一株能促进千年桐营养元素吸收的内生真菌

摘要

本发明涉及一株能促进千年桐营养元素吸收的内生真菌。所述内生真菌为盾壳霉（Coniothyrium sp.）ZY5，已于2015年1月30日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏号为CGMCC No. 10465。将千年桐内生真菌ZY5接种于千年桐土培苗，接种60天后测定千年桐的氮、磷、钾元素含量。千年桐叶片真菌ZY5所处理的植株与对照的氮、磷、钾元素含量差异显著。地上部分与地下部分氮含量分别比对照提高了68.6%和110.8%；地上部分与地下部分磷含量分别比对照提高了86.1%和230.1%；地上部分与地下部分钾含量分别比对照提高了25.6%和20.8%。表明其有利于千年桐对营养元素的吸收。

说明书

      技术领域    

本发明涉及一株能促进千年桐营养元素吸收的内生真菌。

背景技术

植物内生菌的研究始于19世纪末，Vogl从黑麦草Lolium temulentum L.种子中分离出第一株内生菌。但真正开始大量研究植株中的内生菌起始于上世纪八十年代，主要是在温带地区、亚热带地区和热带地区的植被中开展研究。

植物内生真菌的分布广、种类多，前人研究表明从绝大多数植物体内都能分离得到内生真菌，由此可见内生真菌普遍存在于植物体内。在全世界范围内至少在80多个属290多种的禾本科农作物中发现了内生菌。目前从植物中分离的内生菌根据其具有的独特功能可以分为：固氮菌、固钾菌、固磷菌等植物促生菌、具有抗病虫害的生防菌和具有促进植物对不良环境的修复能力的抗性菌。查阅文献材料，有关内生真菌对千年桐生长的影响研究还存在空白。  

发明内容

本发明的目的在于提供一株能促进千年桐营养元素吸收的内生真菌，该真菌为盾壳霉（Coniothyrium sp.）ZY5，已于2015年1月30日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No. 10465。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

该菌的分离、纯化包括：

A、材料：将采集得到不同年份的根、枝茎、叶分成三个部分，用自来水清洗干净，分装到自封袋内，于4℃冰箱保存；

B、消毒：75%酒精漂洗30s→无菌水冲洗3-4次→15%的次氯酸钠漂洗（根7min，茎5min，叶3min）→无菌水冲洗4-5次。当样品最后一次浸洗后的水盛于灭菌的小烧杯中，在平板上划线作为对照，以检验样品的消毒是否彻底，若干天后如有菌落生成，则表明样品表面消毒不彻底，需继续调整消毒方法；  

C、接种部位的选择：叶片：叶尖部、叶中部和叶基部3个处理；枝茎：上中下分为3部位，其中第3部位为枝茎交接处；根部：分为根尖和根基2个部分；  

D 、接种：将消毒后的外植体用接种刀切开，铺放在培养基表面，于28℃恒温培养箱内培养5-7天后观察菌落生长状况。有的菌株繁殖迅速，可先将其产生的菌株进行分离纯化；生长缓慢且数量较少的菌株可延长观察时间，直到其生长稳定后纯化；  

固体培养：使用改良马丁固体培养基，配方为蛋白胨 5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、琼脂14.0g/L、其它为无菌水，pH值6.4±0.2，培养温度为28℃，培养方式为平板培养；

E、将分离繁殖出的不同种类的内生真菌接入平板培养基进行纯化，经过2-3次点接纯化、转接后得到单一菌种的上述的Coniothyrium功能菌株；

上述的一种能促进千年桐营养元素吸收的内生真菌应用菌液的制备方法，是将上述的菌株接入液体培养基，摇床振荡培养，培养温度为28℃，培养时间48～72h，利用血球计数板计算菌液浓度，将菌液用超纯水稀释成1.0-9.0×106cfu/ml cfu/ml即为成品备用；液体培养基：为改良马丁培养基，其中蛋白胨 5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、其它为无菌水、pH值6.4±0.2。

上述的一种能促进千年桐营养元素吸收的内生真菌应用菌液的应用方法，是应用该菌株的菌液浇施于苗木根际土壤。

上述的一种能促进千年桐营养元素吸收的内生真菌应用菌液的应用方法，是用5.5×106cfu/ml菌液，按每株100ml在林地浇于每株千年桐的根际。

本发明涉及的菌株是从千年桐植株中分离纯化得到的，经接种于千年桐土培苗，根据各项指标综合评判，进一步证实其对植株生长具有促进千年桐营养元素吸收的作用，寻找到对促进植株营养元素吸收的有益的功能内生真菌可应用于生产。

通过菌液浇施的方法接种于千年桐幼苗，接种60天后测定千年桐的氮、磷、钾元素含量。千年桐叶片真菌ZY5所处理的植株与对照的氮、磷、钾元素含量差异显著。地上部分与地下部分氮含量分别比对照提高了68.6%和110.8%；地上部分与地下部分磷含量分别比对照提高了86.1%和230.1%；地上部分与地下部分钾含量分别比对照提高了25.6%和20.8%。表明其有利于千年桐对营养元素的吸收。

