧光染色呈阳性，但是实验组的免疫荧光染色的细胞数要比对照组2、对照组3的细胞数量多。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。