附图说明

图1为不同处理对千年桐幼苗氮含量的影响。

图2为不同处理对千年桐幼苗磷含量的影响。

图3为不同处理对千年桐幼苗钾含量的影响。

具体实施方式

根际土壤浇施与苗木直接接种应用

试验材料为千年桐幼苗为建阳市林业局提供的千年桐一年生苗。本试验采用土培盆栽试验，选择长势一致的苗木于2014年5月定植于直径15cm，高10cm的塑料盆中。每盆放入相等质量的3kg黄心土，为了保证后期苗木接菌的准确性，往每盆土壤中滴入10~15滴甲醛(福尔马林)消毒液，并用塑料薄膜封盖盆口，消毒时间为24h。待土壤内甲醛渗透消毒完全，除去塑料薄膜，将剩余的甲醛蒸发，以免影响幼苗的移植成活率。将苗木植入，经过一个月的恢复性生长，在千年桐幼苗根际施入菌株浓度为5.5×106cfu/ml的菌液100ml，连续三天浇施，用蒸馏水溶液处理作为空白对照。

菌液制备：将供试菌株接入50mL的液体培养基，培养基为改良马丁培养基，其中蛋白胨 5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、其它为无菌水、pH值6.4±0.2，在恒温振荡培养箱中经过72h的培养。用无菌生理盐水按十倍稀释法将菌液稀释，利用血球计数板计算菌液浓度配制成5.5×106cfu/ml。接种60天后进行氮、磷、钾含量等指标的测定，检测方法如下：

将烘干至恒重的植物器官样品用小型粉碎机全部粉碎成粉末，参考中华人民共和国林业行业标准《森林土壤分析方法》，采用HNO₃-HClO₄消煮，供氮、磷、钾元素的测定。

1）植株氮含量采用凯氏定氮法测定进行测定，每个样品做三个重复。

计算公式：

        

式中：WN为氮含量，g/kg；V为测定样品用去盐酸标准溶液体积，mL；V0为滴定试剂空白试验用去盐酸标准溶液体积，mL；c为盐酸标准溶液的浓度，mol/L；0.014为氮原子的摩尔质量，g/mmol；m为烘干样品质量，g。

2）植株磷含量采用钼锑抗比色法进行测定，每个样品做三个重复。

计算公式：

        

式中：WP为磷含量，g/kg；c为从工作曲线上查得显色液磷（P）的浓度，μg/mL；

V为显色液体积，50mL；m为烘干样品质量，g；ts为分取倍数。

3）植株钾含量采用原子吸收分光光度法测定，每个样品做三个重复。

计算公式：

        

式中：WK为磷含量，g/kg；c为从工作曲线上查得显色液钾（K）的浓度，μg/mL；

V为显色液体积，50mL；m为烘干样品质量，g；ts为分取倍数。

注：本试验中提到的地上部分为地面以上的主要是茎和叶；地下部分为地面以下的主要是根系。

结果与分析

试验通过菌液浇施的方法接种于千年桐幼苗，接种60天后测定千年桐的氮、磷、钾元素含量。

氮含量结果显示如图1所示，单因素方法分析显示，菌株ZY5处理后的千年桐幼苗地上部分氮含量与对照相比达到显著水平（sig=0.007，显著水平为0.05），菌株ZY5为对照组的1.69倍；菌株ZY5处理后的千年桐幼苗地下部分氮含量与对照相比达到显著水平（sig=0.001，显著水平为0.05），菌株ZY5为对照组的2.11倍。

磷含量结果显示如图2所示，单因素方法分析显示，菌株ZY5处理后的千年桐幼苗地上部分磷含量与对照相比达到显著水平（sig=0.005，显著水平为0.05），菌株ZY5为对照组的1.86倍；菌株ZY5处理后的千年桐幼苗地下部分磷含量与对照相比达到显著水平（sig=0.000，显著水平为0.05），菌株ZY5为对照组的3.30倍。

钾含量结果显示如图3所示，单因素方法分析显示，菌株ZY5处理后的千年桐幼苗地上部分钾含量与对照相比达到显著水平（sig=0.017，显著水平为0.05），菌株ZY5为对照组的1.26倍；菌株ZY5处理后的千年桐幼苗地下部分钾含量与对照相比达到显著水平（sig=0.030，显著水平为0.05），菌株ZY5为对照组的1.21倍。

综上所述，千年桐叶片真菌ZY5所处理的植株与对照的氮、磷、钾元素含量差异显著。地上部分与地下部分氮含量分别比对照提高了68.6%和110.8%；地上部分与地下部分磷含量分别比对照提高了86.1%和230.1%；地上部分与地下部分钾含量分别比对照提高了25.6%和20.8%。

本发明发现一株能促进千年桐营养元素吸收的内生真菌，将该株千年桐内生真菌菌株采用浇根的方法接种于千年桐幼苗。通过接种60天后植株的氮、磷、钾元素含量测定，得出接种该菌株的处理氮、磷、钾磷含量均较大程度高于对照，表明其对于促进植株氮、磷、钾的吸收具有很大功用，从而进一步证实得到该株内生真菌能促进千年桐对营养元素的吸收。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。